表面修飾證明

第三章實驗結果與討論

3.2.1 表面修飾證明

實驗中，以 APTMS 和 MBS 這兩種化學鍵結分子將 DA-specific aptamer 固定於矽晶片表面。我們以觀察螢光影像證明表面修飾方法是否成功。結果如圖

3- 7 所示，在二氧化矽基板/矽基底上修飾 FITC-aptamer 的區域觀察到螢光，而

未修飾有 FITC-aptamer 的區域則無螢光產生，證明此修飾方法可成功將 DA-specific aptamer 固定於矽晶片上。因為矽晶片表面與 SiNW 表面皆為二氧化矽，可間接證明此修飾方法可成功將 DA-specific aptamer 固定於 SiNW 表面。

圖 3- 7 二氧化矽基板/矽基底表面修飾 FITC-aptamer 之螢光影像圖。 (A)空白二 氧化矽基板/ 矽基底之螢光影像。 (B) 在二氧化矽基板 / 矽基底上修飾 FITC-aptamer 後之螢光影像。比例尺為 100 μM。

3.2.2 多巴胺與其他分子之偵測 μM 的 ascorbic acid (AA)、catechol (CT)、phenethylamine (PEA) 以及 tyrosine (TR) 幾乎沒有造成 Isd-Vg 曲線的偏移，而濃度為10 nM 的 epinephrine (EP) (pI 示 DA-specific aptamer/SiNW-FET，藍色表示 PTMS-modified SiNW-FET，雖然與 DA 同屬於兒茶酚胺類的 EP 與 NE 所造成的 ∆V 分別為 25 ± 4% 與 50 ± 5%，但即使將其他四種不屬於兒茶酚胺類的分子之濃度提高為 DA 的 100 倍，其所造成的 ∆V 皆低於 10%。

圖 3- 8 以 DA-specific aptamer/SiNW-FET 與 PTMS-modified SiNW-FET 量測 DA 等分子之實驗結果。 (A) 以 DA-specific aptamer/SiNW-FET 進行量測之 Isd-Vg 曲線。 (B) 以 PTMS-modified SiNW-FET (without aptamer modification) 進行量測之 Isd-Vg 曲線，量測的樣品有 0.1x PBS、1 μM ascorbic acid (AA)、1 μM phenethylamine (PEA)、1 μM tyrosine (TR)、10 nM epinephrine (EP)、10 nM dopamine (DA) 與 10 nM norepinephrine (NE)。 (C) 相對 ∆V 對不同的分子之作圖 (以 DA 的 ∆V 為 100%)，error bar 為三次實驗結果的標準差。

由於 EP 與 NE 也對 DA-specific aptamer/SiNW-FET 造成不可忽略的訊號改變，我們進一步量測不同濃度的 DA、EP 以及 NE，並將實驗數據以最小平方法擬合到朗謬耳吸附方程式，計算出 DA-specific aptamer 與這三種分子的解離常數 (Kd)，探討 DA-specific aptamer 與它們之間的親和力。量測的濃度範圍為 10^-13 到 10^-7 M，圖 3- 9 (A) 是以 DA-specific aptemr/SiNW FET 量測不同濃度的 DA 之 Isd-Vg 曲線，接著將數據換算為 ∆V ，得到圖 3- 9 (B) DA 的濃 度 C 與 ∆V /∆V ^, 之關係圖，可以觀察到當 DA 大於某個濃度後，由於矽奈米線上面所有的 aptamer 的結合區域皆被 DA 所佔據，∆V 達到飽和，

即為 ∆V ^, 。如圖 3- 9 (B) 中的插圖 (C 對 C /∆V 作圖) 所示，我們接 著以最小平方法將數據擬合到朗謬耳吸附方程式，計算出 aptamer-DA 複合物的解離常數為 120 ± 10 pM。除此之外，DA-specific aptamer/SiNW-FET 偵測 DA 的線性工作範圍為 10^-11 到 10^-8 M (圖 3- 10)。圖 3- 11 為即時偵測 10 pM DA 之電訊號變化圖，其電導改變量大約為 100 nS 且訊雜比大於 5。以相同的方法求出 aptamer-EP 複合物與 aptamer-NE 複合物之解離常數，分別為 6.03 ± 1.85 nM 與 910 ± 270 pM (圖 3- 12 (A) 與 (B))。由於 aptamer-DA 複合物的解離常數 是三者之中最小的，顯示 DA-specific aptamer 對 DA 有較好的結合親和力，其對DA 的親和力大約是 EP 的 50 倍以及 NE 的 8 倍。

