利用修飾去氧核醣核酸適體之矽奈米線場效應電晶體偵測神經肽 Y

2.3.1 矽奈米線表面修飾

我們從文獻中挑選出一個可選擇性與 NPY 結合的 NPY-specific aptamer 作為受體，為了將 NPY-specific aptamer 固定於矽奈米線表面，我們會在 bare SiNW-FET 晶片上進行三個修飾步驟。如圖 2- 12 所示，第一步是在矽奈米表面 上修飾 3-mercaptopropyl trimethoxysilane (MPTMS, Sigma-Aldrich) 與 propyl trimethoxysilane (PTMS, Sigma-Aldrich) 這兩種化學鍵結分子，MPTMS 的兩端 具有不同的官能基，一端為甲氧基 (-OCH3)，另一端為硫醇基 (-SH)，而 PTMS 的兩端則分別為甲氧基與甲基 (-CH3)，MPTMS 和 PTMS 的甲氧基會與矽奈米 線表面的矽醇基 (Si-OH) 反應產生鍵結，形成自組裝單分子膜，此時矽奈米線 表面含有硫醇基，可作為受體與矽奈米線表面的連結。加入 PTMS 的目的是為 了調整矽奈米線表面的 MPTMS 密度，以避免後續修飾到矽奈米線上的受體與 受體之間的立體阻礙 (steric hindrance)，彼此可能會因為交纏在一起，而無法折 疊成正常的形狀，進而影響偵測靈敏度。第二步是修飾 3-maleimidobenzoic acid N-hydroxy succinimide ester (MBS, Sigma-Aldrich)，MBS 的 maleimide group 會 與 MPTMS 的硫醇基反應形成共價鍵。最後一步是將 NPY-specific aptamer 修 飾於矽奈米線表面，所購買的是 5’端修飾有一級胺基的 NPY-specific aptamer (NH2-aptamer, 生工有限公司)，NPY-specific aptamer 的一級胺基與 MBS 反應後 形成醯胺鍵，藉此使 NPY-specific aptamer 固定於矽奈米線表面。

圖 2- 12 NPY-specific aptamer 固定化之流程圖。

1. 修飾 MPTMS 與 PTMS

將製作好的 bare SiNW-FET 晶片依序以丙酮-異丙醇-去離子水沖洗並以氮 氣吹乾，將晶片浸泡於含有 0.2 vol % MPTMS 與 0.8 vol % PTMS 之 99.5% 乙 醇溶液中，反應 15 min 後，以加熱板 110 ℃ 烘烤 10 min。加熱是為了使 MPTMS 和 PTMS 形成良好的自組裝單分子膜。

2. 修飾 MBS

將已修飾 MPTMS 與 PTMS 之 SiNW-FET 晶片浸泡於 1 mM MBS 溶液 (溶於 1:9 (v/v)的 DMSO 和 1x PBS) 中，30 min 後，以去離子水沖洗晶片表面，

再以氮氣吹乾。

3. 修飾 NPY-specific aptamer

配製含有 1 μM NPY-specific aptamer 之 1x PBS 溶液，將已修飾 MBS 之 晶片浸泡於此溶液中，反應 2 hr 後，以去離子水沖洗晶片表面，再以氮氣吹乾。

我們另外購買 3’端修飾有 fluorescein isothiocyanate (FITC) 的 aptamer，簡 稱為 FITC-aptamer，利用螢光影像來證明此修飾方法是否能成功將 NPY-specific aptamer 固定在 SiO2/Si 基板上。FITC 是一種螢光基團，其最大吸收波長為 495 nm，最大放光波長為 520 nm。

2.3.2 神經肽 Y 與其他分子之偵測

此實驗分為三個部分，第一個部分是以 PTMS-modified SiNW-FET 偵測神 經肽 Y (NPY) 與多巴胺 (DA) ，作為控制組實驗。第二個部分是以修飾 NPY-specific aptamer 之 SiNW-FET 偵測上述兩種分子，探討這兩種分子與 NPY-specific aptamer 之間的結合親和力 (binding affinity)。

實驗時，我們將欲偵測的分子以 0.1 倍磷酸鹽緩衝溶液 (0.1x phosphate buffer saline， 0.1x PBS，含有 13.7 mM NaCl、 270 μM KCl、1 mM Na2HPO4

與 200 μM KH2PO4，pH 7.2) 稀釋配製成所要的濃度，吸取所調配之樣品溶液 100 μL 滴在晶片上，利用 2.1.4 元件電性量測節所述之 Isd-Vg 量測系統進行 偵測，掃描並記錄 Isd-Vg 曲線。鎖相放大器的參數設定為 Vsd = 10 mV、

modulation frequency = 79 Hz、time constant = 100 ms，閘極電壓 Vg 掃描範圍為 200 mV 到 -200 mV。實驗完成後，處理數據並利用 Langmuir adsorption isotherm model 求出解離常數。

樣品溶液準備：

將欲偵測的分子溶解於 0.1x PBS (pH 7.2)，並以稀釋的方式配製不同濃度的 樣品溶液。所配製的 NPY 濃度為 1 nM、3 nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM、1 μM、3 μM 以及 10 μM； DA 濃度為 100 μM。

2.3.3 偵測缺氧刺激下的 PC12 細胞釋放之神經肽 Y

我們將 PC12 細胞培養在 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 晶片上，使用 I-t 量測系統即時偵測 PC12 細胞在缺氧環境的刺激下，其釋放 NPY 所造成的 電訊號變化。此實驗分為兩個部分，第一個部分為控制組實驗，在未培養 PC12 細胞的 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 上，置換 70% 缺氧緩衝溶液 (C reduced buffer)，觀察是否產生訊號變化。第二個部分，是將 PC12 細胞培養於 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 晶片上，分別以 35%、55% 和 70% 缺氧緩衝 溶液刺激 PC12 細胞，量測其釋放出的 NPY 所造成之電訊號變化，並進一步 分析 NPY 濃度。

PC12 細胞株培養：

PC12 細胞株源自大鼠腎上腺髓質 (rat adrenal medulla) 的嗜鉻細胞瘤 (pheochromocytoma)，培養在 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (含有 10% 馬 血清與5% 胎牛血清) 37℃，含有 10% CO 之大氣中，每兩天更換一次培養液。

要進行細胞實驗的當天，加入不含鈣離子與鎂離子的生理緩衝溶液使細胞懸浮於 培養液中，以離心機使細胞沉降，倒出上清液，加入適量的培養液，調整適當的 細胞密度，將含有 PC12 細胞的培養液加至 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 晶 片上的感測溶液槽中，在 37℃ 下，靜置 2 小時，使細胞沉降在晶片上。進行