國立宜蘭大學園藝學系研究所 碩士論文 Department of Horticulture National Ilan University Master Thesis

全文

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國立宜蘭大學園藝學系研究所 碩士論文

Department of Horticulture National Ilan University

Master Thesis

曲足蘭和妖精蘭×瓢唇蘭組培苗之根球再生現象

In Vitro Formation of Protocorm like Bodies from Root of Cyrtopodium paranaense and Mormodes Jumbo Odin × Catasetum

expensum (Orchidaceae)

指導教授:高建元博士

Chien-Yuan Kao, Ph. D.

研究生:郭瑋玲

Wei-Ling Guo

中華民國九十七年七月

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致謝 致謝 致謝 致謝

首先要感謝我的指導教授高建元老師,讓我在組織培養、分子生物上 學習到專業的知識與技術,最重要的是讓我學習到對自己負責任及了解到 自己的長處並盡情揮灑。接著要感謝的是我的實驗夥伴 Cucu,在這一段不 算簡單的實驗生活裡,個性和我互補的她,讓我學習到不少做事方法和態 度,她所給予我的幫助、叮嚀及鼓勵總讓我非常感動。

也感謝儀倩學姊、靖于學姊總是很有耐心的回答我的問題。以及感謝 實驗室可愛的學弟妹們,總是讓實驗室充滿歡笑與活力,也很認真學習、

協助我許多實驗,特別感謝國卿幫我修電腦、接任管理實驗室大小事,讓 我能專心於論文研究。與實驗室合作的業者們,讓我學習到許多相關知識 技術與了解業界的狀況,特別感謝珍寶蘭園的陳隆輝先生、忠順園藝的江 國慶先生、花揚園藝的甘宜修先生及力明儀器的張忠全先生。

也謝謝園藝碩二班全體同學及室友紋卿、讌君、宛君、小連的關懷、互相 幫助還一起完成了許多碩班的不可能任務。在我遭遇挫折與困難時能夠讓 我紓解情緒的就屬音樂了,特別感謝我的乾爸林以文老師及合唱團的各位 團員們,參加合唱團的這九年來和大家一同唱歌表演的時光非常精采和愉 快。最後,要感謝我的爸媽、大哥、二哥、弟弟及 Bryce 的支持與打氣,你 們一直是我心靈上最大的支柱。在此獻上此本論文給每位曾經關心、幫助 及指導我的人,衷心感謝。

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摘要 摘要 摘要 摘要

蘭科植物可藉由組織培養分生方式快速繁殖出與母本形質完全一樣的 苗株。很多實驗室運用這種技術來生產大量的蘭科植物幼苗,這種微體量 產技術不外乎是器官再生和體胚再生。吾人研究發現曲足蘭與妖精蘭×瓢唇 蘭在組織培養下,不需荷爾蒙就自然會在根的尖端或是中間形成類似原球 體構造的組織,再發育成為完整的植株,此種現象在曲足蘭園藝栽培上已 有記載並稱之為根球。實驗證明曲足蘭根尖經由含 IAA 和 TDZ、妖精蘭×

瓢唇蘭則以 IAA 和 BA 的培養基處理,可使根培植體較快長出根類原球體。

以不同時期的根類原球體為材料經石蠟切片後發現,早期會先在根尖端形 成球狀突出,隨著根類原球體膨大,根培植體的維管束延伸到球體之中並 支撐著尖端形成芽原基,而後根類原球體頂芽長出維管束成為植株。根類 原球體可以再誘導形成許多的 PLB 並再生成植株,而由根類原球體再生的 PLB,也是從頂芽長出維管束,這証明了根類原球體再生途徑初期有其發生 的特異性,而後期則與 PLB 相同為體胚再生途徑。

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Abstract

Orchid can be rapidly propagated by in vitro organogenesis or embryogenesis of orchid meristems. In recent years this technique has been used in many commercial laboratories to produce millions of low cost orchid plantlets throughout the world. At present study we show that aseptic flask grown plantlet of Cyrtopodium paranaese and Mormodes Jumbo Odin × Catasetum expensum can form “rootball” spontaneously at root tips and root middle parts under no influence of hormones, and then regenerate into plantlets. Excied root apice explants of Cyrtopodium paranaese were induced to from PLBs in MS medium supplemented with IAA (2 mg/l) and TDZ (0.5 mg/l ). Excied root apex explants of seedlings from Mormodes Jumbo Odin × Catasetum expensum were induced to from PLBs in MS medium supplemented with BA (0.5 mg/l ).

Histological observations confirmed that root cap were disorganized at early stage and followed by vascular strand of existing roots protruding into PLBs formation. The PLBs is further development and occupied by organized apical bud and root primordium. The rooted plantlets were the same in morphology as parental plants and established into soil.

