雙叉桿菌具轉半乳糖作用β-半乳醣及其應用於半乳糖寡醣合成之研究(3/3)

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

雙叉桿菌具轉半乳糖作用β-半乳半半半半半半用半半乳糖

寡半合成之研究(3/3)

計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC93-2313-B-002-002- 執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 10 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學食品科技研究所 計畫主持人： 周正俊 報告類型： 完整報告 報告附件： 出席國際會議研究心得報告半發表論文 處理方式： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 94 年 12 月 27 日

行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告

雙叉桿菌具轉半乳糖作用

-半 乳 糖 苷酶及 其 應 用 於 半 乳 糖 寡 醣合 成

之研究(3/3)

計畫編號：

NSC93-2313-B-002-002

執行期限：91 年 8 月 1 日至 94 年 10 月 31 日

報告日期：94 年 12 月 31 日

主持人：周正俊

國立台灣大學食品科技研究所

一、 中文摘要 本研究首先以三角錐瓶系統，比較雙叉 桿 菌 包 括 Bifidobacterium longum BCRC 15708、B. longum BCRC 14634、B. longum B6、B. infantis BCRC 14633、B. breve BCRC 11846 、 B. bifidum BCRC 14615 、 B. adolescentis BCRC 146087 菌株-半 乳 糖 苷酶 (-galactosidase)之產生，而發現 B. longum BCRC 15708 所產生之-半 乳 糖 苷酶活性及 比活性最高，進一步探討不同碳源(lactose、 glucose 及 galactose)及氮源(yeast extract 、 peptone、(NH4)2SO4、tryptone、gelatin、casein

及 beef extract)對 B. longum BCRC 15708 生產 -半 乳 糖 苷酶之影響。結果顯示，乳糖及酵 母抽出物分別為其最適之碳源及氮源，當以 最 適 培 養 液 組 成 (4% lactose 、 3.5% yeast extract、0.3% K2HPO4、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O 和 0.03% L-cysteine)及最適培 養條件(初始培養液 pH 值為 6.5 及培養溫度 為 37℃) 發酵培養 16 小時後，可得最高之-半 乳 糖 苷酶活性，約為 18.6 U/ml。 來自 B. longum BCRC 15708 之-半乳糖 苷酶經 Q Fast Flow 陰離子交換樹酯層析及 Superose 6 膠體過濾層析純化後，可得純化倍 數 15.7 倍及酵素比活性 168.6 U/mg 之-半乳 糖 苷酶，以 Native PAGE 分析發現其分子量 為 357 kDa。當以 OPNG 作為反應基質時， 酵素反應之最適作用溫度及 pH 值分別為 50 ℃及 7.0，最大反應速率(Vmax)及反應速率常 數(Km)則分別為 70.67 U/mg 及 0.85 mM。鈉 離子及鉀離子可促進酵素之活性，當其添加 濃度為 100 mM 時，相較於未添加者而言， 約可分別提高-半乳 糖 苷酶活性達 12 及 10 倍；1 mM 之鐵離子、鈷離子、銅離子、鋅離 子等則會造成-半 乳 糖 苷酶活性被嚴重抑制 之結果。半乳糖、乳糖及果糖等亦均會抑制-半 乳 糖 苷酶活性，其中當以 OPNG 為反應基 質時，乳糖之抑制作用可能為競爭型抑制之 一種。 利用密閉 5 公升發酵槽培養 B. longum BCRC 15708 進 行-半 乳 糖 苷酶之 生 產 顯 示，最適之初始乳糖及酵母抽出物添加濃度 分別為 4 及 3.5%，而最適之初始接種菌量、 培養溫度、培養液 pH 值及攪拌速率則分別 為 20% (v/v)、37℃、6.5 及 100 rpm。並於最 適培養條件下，發酵培養 10 小時後，可得最 高-半 乳 糖 苷酶活 性 及 轉半 乳 糖 活 性 ，分別 為 36.7 及 0.49 U/ml。 最後，研究發現本試驗菌株於初始乳糖 濃度為 40%，反應液 pH 值為 6.8 及反應溫度 為 45℃下，當乳糖之轉化率為 57.8%時，可 產生最大之半乳寡醣量，相較於反應液中之 總糖量而言為 30.1%，生成之半乳寡醣聚合 度(DP)為 3 及 4，其中又以 3 糖為主要之半乳 寡醣；隨著反應液中初始乳糖添加濃度之增 加(5-40%)，愈有利於酵素進行半乳寡醣之生 成；β-半 乳 糖 苷酶進 行轉半 乳 糖 反 應 之 最適 pH 值及溫度分別為 6.8 及 45℃，當降低或提 高反應液之 pH 值(4.8；7.8-8.8)或溫度(25-35 ℃；55-65 ℃)時，均不利於半乳寡醣之產生， 其中溫度之影響較 pH 值之影響為顯著。此 外，於反應液中額外添加葡萄糖或半乳糖， 亦會抑制β-半 乳 糖 苷酶之 轉半 乳 糖 反 應 。 關鍵字： -半 乳 糖 苷酶，雙叉桿菌，轉半乳 糖作用，發酵槽 Abstract