由於 DA-specific aptamer 對於 DA 有較高的結合親和力，我們可以將 DA-specific aptamer/SiNW-FET 實際應用在即時偵測細胞釋放 DA 與臨床診斷上。

圖 3- 9 以 DA-specific aptamer/SiNW-FET 量測不同濃度的多巴胺 (DA) 之實驗 結果。 (A) 不同濃度的 DA (C = 0 - 100 nM) 之 Isd-Vg 曲線，右上方的插圖為局部放大圖 (B) C 和 ∆V /∆V ^, 之關係圖，插圖為朗謬耳吸附方程式擬合曲線，aptamer-DA 複合物之 Kd=120 ± 10 pM。

圖 3- 10 CDA 和

ΔV

_g^cal

/V

_g^cal,^max 之半對數圖。以 DA-specific aptamer/SiNW-FET 偵測 DA 之線性工作範圍為 10^-11 到 10^-8 M。

圖 3- 11 以 DA-specific aptamer/SiNW-FET 即時偵測 10 pM DA 之電訊號變化 圖。

圖 3- 12 以 DA-specific aptamer/SiNW-FET 量測不同濃度的腎上腺素 (EP) 與正 腎上腺素 (NE) 之實驗結果 (A) C 和 ∆V /∆V ^, 之關係圖，插圖為朗謬耳吸附方程式擬合曲線，aptamer-EP 複合物之 Kd = 6.03 ± 1.85 nM。(B) C 和

∆V /∆V ^, 之關係圖，插圖為朗謬耳吸附方程式擬合曲線，aptamer-NE 複合物之 Kd = 910 ± 270 pM。

3.2.3 偵測缺氧刺激下的 PC12 細胞釋放之多巴胺 驗，在沒有 PC12 細胞之 DA-specific aptamer/SiNW-FET 晶片上，將緩衝溶液置換為70% C reduced buffer 後，並未觀察到電導的改變 (圖 3- 13 上方之插 缺氧刺激，才足以引起細胞膜電位去極化 (membrane potential depolarization)，去

極化後，電壓門控鈣通道 (voltage-gated Ca²⁺ channel) 會被活化，使細胞外鈣離子可經由鈣通道流入細胞內，細胞內鈣離子濃度的上升引發 PC12 細胞釋放出 DA；而施加弱缺氧刺激 (如 35% C reduced buffer) 時，並未偵測到 DA，推測弱缺氧刺激不足以引起細胞膜電位去極化。除此之外，在加入 Cd²⁺ 離子作為鈣離子通道阻斷劑後，對細胞進行缺氧刺激，並未偵測到 DA，此實驗結果證明以缺氧刺激使 PC12 細胞釋放多巴胺的機制中，細胞內鈣離子的上升主要是細胞外的鈣離子經由鈣離子通道運送到細胞內而所導致的。

圖 3- 13 以 DA-specific aptamer/SiNW-FET 即時偵測缺氧刺激下的 PC12 細胞 釋放 DA 之電訊號變化圖。下方之插圖為 PC12 細胞培養於 DA-specific aptamer/SiNW-FET 上的光學顯微鏡影像。紅色線為以 70% C reduced buffer 刺激 PC12 細胞釋放 DA 之電訊號變化圖。上方之插圖為控制組實驗，在未培養 PC12 細胞的 DA-specific aptamer/SiNW-FET 上，置換 70% C reduced buffer。箭頭指向的位置表示加入 70% C reduced buffer 之時間點。

圖 3- 14 以 DA-specific aptamer/SiNW-FET 即時偵測不同缺氧刺激下的 PC12 細胞釋放 DA 之電訊號變化圖。上方的線段為加入 35% C reduced buffer 進行刺激，中間的線段為加入 70% C reduced buffer，下方的線段為加入含有 1 mM CdI2之 70% C reduced buffer。

3.3 利用修飾去氧核醣核酸適體之矽奈米線場效應電晶體偵測神經肽 Y

3.3.1 表面修飾證明

實驗中，以 MPTMS 和 MBS 這兩種化學鍵結分子將 NPY-specific aptamer 固定於矽晶片表面。我們以觀察螢光影像證明表面修飾方法是否成功。結果如圖

3- 15 所示，在二氧化矽基板/矽基底上修飾有 FITC-aptamer 的區域觀察到螢光，

而未修飾有 FITC-aptamer 的區域則無螢光產生，證明此修飾方法可成功將 NPY-specific aptamer 固定於矽晶片上。因為矽晶片與 SiNW 表面皆為二氧化矽，