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目錄 目錄 目錄 目錄

中文摘要... I 英文摘要...II 目錄...III 表目錄...V 圖目錄... VI

第一章 前言...1

第二章 文獻探討 ...3

2.1 曲足蘭簡介...3

2.2 妖精蘭與瓢唇蘭簡介...4

2.3 蘭花體胚再生與器官再生之研究 ...5

2.4 影響體胚形成之因素...9

2.4-1 培植體條件 ...9

2.4-2 培養基成份 ...9

第三章 材料與方法 ...11

3.1 植物材料...11

3.2 播種、生長培養基...11

3.3.蘭花組織石蠟切片製備 ...11

3.4 植物生長激素誘導根類原球體之試驗 ...12

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第四章 結果...13

4.1 蘭花之原球體體胚生長 ...13

4.2 曲足蘭之根類原球體再生 ...14

4.3 妖精蘭×瓢唇蘭之根類原球體再生 ...14

4.4 再生根類原球體之現象 ...15

4.5 植物生長激素之效果...15

4.5-1 IAA 和 TDZ 對曲足蘭誘導根類原球體之效果 ...15

4.5-2. IAA 和 BA 對妖精蘭×瓢唇蘭誘導根類原球體之效果 16 4.6 植株再生...16

第五章 討論...17

5.1 曲足蘭及妖精蘭×瓢唇蘭體胚再生 ...17

5.2 妖精蘭×瓢唇蘭及曲足蘭根類原球體再生 ...17

5.3 植物生長激素之效果...19

第六章 結論...21

第七章 參考文獻 ...22

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表目錄 表目錄 表目錄 表目錄

表 一、IAA 和 TDZ 對曲足蘭誘導根類原球體之效果 ··· 27 表 二、IAA 和 BA 對妖精蘭×瓢唇蘭誘導根類原球體之效果 ··· 28

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圖目錄 圖目錄 圖目錄 圖目錄

圖 1. A.曲足蘭 B.妖精蘭 C.瓢唇蘭 ... 29

圖 2. 蝴蝶蘭原球體胚胎再生途徑... 30

圖 3. 妖精蘭×瓢唇蘭原球體之切片... 31

圖 4. 妖精蘭×瓢唇蘭原球體之切片... 32

圖 5. 妖精蘭×瓢唇蘭原球體長根... 33

圖 6. 曲足蘭根尖之根類原球體... 34

圖 7. 曲足蘭根中間之根類原球體... 35

圖 8. 曲足蘭根類原球體生長成植株... 36

圖 9. 曲足蘭根類原球體與類原球體比較... 37

圖 10. 曲足蘭根之切片 ... 38

圖 11. 曲足蘭根類原球體誘導培養第 16 天之切片 ... 39

圖 12. 曲足蘭根類原球體誘導培養第 25 天之切片... 40

圖 13. 曲足蘭根類原球體誘導培養第 35 天之切片... 41

圖 14. 妖精蘭×瓢唇蘭根中間根類原球體之切片... 42

圖 15. 妖精蘭×瓢唇蘭根類原球體生長成植株... 43

圖 16.妖精蘭×瓢唇蘭根類原球體的根毛 ... 44

圖 17. 妖精蘭×瓢唇蘭根尖之切片... 45

圖 18. 妖精蘭×瓢唇蘭根類原球體誘導培養第 19 天之切片 ... 46

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圖 19. 妖精蘭×瓢唇蘭根類原球體誘導培養第 24 天之切片 ... 47

圖 20. 妖精蘭×瓢唇蘭根類原球體 39 天之切片... 48

圖 21. 曲足蘭刺傷根類原球體誘導出更多的類原球體 ... 49

圖 22. 妖精蘭×瓢唇蘭再生根類原球體之切片... 50

圖 23. 曲足蘭再生根類原球體之切片... 51

圖 24. 曲足蘭之根類原球體誘導 44 天... 52

圖 25. 妖精蘭×瓢唇蘭之根類原球體誘導... 53

圖 26. 妖精蘭×瓢唇蘭根類原球體再生之植株... 54

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第一章 第一章 第一章

第一章 前言 前言 前言 前言

Cyrtopodium 屬在美國南部和中美洲約有 30 個種類以曲足蘭來命

名,是一種熱帶地生蘭。而 CatasetumMormodes 都屬於蘭界裡 Catasetinae 亞科的植物,產於中南美洲高溫多濕的雨林環境裡,容易 栽培,這兩屬雖然在花型上有很大的差異,但屬之間可以相互交配,

因此變化多端很值得玩賞。這些種類有時會栽培用來美化景觀和其他 許多用途,例如 Cyrtopodium 一些種類具有生物活性多糖,可作為傷 風、結核病和血友病治療用。這些植物在一般的生長狀況下雖可透過 偽球莖的分割來繁殖,但是繁殖率非常低,因此藉由試管內繁殖技術 能幫助這些種類的蘭科植物大量繁殖。

蘭花生產技術改良源於 1922 年 Knudson 的試管內無菌發芽,自

Morel( 1960 )發現可藉由分生組織培養技術來大量的繁殖蘭科植物,

很多實驗室運用這種技術來生產世界各地數百萬低成本的蘭科植物 幼苗。然而曲足蘭、妖精蘭及瓢唇蘭這些種類卻少有體外及試管內繁 殖,以誘導體胚再生或器官再生來大量繁殖為目的的研究。

吾人研究發現曲足蘭與妖精蘭×瓢唇蘭在組織培養下,不需荷爾 蒙就自然會在根的尖端或是中間形成類似原球體構造的組織,再發育 成為完整的植株,此種現象在曲足蘭園藝栽培上已有記載並稱之為根 類原球體。本實驗以不同時期的根類原球體為材料,經由石蠟切片方

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式 研 究 探 討根 類原 球 體 的 再生 途徑 為 何 。 並以 植物 生 長 調 節劑 ( auxin、cytokinins )測試誘導根培植體產生根類原球體,以期找出根 類原球體發生最適合的處理,以建立曲足蘭及妖精蘭×瓢唇蘭更完善 的再生系統。

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第二章 第二章 第二章

第二章 文獻探討 文獻探討 文獻探討 文獻探討

2.1 曲足蘭

曲足蘭 曲足蘭 曲足蘭簡介 簡介 簡介 簡介

Cyrtopodium 屬在美國南部和中美洲約有 30 個種類以曲足蘭來命 名,原生於巴西、委內瑞拉、西印度群島等,是一種熱帶地生蘭,發 育中的新芽基部會產生厚實的偽球莖和總狀花。這些種類有時會栽培 用 來 美 化 景 觀 , 一 些 種 類 還 有 藥 用 的 特 性 , 例 如 Cyrtopodium cardiochilum 有生物活性的多糖可作為傷風、結核病和血友病治療用 ( Barreto and Parente, 2006 )。

Cyrtopodium 在希臘文中,kyrtos 指彎曲,pous 指腳,用來表示 綠色蕊柱的外型;因其外型本屬植物就俗稱為曲足蘭或者雪茄蘭。曲 足蘭有一個厚實的偽球莖,植株高度可達 50 公分甚至更高,葉片皺 摺鮮綠色,冬季落葉,花朵為黃綠色,花期在春季和夏季,發育中新 芽的基部會產生厚實的偽球莖和總狀花,所以也可用作旱地景觀美化 用。曲足蘭( Cyrotopodium paranaense )在分類學上的地位是被子植物 門( Angiospermae )、單子葉植物綱( Monocotyledoneae )、雌雄合蕊植 物目( Gynandrae )、蘭科( Orchidaceae )、樹蘭亞科( Epidendroideae )、