Seven strains of bifidobacteria (Bifidobacterium longum BCRC 15708, B. longum BCRC 14634, B. longum B6, B. infantis BCRC 14633, B. breve BCRC 11846, B. bifidum BCRC 14615, and B. adolescentis BCRC 146087) were evaluated on -galactosidase producing ability in a flask system with B. longum BCRC 15708 showing the highest production of -galactosidase and the highest specific activity. Further study with B. longum BCRC 15708 revealed that lactose and yeast extract, respectively, were the best carbon source and nitrogen source for the -galactosidase production. After 16 h of fermentation, a maximum -galactosidase activity of 18.6 U/ml was found in medium containing 4% lactose, 3.5% yeast extract, 0.3% K2HPO4, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4·

7H2O and 0.03%L-cysteine at an initial pH of

6.5 and at 37℃.

-galactosidase from B. longum BCRC 15708 was first extracted by ultrasonication then purified by Q Fast-Flow chromatography and gel chromatography on a Superose 6 HR column. These steps resulted a purification of 15.7-fold, a yield of about 29.3% and a specific activity of 168.6 U mg-1protein. The molecular mass was estimated to be 357 kDa by Native-PAGE. The purified enzyme was sable at temperature up to 40℃ and at pH values of 6.5-7.0. Km and Vmax for this purified enzyme

were noted to be 0.85 mM and 70.67 U/mg, respectively. -galactosidase was activated by Na+and K+up to 10-fold and inhibited by Fe3+, Fe2+, Co2+, Cu2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+ and Mg2+. Furthermore, although glucose, galactose, maltose, or raffinose exerted little or no effect on the β–galactosidase activity, lactose and fructose inhibited the enzyme activity. The effect of lactose on the enzyme activity for OPNG is probably a case of competitive inhibition.

B. longum BCRC 15708 grown in a 5-L jar fermenter showed that the inoculum size (1-30%), culture temperature (24-42℃), the pH of medium (4.5-7.5), the agitation speed (5-200 rpm), lactose content(1-10%) and yeast extract content (0.5-6.5%) would all affect the

-galactosidase production. In general, it was found that the growth and production of -galactosidase increased as the inoculum size increased. With 20% inoculation of test organism in a medium containing 4% lactose and 3.5% yeast extract, a maximum -galactosidase activity of 36.7 U/ml and a maximum transgalactosylation activity of 0.49 U/ml could be achieved in 10 h of fermentation if the pH value of culture medium, the agitation speed and the cultivation temperature were controlled at 6.5, 100 rpm, and 37 ℃ , respectively.

Galacto-oligosaccharides (GOS) were efficiently produced by-galactosidase from B. longum BCRC 15708. GOS production increased with increasing lactose concentration. A maximum GOS production of 30.1% (w/w) of total sugars was achieved at 56.8% lactose conversion with 40% of initial lactose concentration at pH 6.8 and 45 ℃ . Tri-saccharides were the major types of GOS formed, accounting for more than 92% of the total GOS produced in the reactions. The presence of galactose and glucose at the concentrations encountered near maximum GOS greatly inhibited the reactions and reduced GOS yield by as much as 20% and 15% respectively. Keywords:-galactosidase、Bifidobacteria、 transgalactosylation、fementer 二、緣由與目的 半乳糖寡醣是目前被公認的益菌助生質 (prebiotics)之一，為不被人類消化液分解利 用，但可被宿主體內特定益生菌(如：雙叉桿 菌等)代謝之物質；1995 年全球所生產之寡醣 約為 85,000 噸，其中半乳寡醣即約占 15,000 噸，僅次於 lactulose (Sako et al. 1999)，更在 經濟上深具價值。此類寡醣可用乳糖經由-半 乳 糖 苷 酶 進 行 轉 經濟上深具價值。此類寡醣可用乳糖經由-半 乳 糖 作 用 而 生 成 (Prenosil et al. 1987) ， 其 結 構 一 般 為 (Galactose)n-Galactose-Glucose，n=2 至 5，其 中半乳糖大多以-1,4 或-1,6 的方式作鍵結 (Sako et al. 1999)，攝取半乳寡醣可有效地提 升人類腸道內益生菌之數目(Bouhnik et al.