故可間接證明此修飾方法可成功將 NPY-specific aptamer 固定於 SiNW 表面。

圖 3- 15 在二氧化矽基板/矽基底上修飾 FITC-aptamer 後之螢光影像圖。

3.3.2 神經肽 Y 與其他分子之偵測

我們分別以 PTMS-modified SiNW-FET 與 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 量測 1 μM NPY 和 100 μM DA，測試 NPY-specific aptamer 對 NPY 的選擇性。

以 PTMS-modified SiNW-FET 偵測 NPY 與 DA，實驗結果如圖 3- 16 (A) 所示，不論是 1 μM NPY 或 100 μM DA 皆沒有使 Isd-Vg 曲線產生明顯的偏移。

圖 3- 16 (B) 為以 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 進行量測之實驗結果，以 0.1x PBS 的 Isd-Vg 曲線為基準，1 μM NPY 造成 Isd-Vg 曲線有顯著地向下偏移，

而 100 μM DA 則未使 Isd-Vg 曲線有明顯的偏移。1 μM NPY 造成 Isd-Vg 曲線向下偏移的原因是因為在 pH = 7.2 的緩衝溶液環境中，NPY (pI=9.2) 帶有正電荷，當它與 NPY-specific aptamer 結合時，靠近矽奈米線表面，由於其所造成的電場，使 p 型 SiNW 內部的電洞載子減少，電流因此下降 (Isd-Vg 曲線向下偏移)。

我們進一步將電流變化量 (∆I I I ) 轉換成 Vg 變化量 (稱為 calibrated response，以 ∆V 表示)。將圖 3- 16 (A) 和 (B) 的實驗數據換算為

∆V 後，以圖 3- 16 (C) 表示，其 Y 軸為相對的 ∆V (以 NPY 的 ∆V 為 100%)，X 軸為所偵測的分子，以藍色表示 PTMS-modified SiNW-FET，紅色表示 NPY-specific aptamer/SiNW-FET。當矽奈米線表面修飾 PTMS 時，1 μM NPY 和 100 μM DA 皆沒有明顯地訊號改變，表示 PTMS-modified SiNW 與這兩種分子之間沒有太大的交互作用。當矽奈米線修飾有 NPY-specific aptamer 時，相較於 1 μM NPY 的訊號變化量，100 μM DA 所造成的訊號變化量約是 10%。

顯示相較於 DA，NPY-specific aptamer 確實對 NPY 有著更好的結合親和力。

圖 3- 16 以 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 與 PTMS-modified SiNW-FET 量測 NPY 等分子之實驗結果。(A) 以 PTMS-modified SiNW-FET 進行量測之 Isd-Vg

曲線 (B) 以 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 進行量測之 Isd-Vg 曲線，量測的樣品有 0.1x PBS、1 μM NPY 和 100 μM DA。(C)相對 ∆V 對不同的分子之作圖 (以 NPY 的 ∆V 為 100%)，error bar 為三次實驗結果的標準差。

接下來，我們量測不同濃度的 NPY，並將實驗數據以最小平方法擬合到朗謬耳吸附方程式，計算出 NPY-specific aptamer 與 NPY 的解離常數 (Kd)，探討 aptamer 與 NPY 之間的結合親和力。量測的濃度範圍為 10^-9 到 10^-5 M，圖 3-

17 (A) 是以 NPY-specific aptemr/SiNW FET 量測不同濃度的 NPY 之 I

sd-Vg 曲線，接著將數據換算為 ∆V ，得到圖 3- 17 (B) NPY 的濃度 C 與 ∆V /

∆V ^, 之關係圖，可以觀察到當 NPY 大於某個濃度後，由於矽奈米線上面所有的 aptamer 的結合區域皆被 NPY 所佔據，∆V 達到飽和，即為 ∆V ^, 。 如圖 3- 17 (B) 中的插圖 (C 對 C /∆V 作圖) 所示，我們接著以最小平方法將數據擬合到朗謬耳吸附方程式，計算出 aptamer-NPY 複合物的解離常數為 260 nM。我們以另外三個不同的 NPY-specific aptemr/SiNW FET 裝置重複量測不同濃度的 NPY，實驗結果如圖 3- 18、圖 3- 19 以及圖 3- 20 所示，以最小平方法分別將三次數據擬合到朗謬耳吸附方程式，計算出 aptamer-NPY 複合物的解離常數分別為330 nM、320 nM 和 290 nM。四次實驗結果得到 aptamer-NPY 複合物的解離常數是300 ± 32 nM (表 3- 1)，而文獻中以親和力毛細管電泳所量測 到的aptamer-NPY 複合物的解離常數為 300 ± 200 nM[50]，我們的實驗結果與文獻值十分接近。