蕙蘭族 ( Cymbidieae )、萼足蘭亞族( Cyrtopodiinae )、曲足蘭屬 ( Cyrtopodium )。

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2.2 妖精蘭與瓢唇蘭簡介

妖精蘭與瓢唇蘭簡介 妖精蘭與瓢唇蘭簡介 妖精蘭與瓢唇蘭簡介

Mormodes 簡稱 Morm.約有 20 個原生種。Mormodes 是由拉丁文 mormo( 妖怪 )與 eides( 相似 )二字合成,直譯為妖精蘭或妖怪蘭,

這是因為花蕊柱的花形像是扮鬼臉似地斜臉歪嘴扭曲著,所以英文名 也稱它為 Goblin Orchid( 魔鬼蘭 ),也因一梗數花,花姿如群燕飛翔,

而被稱為飛鳥蘭或飛燕蘭( 圖 1 )。高約 30~60cm,假球莖多肉肥厚,

葉片由假莖底部抽出,披針形而薄,外鞘將假莖層層包覆,花期在秋 末冬初,其最大特色,為無葉仍會開花,花朵數特多,可遺傳給後代 或 雜 交 的 其 他 蘭 屬 , 最 為 顯 者 為 Cycnodes ( = Cycnoches × Mormodes ),而它健碩的假莖也會遺傳給後代。

Catasetum 簡稱 Ctsm.,約有 100 多種原生種。Catasetum 在希臘 語中,kata 是向下,拉丁文 seta 是剛毛,屬名指出本屬蕊柱的兩個突 起的位置。植株高約 30~60cm,某些品種的唇瓣圓大而形如瓢蟲之貝 甲,如盛水的瓜瓢,所以得瓢唇蘭之名,另有些品種,三片萼片形如 三角星形,也叫三星蘭。依其花型來區分可分為大花、小花型和鋼盔 型等。由於雌花之存唇瓣凹凸圓鼓如大肚,像電影裡的 ET,又被稱 為 ET 蘭。雄花與雌花分開著生或不同著生,一般常見為雄花,雌花 機率非常低,因此在雜交上較為困難,但一年有三次以上開花的次數 應可彌補花期短的缺陷,花朵帶有濃郁香味,雄花上有似觸角的特殊

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器官,成熟時風吹或手動均易使花粉自動彈出,乃此屬的一大特點 ( 陳,1986、江,2002、陳,2004 )。

CatasetumMormodes 都屬於蘭界裡 Catasetinae 亞科的植物,產 於中南美洲高溫多濕的雨林環境裡,容易栽培,這兩屬雖然在花型上 有很大的差異,但屬之間可以相互交配,因此變化多端很值得玩賞。

Mormodes 與 Catasetum 交配後,大部分可以加深子代的顏色,著名 的 Catasetum Black Magic( = Ctms. Orchidglade × Morm. sinuata ) 此 品系之深,可以說是蘭科植物中最黑的花朵( 陳,2004 )。其分類地 位 為 被 子 植 物 門 ( Angiospermae ) 、 單 子 葉 植 物 綱 ( Monocotyledoneae ) 、 雌 雄 合 蕊 植 物 目 ( Gynandrae ) 、 蘭 科 ( Orchidaceae )、樹蘭亞科( Epidendroideae )、蕙蘭族 ( Cymbidieae )、

( Catasetinae )亞族、妖精蘭屬( Mormodes )及瓢唇蘭屬( Catasetum )。

2.3 蘭花體胚再生與器官再生之研究

蘭花體胚再生與器官再生之研究 蘭花體胚再生與器官再生之研究 蘭花體胚再生與器官再生之研究

植物細胞具有分化全能性,植物細胞或組織只要在適宜的培養環 境下,可以經由器官再生或是體胚再生而再度分化、發育成為一個完 整的植株。然而不同的植物種類甚至同種植物的不同組織,都可能經 由不同途徑分化(黃和李,2000),而這兩種途徑的差異,Haccius( 1978 ) 曾作了下述組織學上的定義:第一,體胚具有兩極性,即在發育的早

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單向極性。第二,體胚的維管束組織與培植體的組織無解剖上的聯繫

,而不定芽或不定根通常與培植體或癒傷組織維管束相聯繫。第三,

體胚維管組織的分布是獨立的“Y”字形,而不定芽的維管組織則無 此現象。

由於體胚再生具有根莖兩個極性結構,因此可一次再生成完整植 株加上體胚再生產生的數量極為龐大,且體胚又可再生二次體胚 ( secondary embryo ),更有利於作物的大量繁殖。而器官再生須先誘 導芽體形成,再改變培養基成分後誘導使發根,需兩個階段才能完 成,此外,器官再生的植株通常是多細胞起源,特徵上可能是嵌合的,

這不利於優良性狀的保存和純化( 黃和李,2000、陳和夏,2004 )。

蘭花種子播種後由接合子胚再生( zygotic embyogenesis )方式長 出的圓形球胚稱為原球體( protocorm ),而由原球體或是種子以外的 組織誘導形成的無性生殖體胚稱為類原球體( protocorm like body, PLB ) , 指 類 似 原 球 體 的 球 體 即 是 一 種 體 胚 再 生 ( somatic embyogenesis )的方式,兩者皆為蘭科植物特有。利用不同的組織器 官或生長調節劑去誘導出類原球體時,常會造成類原球體的發生部位 或形態有所差異。黃( 2001 )報告中指出蝴蝶蘭體胚的誘導必須破壞其 生長組織,即切除的莖頂部份,佔全原球體的1 / 2 為主,不僅可使 莖頂組織被破壞不致再次抽芽,亦能在干擾胚性細胞團的決定下出現

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單一胚性細胞。在蝴蝶蘭果莢中未成熟胚的相關研究中,觀察到未成 熟胚呈長圓形,依其內部細胞結構可分前端( anterior region )、後端 ( posterior region ),通常前端之細胞較後端小,且密集。當此未成熟 胚培養於適當環境中,前端小細胞群會逐漸分化成一分生組織群 ( meristematic mass ),而後端細胞逐漸增大,但無分化之傾向。經過 一段時間的培養,在頂端的細胞聚集物逐漸形成一突起物,最後發育 成一背生隆起( dorsal ridge )之組織,稱之種脊( crest ),也因為種脊的 特殊組織,蝴蝶蘭的原球體成熟時具有腹背分明( dorsiventral )之外 形。種脊成熟後,原始形成層束( procambial strand )即自莖頂分化出,