1997；Ito et al. 1990；Ito et al. 1993)。 -半 乳 糖 苷酶(lactase) (E. C. 3.2.1.23)， 可水解乳糖並產生一分子之葡萄糖及半乳 糖，-半 乳 糖 苷酶轉化乳糖成為半乳糖寡醣 之作用機制乃當此酵素與乳糖作用時，先將 乳糖之-1,4 糖苷鍵切斷，並與半乳糖形成一 酵素複合體，若有帶羥基之分子靠近此複合 體時，即會發生鍵結轉移作用，故當靠近之 分子為醣類，即會成為一新的醣苷鍵，而形 成 寡 醣 ， 稱 之 為 轉 半 乳 糖 作 用 (transgalactosylation) (Prenosil et al. 1987)；就 反應動力學而言，一般在高乳糖含量及高溫 下，由於半乳糖與酵素複合體之碰撞機率增 加，-半 乳 糖 苷酶之反應即會趨向轉半乳糖 作用。 雙叉桿菌具有益生菌(probiotics)之生理 功能，如可維持腸道內正常微生物族群、減 少腸道內有害物質、預防大腸癌、降低血液 中膽固醇及脂質含量等重要生理活性 (Berg 1998)。一些研究指出，此類菌株可產生-及 -半 乳 糖 苷酶，其中-半 乳 糖 苷酶除可將乳 糖分解成為葡萄糖及半乳糖外，亦可將半乳 糖作為接受者，進行轉半乳糖作用，生成半 乳 糖 寡 醣 之 寡 醣 類 物 質 (Prenosil et al. 1987)。許多微生物可產生-半 乳 糖 苷酶，但 屬 GRAS (generally recognized as safe)級且可 用於食品系統的菌種卻很少 (Gekas V and López-Leiva 1985; Kim and Rajagopal 2000)， 且目前用以生產此酵素之微生物大多為黴菌 或酵母菌。Albayrak 及 Yang (2002)亦指出， 雖已有許多微生物可以產生具轉半乳醣作用 之-半 乳 糖 苷酶，但這些研究多半為探討如 何提高此類寡醣之產量，且這些酵素也多半 不是應用於食品者。乳酸菌及雙叉桿菌自古 以來即被應用於食品當中，所以若來自此類 菌株之-半 乳 糖 苷酶則 可 安 全 地 應 用 於 食品 工業上(Matsumoto 1990)。 微生物生產酵素會受到碳源、氮源、培 養液 pH 值及培養溫度等因子之影響。碳水 合 化 物 一 般 是 提 供 微 生 物 菌 體 生 物 質 量 (biomass)及生長所需之能量，而氮源一般是 作為細胞體中合成蛋白質、酵素分子、DNA、 RNA 和 ATP 等之基本元素之來源，碳源及 氮源之種類會影響酵素之合成速率。Nagy (2001a)等人之研究中指出，當以乳糖作為碳 源時，Penicillium chrysogenum 可產生最高之 -半 乳 糖 苷酶活性；Rhodococcus equi No. 23 生產膽固醇氧化酵素時，不同之碳源及氮 源，亦會影響微生物產生酵素活性之高低 (Kreit et al. 1992；Lee et al. 1997；Liu et al. 1987)。 基於雙叉桿菌具有 probiotic 功能，屬 GRAS 菌株，及其產生之-半 乳 糖 苷酶在保 健、經濟及學術價值上之考慮，在此研究中， 吾人乃進行一系列之試驗，比較不同雙叉桿 菌菌株-半 乳 糖 苷酶活性之表現，並以三角 錐瓶培養探討不同培養液組成，尋求可獲得 最高之-半 乳 糖 苷酶活性之最適組合；其 後，進一步以密閉 5 公升發酵槽進行-半乳 糖 苷酶之生產，探討培養溫度及培養液初始 pH 值等操作變數，對於菌株之生長以及-半 乳 糖 苷酶生產的影響。此外，並對-值等操作變數，對於菌株之生長以及-半乳 糖 苷酶進行純化，探討其相關之理化特性。 最後，在本研究中探討初始乳糖添加濃度、 pH 值、反應溫度及葡萄糖與半乳糖等對於由 雙叉桿菌所產生之 β-半 乳 糖 苷酶進 行轉半 乳 糖反應之影響。 三、結果與討論 以 250 ml 錐瓶，於 37℃培養不同雙叉桿 菌菌株 12 小時後，顯示不同雙叉桿菌菌株最 終菌數為 7.7 至 8.2 log CFU/ml 之間，並於所 測試的菌株中，只有 B. longum B6、BCRC 15708 及 B. infantis BCRC 14633 可測得 β-半 乳 糖 苷酶活性；其中又以 B. longum BCRC 15708 所產生之 β-半 乳 糖 苷酶活性及比活性 為最高(4.96 U/ml；7.15 U/mg protein)，故在 其後之實驗均以此菌株作為試驗菌株。 不 論 以 乳 糖 或 葡 萄 糖 作 為 碳 源 ， B. longum BCRC 15708 之最終菌數均較高，但 以乳糖作為碳源時，可獲得最高之 β-半乳糖 苷酶活性(5.44 U/ml)，其次為以半乳糖作為 碳源者，而以葡萄糖作為培養之碳源時，所 測得之 β-半 乳 糖 苷酶活性最低。此結果與