由 C 和 ∆V /∆V ^, 之半對數圖 (圖 3- 21) 可知，NPY-specific aptamer/SiNW-FET 偵測 NPY 的線性工作範圍為 10^-7 到 10^-5 M 且其偵測極限為 24 nM。

根據上述結果，可證明以 NPY-specific aptemr/SiNW FET 偵測 NPY 的實驗具有再現性。

圖 3- 17 以 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 量測不同濃度的 NPY 之實驗結果 (Device 1)。(A)不同濃度的 NPY (C = 0 - 10 μM) 之 Isd-Vg 曲線，右上方的插圖為局部放大圖 (B) C 和∆V /∆V ^, 之關係圖，插圖為朗謬耳吸附方程式擬合曲線，aptamer-NPY 複合物之 Kd = 260 ± 65 nM。

圖 3- 18 以 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 量測不同濃度的 NPY 之實驗結果 (Device 2)。(A) 不同濃度的 NPY (C = 0 - 10 μM) 之 Isd-Vg 曲線。(B) 為 (A)

合曲線，aptamer-NPY 複合物之 Kd = 330 ± 110 nM。

圖 3- 19 以 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 量測不同濃度的 NPY 之實驗結果 (Device 3)。(A) 不同濃度的 NPY (C = 0 - 10 μM) 之 Isd-Vg 曲線。(B) 為 (A) 的局部放大圖 (C) C 和∆V /∆V ^, 之關係圖。(D) 為朗謬耳吸附方程式擬合曲線，aptamer-NPY 複合物之 Kd = 320 ± 110 nM。

圖 3- 20 以 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 量測不同濃度的 NPY 之實驗結果 (Device 4)。(A) 不同濃度的 NPY (C = 0 - 10 μM) 之 Isd-Vg 曲線。(B) 為 (A) 的局部放大圖 (C) C 和∆V /∆V ^, 之關係圖。(D) 為朗謬耳吸附方程式擬合曲線，aptamer-NPY 複合物之 Kd = 290 ± 85 nM。

The dissociation constant (K

) of the aptamer-NPY complex:

(in 0.1x PBS)

Device 1 260 ± 65 nM

Device 2 330 ± 110 nM

Device 3 320 ± 110 nM

Device 4 290 ± 85 nM

平均 300 ± 32 nM

表 3- 1 aptamer-NPY 複合物之解離常數。

圖 3- 21 CNPY 和

ΔV

_g^cal

/V

_g^cal,^max之半對數圖。以 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 偵測 NPY 之線性工作範圍為 10^-7 到 10^-5 M，偵測極限為 24 nM。

3.3.3 偵測缺氧刺激下的 PC12 細胞釋放之神經肽 Y

我們進一步將 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 應用於細胞研究上，實驗中，

以 Isd-t 量測系統即時偵測經缺氧刺激後的 PC12 細胞所釋放之 NPY。

首先，我們進行了控制組實驗，在沒有培養 PC12 細胞之 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 晶片上將緩衝溶液置換為 70% C reduced buffer 後，並未觀察到電導的改變 (圖 3- 22 (A))。接著，進行 PC12 細胞釋放 NPY 之實驗時，

PC12 細胞直接培養於 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 晶片上，開始即時偵測電訊號的變化，將緩衝溶液置換為 70% C reduced buffer 後，PC12 細胞受到

圖 3- 22 以 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 即時偵測缺氧刺激下的 PC12 細胞 釋放 NPY 之電訊號變化圖。(A) 為控制組實驗，在未培養 PC12 細胞的 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 上，置換 70% C reduced buffer。(B)以 70%

C reduced buffer 刺激 PC12 細胞釋放 NPY 之電訊號變化圖。箭頭指向的位置表示加入 70% C reduced buffer 之時間點。

圖 3- 23 以 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 即時偵測不同缺氧刺激下的 PC12 細胞釋放 NPY 之電訊號變化圖。上方的線段為加入 35% C reduced buffer 進行刺激，中間的線段為加入 55% C reduced buffer 進行刺激，下方的線段為

在文檔中利用超靈敏矽奈米線場效應電晶體偵測活細胞釋放之神經傳導物 (頁 66-110)

第三章 實驗結果與討論