並延伸入原球體中心,此時第二種脊自莖頂分生部位再分化出,但比 第一種脊小了許多。兩種脊均無維管束組織之形成,但有時卻也可發 現第二種脊中會發育出維管束組織。有些原球體的第一、第二種脊外 形會與葉子相似,有些則會在兩種脊間分化出蝴蝶蘭的第一片正常葉 片。而蝴蝶蘭的根則是自原球體內部,與莖頂分生組織相連處分化出 ( Nishimura, 1981 )。

自 1960 年 Morel 發現可藉由分生組織培養技術來大量的繁殖蘭 科植物( Morel, 1960 ),近年來很多商業性的實驗室運用這種技術來生 產世界各地數百萬低成本的蘭科植物幼苗。素心蘭( Cymbidium )、石 斛蘭( Dandrobuim )、蝴蝶蘭( Phalaenopsis )等可透過芽體再生及增殖

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( Arditt and Ernst, 1993 );素心蘭( Chang and Chang, 1998 )、蝴蝶蘭 ( Ishii et al., 1998;Chen et al.,2000 )文心蘭( Oncidium )( Chen and Chang, 2000 )也可經由癒傷組織形成體胚;瓢唇蘭( Catasetum )、朵麗 蝶蘭( Doritaenopsis )、萬代蘭( Vanda )及紫蘭( Spathoglottis plicata ) 等可經類原球體發生的過程進行繁殖( Kraus and Monterio, 1989;

Tokuhara and Masahiro, 1993;Teng et al., 1997;Tanaka et al.,1975 ),

文 心蘭 的葉 片可直 接形 成體 胚並發 育成 為正 常的植 株 ( Chen et al.,1999 )。

吾人研究發現曲足蘭與妖精蘭×瓢唇蘭在組織培養下,不需荷爾 蒙就自然會在根的尖端或是中間形成類似原球體構造的組織,再發育 成為完整的植株,而在前人研究中,也有在自然情況下根即可生長出 芽 的 相 關 報 告 : 鬚 唇 蘭 ( Pogonia ophioglossoide ) 、 頭 蕊 蘭 ( Cephalanthera rubra )、玉鳳蘭( Habenaria repens )、雙葉蘭( Listera cordata)、蝴蝶蘭(Phalaenopsis schilleriana, P. deliciosa, Phalaenopsis stuartina and P. Pink Hawaii )、鈴蘭( Epipactis microphylla )等( Carlson, 1938;Scully, 1971; Churchill, Ball and Arditti, 1972 ),另外有些種類 的蘭花在組織培養時形成特殊組織,例如類原球體。樹蘭( Epidendrum Obrienianum )、蝴蝶蘭( Phalaenopsis amabilis )、雜交種的瓢唇蘭 ( Catasetum Vanilla planifolia )、瓢唇蘭( Catasetum pileatum Reichb. f. )

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等( Stewart and Button, 1978; Tanaka, Senda and Hasegawa, 1976;

Kerbauy,1984; Philip and Nainar,1986; Kraus and Kerbauy, 1987 )。

2.4 影響體胚形成之因素

影響體胚形成之因素 影響體胚形成之因素 影響體胚形成之因素

2.4-1 培植體條件

培植體條件 培植體條件 培植體條件

體胚形成的條件,依植物的種類來源而異。繖型花科植物胡蘿蔔 及芫荽等容易形成體胚,以胡蘿蔔而言,任何生長期選取任何組織,

例如胚軸( Mizukami, 2008 )、幼根、主根、葉柄、花梗或是原生質體 等都可以形成體胚,所以是目前做體胚研究最好的材料。茄科植物,

特別是菸草屬,其大部分組織培養後的再分化都是經由器官形成的途 徑。也有非常不易形成體胚的植物,例如禾本科及豆科,就必須取其 特定部位,且在嚴格的培養條件之下,才能誘導體胚分化,品種間更 存有很大的差異。ㄧ般而言,培植體宜取自細胞分裂旺盛的部位,例 如未成熟的合子胚、嫩葉、幼花序中尚未有絲分裂的部份等,因為這 些細胞活力旺盛且抑制物尚未形成( 黃和劉,1987 )。

2.4-2 培養基成份

培養基成份 培養基成份 培養基成份

在 影 響 體 胚 發 生 的 因 子 中 , 植 物 生 長 調 節 劑 極 為 重 要 ( Zimmerman, 1993 )。文心蘭根尖、莖、葉所誘導出的癒傷組織,在 添加 0.1 mg/l NAA 及 3 mg/l TDZ 的培養基下,經由體胚發生途徑再

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生成植株。其體胚發生率為 93.8%,每個培植體平均產生的 29.1 個 體胚,且均能發育成為正常的植株( Chen and Chang, 2000 )。

而本實驗則探討植物生長調節劑對曲足蘭及妖精蘭×瓢唇蘭根培

植體誘導根類原球體體胚發生的影響。在生長素方面,正常情況下植 物體可透過酵素氧化或與胺基酸結合的方式控制生長素的含量以調 節根部的發育,將生長素集中於特定區域以防止過多的根產生,但組 織培養時,生長素是由外界添加於培養基,並自基部傷口進入植物體 中而持續刺激( Berleth and Sachs, 2001 ),故若於此時施用適當濃度的 生長素可使根部分生組織大量被誘導 ( Sabatini et al., 1999 )。IAA、

IBA及NAA在發根應用上的效果差異,主要是由於其生物活性上的不 同所造成,就以IAA 而言,植物體可經由氧化作用及與葡萄糖、氨 基酸等相互作用呈結合態形式調節其活性,故適用濃度範圍較廣 ( 10~300 µM )( De Klerk, 2002 )。TDZ由Mok et al.( 1982 )報告中指出 具有cytokinin的活性,自此之後,TDZ大量有效的使用於試管內來誘 導形態發生,尤其是一些較難以誘導形態發生的木本植物 ( Lu, 1993 )。近年來TDZ被運用在蘭花試管內的形態誘導報告也很多:誘 導文心蘭( Oncidium )直接形成體胚( Chen et al., 1999;Chen and Chang, 2001 );蝴蝶蘭( Phalaenopsi s) ( Chen and Piluek., 1995;Ernst, 1994 )。