Fiedurek 及 Szczodrak (1994)和 Shaikh 等人 (1997)所得之結果相符，他們分別指出乳糖為 誘導 Kluyveromyces fragilis 和 Rhizomucor sp

產生 β-半 乳 糖 苷酶時之最佳碳源，而葡萄糖

在含有 0.5-10.0% 乳糖之培養液中，本 試驗菌株之最終菌數為 8.1 至 8.4 之間，β-半 乳 糖 苷酶之活性會隨培養液中添加乳糖濃度 之提升而增加。當乳糖添加濃度為 4.0%時， 可獲得最高之 β-半 乳 糖 苷酶活性，若再增加 乳糖之添加濃度，則會抑制本試驗菌株對於 β-半 乳 糖 苷酶之產生。此結果與 Fiedurek 及 Szczodrak (1994)以 K. fragilis 生合成 β-半乳 糖 苷酶之報告相類似。而由本試驗結果中顯 示 4%之乳糖已足夠誘導本試驗菌株產生最 高活性之β-半 乳 糖 苷酶。 進行不同氮源影響 β-半 乳 糖 苷酶之產生 顯示酵母抽出物為 B. longum BCRC 15708 產 生 β-半 乳 糖 苷酶之最佳氮源，推測酵母抽出 物，除可作為菌株生長所需之氮源外，亦可 提供其他對菌體有利之生長因子如維生素等 所致(Bridson and Brecker 1970)。

當進一步探討不同酵母抽出物添加濃度 (0-16%)之影響發現，在含有 0.0-16.0% 酵母 抽出物之培養液中，本試驗菌株之最終菌數 為 6.9 至 8.6 之間，隨著添加於培養液中酵母 抽出物濃度之提升，β-半 乳 糖 苷酶之活性也 隨之增加，當酵母抽出物添加濃度為 10% 時，於 37℃培養 12 小時後，可獲得最大活 性，約為 18.8 U/ml；然而，當酵母抽出物添 加濃度再提升至 12-16%時，反而不利於 B. longum BCRC 15708 對 β-半 乳 糖 苷酶之產 生。 當培養液初始 pH 值為 5.0-6.5 時，於 37 ℃下培養 12 小時後，本試驗菌株可得最佳之 生長結果，約為 8.5-8.7 log CFU/ml，而以初 始培養液 pH 值為 7.0 或 7.5 時，所得之結果 為最差；此外，隨著培養液初始 pH 值之增 加，β-半 乳 糖 苷酶之 活 性 亦 會 隨之 提 高，當 初始培養液 pH 值為 6.5 時，本試驗菌株可產 生最高之酵素活性，約為 15.87 U/ml，但若 再提高培養液之初始 pH 值時，β-半 乳 糖 苷酶 活性則會急劇地降低。 雖然於培養溫度為 27-42℃間，對於本試 驗菌株之生長沒有顯著的差異，但隨著培養 溫度之增加，本試驗菌株所產生之 β-半乳糖 苷酶活 性 亦 會 隨之 提 高，當培養溫度為 37℃ 時，β-半 乳 糖 苷酶活 性 會 顯著高於 其 他 所 測 試之溫度，若再提高培養溫度，則會造成 β-半 乳 糖 苷 酶 活 性 產 生 之 減 少 。 此 結 果 與 Fiedurek 及 Szcodrak (1994)和 Shaikh (1997)

等人之研究結果相似。 在最適培養液組成及培養條件下，隨著 培養時間之延長，菌體之生長會隨之增加且 培養液之 pH 值會隨之降低，當培養時間為 10 小時時，菌體之生長可達最高值，約為 8.3 log CFU/ml，並當培養時間為 16 小時時，培 養液之 pH 值會降至最低點，約為 3.8。此外， 隨著培養時間之延長，β-半 乳 糖 苷酶活 性 亦 會隨之增加，當培養時間為 16 小時時，可得 最 大 之 生 β-半 乳 糖 苷 酶活性， 約為 18.6 U/ml，同時，隨著 β-半 乳 糖 苷酶活 性 之 增 加 ， 酵素之轉半乳糖活性亦會隨之提高，並於培 養時間為 12-16 小時間，可 逹 最大 值 。 嘗試利用不同之純化步驟，將 B. longum BCRC 15708 所產生之 β-半 乳 糖 苷酶進 行純 化。首先菌體用超音波破碎後離心，所得之 粗酵素液進行Q Fast Flow陰離子交換樹酯層 析並收集 β-半 乳 糖 苷酶活 性 較 高部份 ，分析 發現其比活性由粗抽液的 10.8 U/mg 提高至 41.5 U/mg，倍數提高 3.9 倍，之後以含 0.25 M NaCl 之 0.05 M 磷酸緩衝液(pH 6.5)透析 24 小時後進行 Superose 6 膠體過濾層析，收集 所得之β-半 乳 糖 苷酶比 活 性 為 168.6 U/mg， 純化倍數達 15.7 倍，而回收率則為 29.3%。 實驗中並利用 Native-PAGE 電泳分析以 了瞭解各純化步驟的效果，當以 Q Fast Flow 陰離子交換樹酯層析區分後，即可去除大部 分之雜蛋白，再經過 Superose 6 膠體過濾層 析後可以得到一個主要蛋白質片段，顯示這 些純化步驟可以確定已達到部份純化的結 果。同時與蛋白質標準品(66-669 kDa)比較 後，可推得由 B. longum BCRC 15708 所產生 之β-半 乳 糖 苷酶分子量約為 357 kDa。 由 B. longum BCRC 15708 所產生之-半 乳 糖 苷酶最適反應溫度則為 50℃，隨著反應 溫度增加(60-70℃)，酵素活性會急劇地下 降，當反應溫度為 70℃時，β-半 乳 糖 苷酶之 活性約為反應溫度為 50℃時，酵素活性之 20 %；同時，隨著反應溫度下降(20-45℃)，酵 素活性亦會隨之降低，當反應溫度為 20℃ 時，相對於最高反應活性，約為 10 %。當酵 素分別靜置於 30 或 40℃下 40 分鐘後，本試 驗菌株所產生之β-半 乳 糖 苷酶仍能保留 85 % 以上之酵素活性，但當酵素靜置於 50℃下 10 分鐘後，酵素之殘存活性約只剩下原活性之

50 %，當酵素靜置於 60℃下時，酵素活性則 會急速地降低，並於靜置 10 分鐘後，酵素即 完 全失去 活 性。 這些結果顯示 B. longum BCRC 15708 所產生之 β-半 乳 糖 苷酶於 30 至 40℃下是穩定的，而於 50℃以上時，酵素活 性則不穩定。 當以 OPNG 為反應基質時，B. longum BCRC 15708 之 β-半 乳 糖 苷酶最大反應速率 (Vmax)及反應速率常數(Km)分別為70.67 U/mg 及 0.85 mM ， 其 最 大 反 應 速 率 相 較 於 Lactobacillus kefiranofaciens K-1(4.64 U/mg) 及 P. chrysogenum (40 U/mg)為高(Itoh et al. 1992; Nagy et al. 2001b)，較 B. infantis HL96 (262 U/mg)為低(Hung and Lee 2002)，而反應 速率常數相較於 B. infantis HL96 (2.6 mM)及 L. kefiranofaciens K-1(4.92 mM)為低，代表由 本試驗菌株所產生之 β-半 乳 糖 苷酶對於基質 (OPNG)之親和力較其他菌株所產生β–半乳 糖 苷酶之親合力為佳。 B. longum BCRC 15708 之 β-半 乳 糖 苷酶 活性會被 1 mM 之重金屬離子(鐵離子、鈷離 子、銅離子、鋅離子)嚴重抑制，但其活性可 被鈉離子及鉀離子等促進，且其促進之效果 會隨鈉離子或鉀離子添加濃度之提高而增 加，當鈉離子或鉀離子添加濃度為 100 mM 時，β-半 乳 糖 苷酶之活性分別約為不添加時 之 12 及 10 倍。本試驗結果相似於 Hung 及 Lee (2002)之研究結果，作者發現低濃度(1 mM)之重金屬離子(錳離子、鈣離子、鈷離 子、鋅離子、汞離子、銅離子)會嚴重抑制 B. infantis HL96 之活性，但鈉離子及鉀離子則 有促進的效應。 當以 OPNG 為反應基質時，半乳糖、乳 糖及果糖均會造成 B. longum BCRC 15708 之 β-半 乳 糖 苷酶活性降低，其中以乳糖之抑制 情形最為顯著，當乳糖添加濃度為 10 mM 時，β-半 乳 糖 苷酶活性約為不添加時活性之 68.6%，而添加 10 mM 之半乳糖或果糖時，β-半 乳 糖 苷酶活性則分別約為不添加時活性之 95.4%及 85.6%。此與文獻指出，半乳糖為 β-半 乳 糖 苷酶水解 OPNG 時之競爭型抑制劑之 報 告 相 符 合 (Smart and Richardson 1987 ； Greenberg and Mahoney 1982)。更進一步探討 添加不同濃度乳糖 (10 及 20 mM)對於 β-半 乳 糖 苷酶反應速率常數(Km)之影響，當添加 20 mM 之乳糖於反應基質中時，β-半 乳 糖 苷 酶之最大反應速率(Vmax)不變，但反應速率常 數較乳糖添加濃度為 10 mM 時大，代表存在 較 高 濃 度 之 乳 糖 時， 會 降 低 酵 素 對 基 質 (OPNG)之親和力，因此推測乳糖可能為此酵 素之競爭型抑制劑。 在更進一步以發酵槽規模來大量生產此 酵素發現，當接種菌量為 30% (v/v)時，在培 養時間為 10 小時之後，其生長濁度即可達最 大值，約為 11.1，當接種菌量為 20% (v/v)時， 則於培養時間為 12 小時時，菌體濁度方可達 最高點，其值約為 10.4。此外，當初始接種 菌量為 30 或 20% (v/v)時，-半 乳 糖 苷酶之 活 性於培養過程中可快速地增加，前者於培養 時間為 10 小時時，酵素活性可達最大值，約 為 41.0 U/ml，其後會有下降之趨勢，並於發 酵終點 12 小時時，-半 乳 糖 苷酶之 活 性 約 為 36.8 U/ml，後者則於培養時間為 12 小時時， -半 乳 糖 苷酶之 活 性 方 達最大 值 ，約為 38.5 U/ml；反之，若當初始接菌量分別為 1、5 或 10% (v/v)時，則於培養 12 小時後，其-半乳 糖 苷酶活 性 分 別 只 有 0.9、10.9 及 13.0 U/ml， 顯著低於初始接菌量為 20 或 30% (v/v)時所 產生之酵素活性(p<0.05)。考量經濟之效益及 培養時間之長短後，將定 20% (v/v)為最適之 初始接種菌量，並進行之後本試驗菌株於發 酵槽規模生產-半 乳 糖 苷酶影 響 因 子 之 探 討。 探討 27、32、37 和 42℃對於以發酵槽 規模培養 B. longum BCRC 15708 時，菌體生 長以及-半 乳 糖 苷酶活 性 產 生 之 影 響 發現， 在整個發酵培養過程中，以 37℃時之菌體生 長為最佳，其次為 32℃，而當培養溫度為 27 或 42℃時，菌體之生長較差，但彼此之間則 無顯著差異(p>0.05)；另外，在整個發酵過程 中，分別在 27、32 和 37℃下培養時，-半 乳 糖 苷酶之 活 性 均 會 持 續 地 上 升 ，當培養時 間為 12 小時時，其酵素活性分別約為 16.0、 21.9 及 35.9 U/ml；然而，當培養溫度定為 42 ℃時，於發酵時間為 2 小時之後，-半乳糖 苷酶活 即 不 再 增 加 ，並於發酵終點 12 小時 時，其酵素活性約只有 2.2 U/ml，為培養溫 度 37℃時酵素活性之 6.5%，這些結果顯示以 發酵槽培養 B. longum BCRC 15708 生產-半 乳 糖 苷酶時 之 最適培 養 溫 度 為 37℃。 在發酵培養過程中，一共探討不控制培