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第三章 第三章 第三章

第三章 材料與方法 材料與方法 材料與方法 材料與方法

3.1 植物

植物 植物 植物材料 材料 材料 材料

本試驗曲足蘭( Cyrtopodium paranenses × sibling )之材料由珍寶 蘭園提供之蘭花種莢,93/6/6 進行授粉並於 93/11/3 進行無菌播種。

妖精蘭×瓢唇蘭( Mormodes Jumbo Odin × Catasetum expensum )之材料 由珍寶蘭園提供之蘭花種莢,93/10/20 進行授粉並於 94/3/7 進行無菌 播種。蝴蝶蘭( P. Hwafeng Redjewel × P. New Cinderella )之材料由金 車蘭園提供之蘭花植株,96/3/15 進行授粉並於 96/7/2 進行無菌播種。

3.2 播種

播種 播種 播種、 、 、 、生長 生長 生長 生長培養基 培養基 培養基 培養基

以上均播種於花寶 1 號( Hyponex No.1,7N-6P2O5-19K2O ),其中 並添加 Bacto-tryptone 2g/l、35g/l sucrose 及 15 g/l agar,培養基之 PH 值於高壓滅菌前調整為 5.4。子瓶階段改培養於 MS 基礎培養基中,

其中並添加 Bacto-tryptone 2g/l、35g/l sucrose 及 10 g/l agar,待其長 成植株與形成根類原球體以進行實驗。

3.3.蘭花組織

蘭花組織 蘭花組織 蘭花組織石蠟切片 石蠟切片 石蠟切片 石蠟切片製備 製備 製備 製備

將曲足蘭和妖精蘭×瓢唇蘭之根與根類原球體等植物組織切成適

當大小後置於 F.A.A. ( Formalin 5%, acetic aicid 5%,50~70% ethyl alcohol)溶液中固定 4 小時以上並抽氣 10 分~18 小時不等,經第三丁

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醇( t-butanol )與乙醇混合液系列( TBA-series )脫水後添加一滴 0.5%

safranin 以方便切片時的觀察,以濃度梯度逐漸升高方式進行滲蠟取 代,最後進行埋蠟,並以旋轉式切片機( rotary microtome )將材料切成 10~15µm 薄片,切片後之樣品蠟帶放在浸過 Poly-L-lysime 0.1M 溶液 的玻片上,溶解蠟帶後用 hematoxylin 或 0.1% fast green 染劑染色一 天,抽氣櫃中靜置一夜後將玻片置於解剖顯微鏡下觀察並照相。

3.4 植物生長激素誘導

植物生長激素誘導 植物生長激素誘導 植物生長激素誘導根類原球體 根類原球體 根類原球體 根類原球體之試驗 之試驗 之試驗 之試驗

取長約 1cm 根尖之曲足蘭根段為培植體,每處理 10 個培植體,

在 MS 基礎培養基,並添加 IAA 0、0.5、1.0、2 ppm 搭配 TDZ 0、0.5、

1.0、2 ppm 進行試驗,暗處培養 10 天後觀察根類原球體數及其大小。

取長約 1cm 帶有根尖之妖精蘭×瓢唇蘭根段為培植體,每處理 10 個培植體,在 MS 基礎培養基,添加 IAA 0、0.2、0.5、1.0 ppm 搭配 BA 0、0.5、1.0、2.0 ppm 進行試驗,暗處培養 25 天後觀察根類原球 體數與其大小。

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第四章 第四章 第四章

第四章 結果 結果 結果 結果

4.1 蘭花

蘭花 蘭花 蘭花之 之 之 之原球體 原球體 原球體 原球體體胚 體胚 體胚 體胚生 生 生 生長 長

以蝴蝶蘭不同時期的原球體為材料經石蠟切片後觀察蘭花體胚 生長方式,早期原球體前端出現大量密集細胞分生組織( meristematic mass )後,頂端的細胞聚集物逐漸突起形成種脊( crest ) ( 圖2 A )。第 一種脊和第二種脊形成後,維管束從莖頂分生組織( shoot apex )延伸 至原球體中( 圖2 B ),原球體有很大面積的儲藏細胞,此為體胚再生 之特徵。之後種脊部份抽出葉子( 圖2 C ),待幼葉長出,原球體莖頂 分生組織的維管束延伸至原球體中,根自原球體內部,與莖頂分生 組織相連處分化出( 圖2 D ),儲藏細胞中的養分運輸到芽及根部供 應其生長發育,因此儲藏細胞會逐漸縮小。而在妖精蘭×瓢唇蘭經 石蠟切片後觀察的結果也是相同的,早期每一顆原球體都是獨立的個 體( 圖3 ),也同樣具有儲藏細胞,為體胚再生。在第一種脊和第二種 脊形成後,維管束從莖頂分生組織延伸至原球體中( 圖4 ),之後再從 種脊部份抽出葉子,幼葉長出,原球體莖頂分生組織的維管束延伸至 原球體中,根自原球體內部,與莖頂分生組織相連處分化出,儲藏 細胞中的養分運輸到芽及根部供應其生長發育,儲藏細胞逐漸縮小 ( 圖5 )。

(23)

4.2 曲足蘭

曲足蘭 曲足蘭 曲足蘭之 之 之 之根類原球體 根類原球體 根類原球體 根類原球體再生 再生 再生 再生

曲足蘭在組織培養下,不需荷爾蒙就自然會在根的尖端( 圖 6 ) 或是中間( 圖 7 )形成類似原球體構造的組織再發育成為完整的植株 ( 圖 8 ),除根類原球體與原親本的根相連外,類原球體與根類原球體 外觀並無差異( 圖 9 )。因此藉由石蠟切片技術可觀察固定樣品組織內 部之細胞型態,以推論出根類原球體的再生形式與原球體的體胚再生 形式之異同。

以不同時期的根類原球體為材料經石蠟切片後發現,一般尚未經 誘導培養的根( 圖 10 ),切下在誘導培養基第 16 天後會先在根尖端形 成球狀突出( 圖 11 )。第 25 天( 圖 12 ),隨著根類原球體膨大,根培 植體的維管束延伸到球體之中並支撐著尖端形成芽原基。培養第 35 天( 圖 13 ),接著形成根原基,而後根類原球體頂芽長出維管束成為 植株。