養液 pH 值及四種固定 pH 值(4.5、5.5、6.5 和 7.5)對於 B. longum BCRC 15708 生長以及 -半 乳 糖 苷酶活 性 的 影 響 。當培養液初始 pH 值定為 6.5，並於培養過程中不控制 pH 值 時，隨著發酵時間之延長，菌體之生長亦會 隨之增加，但於培養時間為 8 小時後，菌體 之濁度即不再提高；相較將培養液 pH 值控 制於 4.5-6.5 而言，菌體之生長(OD540)均能隨 著培養時間之延長而增加，並於發酵培養時 間為 12 小時時達到最高值，其濁度約為 10.2，但當培養液 pH 值控制於 7.5 時，菌體 之生長較則明顯較其他三者(4.5、5.5 及 6.5) 為差。此外，在培養過程中，酵素活性均會 隨著培養時間之延長而增加，唯增加之幅度 以將 pH 值調控於 6.5 時最高，而以 pH 7.5 時最為緩慢，並於培養時間為 12 小時時，酵 素活性依序分別約為 23.4、30.4、37.3 和 8.5 U/ml。若於培養過程中不控制培養液之 pH 值，此 酵素活性於發酵終點時約只有 4.3 U/ml ，為控制 pH 值於 6.5 時酵素活性之 11.5%。 攪拌速率影響之試驗結果顯示，無論培 養過程中攪拌速率為何(5-200 rpm)，隨著培 養間時間之延長，菌體之生長亦會隨之增 加， 唯 較 高攪 拌速率 者(100、150 或 200 rpm)，菌體之生長較快，於培養時間為 10 小 時時，其菌體濁度(OD540)即可達最高值，依 序約為 11.2、11.1 和 11.9。在較高攪拌速率 下 ， 除 可 促 進 培 養 液 中 巨 分 子 之 擴 散 (Buckland et al. 1976)之外，亦可降低含有較 高量巨分子培養液之黏度(Umasankar et al. 1996)以提高微生物對於擴散性較差基質之 利用(Confer and Logan 1991)；故推測此為在 較高攪拌速率下，使得菌體之生長可以被促 進之主要原因。此外，隨著培養時間之延長， B. longum BCRC15708 所產生之-半 乳 糖 苷 酶活 性 均 會 隨之 增 加 ，唯在較高之攪拌速率 (100、150、200 rpm)下，於培養時間為 10 小 時時，酵素活性即可達到最大值，分別約為 37.2、35.5 和 36.9 U/ml，而在較低攪拌速率 (5 和 50 rpm)下，則需於發酵時間為 12 小時 時，方能達到最大值，分別約為 35.0 和 36.1 U/ml。 在碳源及氮源濃度之影響試驗中發現， 無論培養液中初始乳糖濃度(1-10%)為何，在 發酵培養之初期(約 6 小時前)，-半 乳 糖 苷酶 之活性均能快速地產生，但當乳糖濃度為 1% 時，於培養時間為 6 小時之後，酵素活性即 不再增加，約為 20.9 U/ml，且當乳糖濃度提 高至 10%時，在培養時間為 6 小時之後，酵 素活性會有下降之趨勢，並於發酵終點 12 小 時時，其酵素活性約只剩 7.1 U/ml；若培養 液中乳糖添加濃度為 2、3 或 4%時，酵素活 性於發酵時間為 6 小時之後，除仍能持續地 增加之外，並於發酵時間為 10 小時時，可獲 得 最 高 之-半 乳 糖 苷酶 活 性 ， 分 別 約 為 28.6、32.7 及 35.5 U/ml。 此外，隨著培養液中酵母抽出物添加濃 度之增加，-半 乳 糖 苷酶活 性 亦 愈 大 ，當酵 母抽出物添加濃度為 3.5%時，於培養時間為 10 小時後，酵素活性即可達最大值，約為 35.5 U/ml；然而，若酵母抽出物添加濃度再提高 至 6.5%，整體而言，對於酵素活性的產生則 沒有顯著性的影響(p>0.05)，且於發酵終點 12 小時時，-半 乳 糖 苷酶之 活 性 略 低 於 酵母 抽出物添加濃度為 3.5%時所產生的酵素活 性。 於 最 佳 發 酵 培 養 條 件( 初 始 接 種 菌 量 20% (v/v)、初始乳糖及酵母抽出物添加濃度 分別為 4 及 3.5%、攪拌速率為 100 rpm、培 養溫度及培養液 pH 值分別控制於 37℃及 6.5) 下，以密閉不通氣 5 公升發酵槽培養 B. longum BCRC 15708 時，當培養時間為 10 小 時時，其生長濁度達最大值，約為 11.6，此 時，培養液中之乳糖即會被全部利用殆盡。 此外，隨著培養時間之延長，酵素活性亦會 隨之提高，並於培養時間為 10 小時時，-半 乳 糖 苷酶及 轉小時時，-半乳糖活性均可達最大值， 分別約為 36.7 及 0.49 U/ml；相較於先前吾人 以三角錐瓶及最佳培養條件所產生之-半乳 糖 苷酶活 性 (18.6 U/ml)及轉半乳糖活性(0.04 U/ml)而言，分別高達 2.0 及 12.3 倍之多，並 大幅縮短生產此酵素所需之時間。 自 B. longum BCRC 15708 中萃取 β-半乳 糖 苷酶之 粗 酵素 液 後，於初始乳糖濃度為 40%、反應溫度為 45℃及 pH 值為 6.8 下進行 轉半乳糖反應，反應 10 小時後所產生之半乳 寡 醣 共 有 2 種 ， 其 聚 合 度 (degree of polymerization)分別為 3 及 4，其中 3 糖及 4 糖之產量分別為 12.6%及 1.6%，以 3 糖為主

要之半乳寡醣；於反應之初期(5 小時)，B. longum BCRC 15708 之 β-半 乳 糖 苷酶會 快 速 轉化利用反應液中之乳糖，使得半乳寡醣及 葡萄糖之產量快速地累積，唯半乳糖產量之 累積則較為緩慢，當反應時間為 10 小時時， 半乳寡醣之產量可達最高值，約佔反應液中 總糖量之 30.1%；但當反應時間為 10 小時 後，酵素利用乳糖之速率趨於緩慢，同時， 半乳寡醣之產量不再增加 ，並有下降之趨 勢，唯葡萄糖及半乳糖之產量仍會持續地累 積。此外由實驗結果亦發現，隨著乳糖轉化 率之提高 ，半乳寡醣之產量亦會快速地累 積，當乳糖之轉化率為 56.8%時，可得最高 之半乳寡醣產量，然而當乳糖之轉化率再提 高時，反應液中半乳寡醣之產量則會急劇地 降低，同時，葡萄糖及半乳糖之產量則會快 速地增加。 當初始乳糖濃度為 5%時，由本試驗菌株 所產生之 β-半 乳 糖 苷酶合 成 之 半 乳 寡 醣之 總 產量約為初始乳糖添加量(5%)之 0.9%，且葡 萄糖及半乳糖產量相對於初始乳糖添加量 (5%)則分別約為 43.7%及 48.0%，所產之半乳 寡醣中，只有 3 糖；隨著反應液中初始乳糖 添加濃度之增加(10-40%)，所產生之半乳寡 醣種類共有 3 及 4 糖，唯其中亦以 3 糖為主 要之半乳寡醣，此外，半乳寡醣產生之總量 相對於初始乳糖含量(10-40%)之比例而言有 上升之趨勢，但葡萄糖及半乳糖產量相對於 初始乳糖含量(10-40%)之比例則為下降之情 形，當初始乳糖濃度為 40%，於反應 10 小時 後，半乳寡醣總產量相對於初始乳糖含量為 34.7%，葡萄糖及半乳糖之產量相對於初始乳 糖濃度而言，則分別約為 21.9%及 9.5%，若 再提高初始乳糖添加含量至 50%，則反而不 利於半乳寡醣之合成。 B. longum BCRC 15708 之 β-半 乳 糖 苷酶 於初始乳糖濃度為 40%及反應溫度為 45℃ 下，當反應液之 pH 值為 6.8 時，於反應 10 小時後，可得最佳之半乳寡醣總產量，相對 於初始乳糖添加含量(40%)約為 33.7%，其中 亦以 3 糖為主要之半乳寡醣，當反應液 pH 值降至 5.8 時，對於酵素進行轉半乳醣反應 並無顯著之影響，但當反應液 pH 值再降至 4.8 或提高至 6.8 以上時，半乳寡醣之總生成 量則有下降之趨勢，於反應液 pH 值為 8.8 時，反應 10 小時後，半乳寡醣之生成量相對 於初始乳糖添加量而言，約為 20.3%，代表由 本試驗菌株所產生之 β-半 乳 糖 苷酶之最適轉 半乳糖反應 pH 值為 6.8。 