4.3 妖精蘭

妖精蘭 妖精蘭 妖精蘭×瓢唇蘭之 瓢唇蘭之 瓢唇蘭之根類原球體 瓢唇蘭之 根類原球體 根類原球體 根類原球體再生 再生 再生 再生

妖精蘭×瓢唇蘭也和曲足蘭一樣,在組織培養下,不需荷爾蒙就

自然會在根的尖端或是中間( 圖 14 )形成類似原球體構造的組織再發 育成為完整的植株( 圖 15 ),除根類原球體與原親本的根相連外,類 原球體與根類原球體外觀並無差異也同樣有根毛的構造( 圖 16 。一

(24)

根尖端形成球狀突出( 圖 18 )。培養第 24 天,隨著根類原球體膨大,

根培植體的維管束延伸到球體之中並支撐著尖端形成芽原基( 圖 19 ),培養第 39 天( 圖 20 ),接著形成根原基,而後根類原球體頂芽 長出維管束成為植株。

4.4 再生

再生 再生 再生根類原球體 根類原球體 根類原球體 根類原球體之現象 之現象 之現象 之現象

曲足蘭及妖精蘭×瓢唇蘭的根類原球體本身就可以形成根類原球

體,也可以透過誘導再生形成許多的類原球體( 圖 21 )並再生成植 株。而再生之根類原球體,經由石蠟切片後觀察發現,再生之根類原 球體也是先從頂芽長出維管束再延伸至原球體之中( 圖 22),由再生 之根類原球體再誘導出的根類原球體也是先從頂端長出芽點( 圖 23 ),根類原球體中的維管束有時也會漸漸與新長出的根類原球體維 管束相連接。

4.5 植物生長

植物生長 植物生長 植物生長激素之效果 激素之效果 激素之效果 激素之效果

4.5-1 IAA 和

和 和 和 TDZ 對曲足蘭誘導 對曲足蘭誘導 對曲足蘭誘導 對曲足蘭誘導根類原球體 根類原球體 根類原球體之效果 根類原球體 之效果 之效果 之效果

曲足蘭的根尖在培養 10 天後,單獨使用 IAA 2mg/l 及 IAA 1mg/l 添加 TDZ 2mg/l 處理中,其根的根類原球體發生率可達 80%( 表 一 ),而 IAA 2 mg/l 添加 TDZ 0.5mg/l 及 IAA 2mg/l 添加 TDZ 2mg/l 處理中,其根的根類原球體發生率為 100%,可使根培植體全部長出

(25)

根類原球體,而對照組和只單獨使用 TDZ 處理的試驗組培植體全都 尚未長出根類原球體( 圖 24 )。

4.5-2. IAA 和

和 和 和 BA 對 對 對妖精蘭 對 妖精蘭 妖精蘭×瓢唇蘭 妖精蘭 瓢唇蘭 瓢唇蘭 瓢唇蘭誘 誘 誘 誘導 導 導根類原球體 導 根類原球體 根類原球體 根類原球體之效果 之效果 之效果 之效果

妖精蘭×瓢唇蘭的根尖在培養 25 天後,使用 IAA 1mg/l 添加 BA 0.2mg/l,其根的根類原球體發生率可達 80%(表二),而 BA 0.5mg/l、

IAA 0.5mg/l 添加 BA 1mg/l、IAA 1mg/l 添加 BA 0.5mg/l 與 IAA 1mg/l 添加 BA 1mg/l 處理中,其根的根類原球體發生率為 100%,可使根培 植體全部長出根類原球體,而對照組和只單獨使用 IAA 處理的試驗 組除 IAA 0.5mg/l 處理培植體有 20%的根類原球體發生率,其他全都 尚未長出根類原球體( 圖 25 )。

4.6 植

植 植 植株再生 株再生 株再生 株再生

將根培植體培養所獲得的根類原球體切下,移至不含植物生長調 節劑的基礎培養基,置於光照下培養,根類原球體逐漸發育成熟,兩 片葉鞘張開後便抽出本葉、基部發根,幾乎 100%都可形成正常植株 ( 圖 26 )。

(26)

第五章 第五章 第五章

第五章 討論 討論 討論 討論

5.1 曲足蘭

曲足蘭 曲足蘭 曲足蘭及妖精蘭 及妖精蘭 及妖精蘭 及妖精蘭×瓢唇蘭體胚再生 瓢唇蘭體胚再生 瓢唇蘭體胚再生 瓢唇蘭體胚再生

以蝴蝶蘭不同時期的原球體為材料經石蠟切片後觀察蘭花體胚 再生方式,早期原球體前端出現大量密集細胞分生組織(meristematic mass)後,頂端的細胞聚集物逐漸突起形成種脊(crest)。第一種脊和 第二種脊形成後,維管束從莖頂分生組織(shoot apex)延伸至原球體 中,之後種脊部份抽出葉子,待幼葉長出,原球體莖頂分生組織的維 管束延伸至原球體中,根自原球體內部,與莖頂分生組織相連處分 化出。而妖精蘭×瓢唇蘭原球體在第一種脊和第二種脊形成後,維管 束從莖頂分生組織延伸至原球體中,再從原球體種脊部份抽出葉子,

幼葉長出,最後原球體莖頂分生組織的維管束延伸至原球體中。

蝴蝶蘭和妖精蘭×瓢唇蘭其再生方式都是和Nishimura( 1981 )在蝴蝶 蘭果莢中未成熟胚的相關研究中所觀察到的結果是ㄧ樣的。

5.2 妖精蘭

妖精蘭 妖精蘭 妖精蘭×瓢唇蘭及 瓢唇蘭及 瓢唇蘭及曲足蘭 瓢唇蘭及 曲足蘭 曲足蘭 曲足蘭根 根 根 根類原球體 類原球體 類原球體 類原球體再生 再生 再生 再生

植物細胞具有分化全能性,植物細胞或組織只要在適宜的培養環 境下,可以經由器官再生或是體胚再生而再度分化、發育成為一個完 整的植株。然而不同的植物種類甚至同種植物的不同組織,都可能經 由不同途徑分化( 黃和李,2000 )。曲足蘭、妖精蘭×瓢唇蘭在組織培

(27)

構造的組織再發育成為完整的植株,除根類原球體與原親本的根相連 外,類原球體與根類原球體外觀並無差異。因此藉由石蠟切片技術觀 察固定樣品組織內部之細胞型態,以推論出根類原球體的再生形式與 原球體的體胚再生型式之異同。