於反應初始乳糖濃度為 40%及反應液 pH 值為 6.5 下，B. longum BCRC 15708 之 β-半 乳 糖 苷酶隨著反 應 溫 度 之 增 加 (25-45℃)，於 反應 10 小時後，半乳寡醣之產量亦會顯著地 提高(p<0.05)，所產生半乳寡醣之總量相對於 初始乳糖添加量(40%)而言，可由 13.0%提高 至 32.0%，且所產生之半乳寡醣中亦以 3 糖 為主，然而，當反應溫度再提高至 55 或 65 ℃時 ， 半 乳 寡 醣 之 產 量 則 會 顯 著 地 降 低 (p<0.05)，半乳寡醣產生之總量相對於初始乳 糖添加量(40%)而言，則分別下降至 9.2 及 1.0%，這可能是因為由本試驗菌株所產生之 β-半 乳 糖 苷酶在 反 應 溫 度 為 50℃以上時，酵 素活性不穩定，而導致其活性快速失活所致。 隨著反應液中葡萄糖添加濃度(5-20%)之 增加，由本試驗菌株所產生 β-半 乳 糖 苷酶於 最適反應條件(反應液 pH 值為 6.5、反應溫度 為 45℃及初始乳糖添加濃度為 40%)下，半乳 寡醣之產量會隨之降低，當葡萄糖之添加量 為 0-10%時，對於半乳寡醣之產生無顯著的 影響(p>0.05)，但當葡萄糖之添加濃度再提高 至 15 或 20%以上時，則會顯著地阻礙 β-半乳 糖 苷酶轉化 乳 糖 產 生 半 乳 寡 醣(p<0.05)，並於 反應終止 10 小時時，半乳寡醣之產量分別降 至 6.9 及 6.6% (w/v)，抑制幅度達 38.9%以 上；相對於葡萄糖對於半乳寡醣產生之抑制 而言，低濃度(0-10%)半乳糖對於由本試驗菌 株所產生之 β-半 乳 糖 苷酶轉化 產 生 半 乳 寡 醣 亦無顯著地影響(p>0.05)，但當半乳糖之添加 濃度提高至 15%以上時，則會對於半乳寡醣 之產生有抑制之效應，於反應終止 10 小時 時，半乳寡醣之產量由 11.3%降低至 8.8%， 但其抑制幅度較葡萄糖之抑制為小。 四、計劃成果自評 本研究所得有關 培養B. longum BCRC 15708生產具轉半乳糖活性之β-半 乳 糖 苷酶 之最適培養液組成(碳源及其添加濃度、氮源 及其添加濃度)與最適培養條件(培養液pH 值、培養溫度、攪拌轉速及接種菌體濃度)及 酵素之理化特性(分子量大小、最大反應速 率、反應速率常數、最適作用pH值、最適作

用溫度及不同金屬離子及其濃度之影響)，和 利用此酵素在不同乳糖濃度(5-50%)、pH 值 (4.8-8.8)、溫度(25-65℃)下，對於生產半乳寡 醣之探討，除具學術意義外，本研究所得之 方法與條件更可作為利用雙叉桿菌大量生產 此酵素或半乳寡醣時之參考。 五、參考文獻

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