以不同時期的根類原球體為材料經石蠟切片後發現,早期會先在 根尖端形成球狀突出,隨著根類原球體膨大,根培植體的維管束延伸 到球體之中此時為單向極性,並支撐著尖端形成芽原基,接著才形成 根原基,具有兩極性,從方向相反的兩端分化出莖端和根端,為一體 胚再生途徑( Haccius, 1978 ),而後根類原球體從頂芽長出維管束成 為植株。這証明了根類原球體再生途徑初期有其發生的特異性,而後 期則與類原球體相同為體胚再生途徑。由於類原球體可直接發育成 一株完整的植株,且因不涉及遺傳訊息的交換而能完整保留性狀,

因此常用於生產大量的分生苗( Tanaka, 1990 )。利用不同的組織器 官或生長調節劑去誘導出類原球體時,常會造成類原球體的發生部 位或形態有所差異。黃( 2001 )報告中指出蝴蝶蘭體胚的誘導必須 破壞其生長組織,即切除的莖頂部份,佔全原球體的1 / 2 為主,

不僅可使莖頂組織被破壞不致再次抽芽,亦能在干擾胚性細胞團的 決定下出現單一胚性細胞。本實驗室也曾將曲足蘭及妖精蘭×瓢唇蘭 根培植體切下做刺傷和切碎等方式欲誘導根中間根類原球體或是將

(28)

植株上的根以針頭刺傷根尖及根中尖,但並無誘導效果,反而造成根 部褐化或是依舊只在根尖端部分長出根類原球體,因此由根誘導根類 原球體似乎不是單純的因組織破壞而導致根類原球體的產生。但將根 培植體培養所獲得的根類原球體切下再進行刺傷誘導出更多的類原 球體,置於光照下培養,幾乎都可形成正常植株,顯示根類原球體的 誘導可透過破壞其生長組織的來誘導更多的類原球體。

5.3 植物生長激素之

植物生長激素之 植物生長激素之 植物生長激素之效果 效果 效果 效果

在 影 響 體 胚 發 生 的 因 子 中 , 植 物 生 長 調 節 劑 極 為 重 要 (Zimmerman, 1993)。文心蘭根尖、莖、葉所誘導出的癒傷組織,在添 加 0.1 mg/l NAA 及 3 mg/l TDZ 的培養基下,經由體胚發生途徑再生 成植株。其體胚發生率為 93.8%,每個培植體平均產生的 29.1 個體 胚,且均能發育成為正常的植株( Chen and Chang, 2000 )。而本實驗 則探討植物生長調節劑對曲足蘭及妖精蘭×瓢唇蘭根培植體誘導根類 原球體體胚發生的影響。

在生長素方面,正常情況下植物體可透過酵素氧化或與胺基酸結 合的方式控制生長素的含量以調節根部發育,將生長素集中於特定區 域以防止過多的根產生,但組織培養時,生長素是由外界添加於培養 基,並自基部傷口進入植物體中而持續刺激( Berleth and Sachs,

(29)

誘導 ( Sabatini et al., 1999 )。IAA 在植物體可經由氧化作用及與葡萄 糖、氨基酸等相互作用呈結合態形式調節其活性,故適用濃度範圍廣 (10~300µM )( De Klerk, 2002 )。TDZ 由Mok et al.( 1982 )報告中指出 具有cytokinin的活性,自此之後,TDZ 大量有效的使用於試管內來 誘導形態發生,尤其是一些較難以誘導形態發生的木本植物( Lu, 1993 )。近年來TDZ被運用在蘭花試管內的形態誘導報告也很多:誘 導文心蘭( Oncidium )直接形成體胚( Chen et al., 1999;Chen and Chang, 2001);蝴蝶蘭( Phalaenopsis ) ( Chen and Piluek, 1995;Ernst, 1994 )。Chen and Chang( 2000a, b )的報告中顯示,0.3-3 mg/l 的TDZ 無法明顯促進體胚發生。本實驗中,單獨使用0.5-2.0 mg/l的TDZ 也 無法明顯促進曲足蘭的根類原球體形成,但與IAA 搭配使用,在IAA 1 mg/l及TDZ 1 mg/l、IAA 2 mg/l添加TDZ 0.5 mg/l則可將根培植體的 根類原球體發生率提高到100%( 表一 ),單獨使用較高濃度的IAA 2 mg/l也能有80%的根類原球體發生率,顯示Auxin對曲足蘭的根類原球 體的形成有明顯的促進效果。而妖精蘭×瓢唇蘭的根培植體經由含BA 0.5 mg/l的培養基處理,即可使根培植體全部長出根類原球體(表二 )。

(30)

第六章 第六章 第六章

第六章 結論 結論 結論 結論

本研究針對曲足蘭和妖精蘭×瓢唇蘭組培苗之根類原球體再生現 象進行探討,觀察結果發現根類原球體再生途徑初期有其發生的特異 性,而後期則與PLB相同為體胚再生途徑。實驗也證明曲足蘭的根尖 在暗處經由含IAA的培養基處理,可使根培植體長出根類原球體,而 對照組則尚未長出根類原球體。而妖精蘭×瓢唇蘭的根尖經由含BA的 培養基處理,可使根培植體長出根類原球體,對照組則尚未長出根類 原球體,此體胚發生系統可應用於大量繁殖,以提高繁殖與育種效 率,但影響體胚形成之其他因素,如根培植體年齡、培養溫度及培養 基成分等條件對根類原球體之誘導與影響還需要進一步的研究。

(31)

第七 第七 第七

第七章 章 章 參考文獻 章 參考文獻 參考文獻 參考文獻

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(36)

表 一、IAA 和 TDZ 對曲足蘭誘導根類原球體之效果

TDZ IAA(mg/l)

(mg/l) 0 0.5 1.0 2.0

0 - - - ++++

0.5 - - ++ +++++

1.0 - + +++++ +++

2.0 - + ++++ +++++

每處理十個培植體,處理 10 天

-:0% +:20% ++:40% +++:60% ++++:80% +++++:100%

(37)

表 二、IAA 和 BA 對妖精蘭×瓢唇蘭誘導根類原球體之效果

BA IAA(mg/l)

(mg/l) 0 0.2 0.5 1.0

0 - - + -

0.2 +++ +++ + ++++

0.5 +++++ - ++ +++++

1.0 +++ +++ +++++ +++++

每處理十個培植體,處理 25 天

- : 無根類原球體形成 + : 20% ++ : 40% +++ : 60% ++++ : 80%

+++++ : 100%

(38)

圖 1. A.曲足蘭 B.妖精蘭 C.瓢唇蘭

A

B C

(39)

圖 2. 蝴蝶蘭原球體胚胎再生途徑

(A)早期原球體前端出現大量密集細胞分生組織後,頂端的細胞聚集 物逐漸突起形成種脊。(B)第一種脊和第二種脊形成後,維管束從莖 頂分生組織延伸至原球體中,原球體此時還有很大的儲藏細胞。C.

種脊部份抽出葉子。(D)待幼葉長出,原球體莖頂分生組織的維管束 延伸至原球體中,根自原球體內部,與莖頂分生組織相連處分化 出,儲藏細胞中的養分運輸到芽及根中,因此儲藏細胞縮小。

C:種脊 L:葉 P:原球體 V:維管束 (bar = 0.5mm) P

P

C V

L

V C

P

A B

C D

(40)

圖 3. 妖精蘭×瓢唇蘭原球體之切片

早期每一顆原球體都是獨立的個體,具有儲藏細胞,為體胚再生。

P:原球體 (bar = 0.5mm) P

P

(41)

圖 4. 妖精蘭×瓢唇蘭原球體之切片

第一種脊和第二種脊形成,維管束從莖頂分生組織延伸至原球體中。

C:種脊 P:原球體 Pm:頂端分生組織 V:維管束 (bar = 0.25mm)

C

P

Pm

V

(42)

圖 5. 妖精蘭×瓢唇蘭原球體長根

種脊抽出葉子,幼葉長出,原球體莖頂分生組織的維管束延伸至原球 體中,根自原球體內部,與莖頂分生組織相連處分化出。儲藏細胞 中的養分運輸到芽及根部供應其生長發育,儲藏細胞縮小。

V:維管束 R:根 (bar = 0.5mm) R

V

(43)

圖 6. 曲足蘭根尖之根類原球體

(bar = 1cm)

(44)

圖 7. 曲足蘭根中間之根類原球體 (bar = 1mm)

(45)

圖 8. 曲足蘭根類原球體生長成植株

(bar = 1cm)

(46)

圖 9. 曲足蘭根類原球體與類原球體比較 (bar = 1mm)

(47)

圖 10. 曲足蘭根之切片

一般尚未經誘導培養的根。(bar = 0.125mm)

Ct:皮層 Pc:原始形成層 Pm: 頂端分生組織 Vl:海綿層 Pc

Ct

Vl Pm

(48)

圖 11. 曲足蘭根類原球體誘導培養第 16 天之切片 切下在誘導培養基第16天後在根尖端形成球狀突出。

Ct:皮層 RVT:根的維管束 Vl:海綿層 (bar = 0.25mm) Vl

RVT Ct

(49)

圖 12. 曲足蘭根類原球體誘導培養第 25 天之切片

隨著根類原球體膨大,根培植體的維管束延伸到球體之中並支撐著尖 端形成芽原基。BP:芽原基 Ct:皮層 RVT:根的維管束 Vl:海綿 層 (bar = 0.25mm)

Vl

Ct

RVT BP

(50)

圖 13. 曲足蘭根類原球體誘導培養第 35 天之切片

形成根原基。AB:頂芽 LO:似葉器官 RE:根培植體 RP:

根原基 (bar = 0.25mm)

RE RP

AB

LO

(51)

圖 14. 妖精蘭×瓢唇蘭根中間根類原球體之切片 RE:根培植體 (bar = 0.5mm)

RE

(52)

圖 15. 妖精蘭×瓢唇蘭根類原球體生長成植株

(bar = 1cm)

(53)

圖 16.妖精蘭×瓢唇蘭根類原球體的根毛 (bar = 1mm)

(54)

圖 17. 妖精蘭×瓢唇蘭根尖之切片

一般尚未經誘導培養的根。Ct:皮層 Pc:原始形成層 Pm: 頂端分生 組織 Rc:根帽 Vl:海綿層 (bar = 0.25mm)

Ct

Rc

Vl

Pc Pm

(55)

圖 18. 妖精蘭×瓢唇蘭根類原球體誘導培養第 19 天之切片 切下在誘導培養基第 19 天後在根尖端形成球狀突出。

Ct:皮層 RVT:根的維管束 Vl:海綿層 (bar = 0.25mm) Vl Ct

RVT

(56)

圖 19. 妖精蘭×瓢唇蘭根類原球體誘導培養第 24 天之切片

隨著根類原球體膨大,根培植體的維管束延伸到球體之中並支撐著尖 端形成芽原基。BP:芽原基 Ct:皮層 RVT:根的維管束 Vl:海綿層 (bar = 0.25mm)

Vl Ct

RVT

BP

(57)

圖 20. 妖精蘭×瓢唇蘭根類原球體 39 天之切片

形成根原基。AB:頂芽 LO:似葉器官 RVT:根的維管束 RP:根原基 (bar = 0.25mm)

RP AB

LO

RVT

(58)

圖 21. 曲足蘭刺傷根類原球體誘導出更多的類原球體 (bar = 0.5mm)

(59)

圖 22. 妖精蘭×瓢唇蘭再生根類原球體之切片

AB:頂芽 PLB:類原球體 RE:根培植體 (bar = 0.5mm) RE PLB

PLB

AB

(60)

圖 23. 曲足蘭再生根類原球體之切片

AB:頂芽 PLB:類原球體 V:維管束 (bar = 0.5mm)

AB AB

V V

(61)

圖 24. 曲足蘭之根類原球體誘導 44 天

IAA+BA : IAA 1mg/l TDZ 1mg/l (bar = 1cm)

CK IAA+TDZ

(62)

圖 25. 妖精蘭×瓢唇蘭之根類原球體誘導 IAA+BA : IAA 1mg/l BA 1mg/l (bar = 1cm)

CK IAA+BA

(63)

圖 26. 妖精蘭×瓢唇蘭根類原球體再生之植株 (bar = 1cm)

1cm

數據

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參考文獻

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