超臨界流體萃取牛樟芝總三萜量之最適條件探 討

I

國立臺東大學 生命科學系 碩士論文

Department of Life Science National Taitung University Master Thesis

指導教授：魏百祿 博士 Advisor：Bai-Lu Wei, Ph. D.

超臨界流體萃取牛樟芝總三萜量之最適條件探 討

Study on the optimal condition of supercritical fluid extraction for total triterpenoids of Antrodia camphorata

研究生：趙書敏 撰 Student：Shu-Min Chao 中華民國一百零三年一月

January, 2014

II

III

IV

致謝

承蒙恩師 魏百祿博士，於大學到碩士期間給予學生無限包容與悉心的指正 教導，研究期間恩師不吝傳授最寶貴的知識及經驗，啟發學生對於研究熱誠，進 而提升在此研究領域層次及眼界，豐富的求學生涯，深感獲益良多，浩瀚師恩，

銘記於心。

稿成之初感謝生命科學系李俊霖博士及國立臺東專科學校食品科技科江啟 銘博士與於研究期間經常給予鼓勵及提供寶貴意見，對於本論文逐字斧正及擔任 論文口試委員工作，使論文內容更加盡善盡美也得以順利完成，特此感謝。

感謝在修業期間所有授課教授的指教，還有要感謝學長，軒丞、昆奇、俊成、

耀文及學姊，姿瑩、兒倩及碩士班期間同學拓羽、興一、彥廷、佳憲、建財、青 修、千雅、鴻英、奕穎，以及學弟妹鈞鼎、宇平、俊毅、維華、政嘉、國銓、昭 如一路相伴與精神上鼓勵。而最慶幸的是在實驗室中，有許多優秀的伙伴陪我度 過數個寒冬，有映潔、佳勳、淑婷、郁婷、冠廷、政翰、宜涵、小王、彥彣、馨 儀、裕晨等，對於你們的幫助在此表示最大的感激與謝意。還要感謝從大學時期 到碩士班的同學嘉麒，對於我的實驗提供許多的建議與方向。另外還有時常聯絡 並陪伴著我的安娜，感謝你的包容與支持。

最後以此論文呈獻給我最摯愛的父母，您們對於長年在外的我給予了最大的 包容與疼愛，使我在研究期間無後顧之憂，終使取得了碩士學位。

總之，要感謝的人太多，特在此對於曾經幫助及關心過我的每個人致上十二 萬分謝意，同時也祝福你們平安順心。感恩。

V

中文摘要

牛樟芝(Antrodia camphorata)，又稱樟芝、牛樟菇、樟菇等，含有豐富有效 成分，早期被原住民做為解毒、解酒等常用之食用藥材。依文獻所載，牛樟芝有 效成分中較多數是屬脂溶性，直接食用的吸收程度不佳，為了提高牛樟芝食用之 效能，因此想利用超臨界萃取方法來取得其中之三萜成分。本研究利用人工發酵 牛樟芝及野生牛樟芝作為萃取三萜類成分的來源，使用酒精靜置、震盪萃取及超 臨界二氧化碳流體萃取方法，並藉由改變操作上的一些變因及利用反應曲面法探 討超臨界萃取的最佳條件。在超臨界流體萃取的實驗操作，以填充樟芝粉末量為 6 g 、萃取時間 30 min 及起始萃取壓力 350 bar 、溫度為 55 ^oC 和 60% 酒精 作共溶劑為最適的條件。以上述超臨界條件對其餘人工培養的樟芝組別進行萃取，

其 所 萃 取 出 的 三 萜 量 皆 顯 著 的 多 於 酒 精 靜 置 及 震 盪 萃 取 。 在 清 除 DPPH (α,α-Diphenyl-β-picrylhydrazyl) 的能力上，經超臨界萃取後的各組其清除 DPPH 的能力皆比其他兩種萃取方法差。利用 High performance liquid chromatography (HPLC) 分析超臨界萃取人工培養樟芝之成分，主要為低極性之成分。而未來可 對此些成分做進一步的鑑定與分析。

關鍵字：牛樟芝、超臨界二氧化碳萃取、三萜類

VI

英文摘要 Abstract

Antrodia camphorata, can be called Antrodia mushroom or Lauraceae mushroom, and it has rich bioactive components and was taken by early aborigines as common edible herbs for hangover and detoxification. According to the other thesis, Antrodia camphorata most bioactive components are fat-soluble, for improve the edible effectiveness. Therefore, using supercritical extraction method to get triterpenoids components. Ethanol extraction, ethanol concussive extraction and supercritical fluid extraction (carbon dioxide) are used to extract triterpenoids components from cultured and wild Antrodia camphorata to find out the optimum supercritical extraction condition through operation variable changes and Response surface methodology.

From the comparisons show that the best condition for supercritical extraction is 6g Antrodia camphorata powder, 30 min for extraction and 350 bar as the initial extraction pressure, 55°C as the operation temperature and 60% ethanol as the co-solvent. As described above of Supercritical conditions extraction for the remaining groups of cultured Antrodia camphorata, which extracted the triterpenoids are remarkable greater than the ethanol extraction and concussive extraction. The ability to scavenging DPPH, which the supercritical extraction on various group were worse than the other two extraction methods. The components of cultured Antrodia camphorata of supercritical extraction on HPLC, which major were low polarity components. The further identification and analysis of those components in future.

Keyword: Antrodia camphorata、Supercritical carbon dioxide extraction、

Triterpenoids

VII

目錄

致謝... IV 中文摘要... V 英文摘要... VI

前言... 1

第一章 文獻回顧 ... 2

第一節、牛樟芝介紹... 2

第二節、超臨界流體介紹... 9

第三節、反應曲面法... 25

第二章 實驗動機、目的與架構 ... 27

第一節、實驗動機與目的... 27

第二節、實驗架構... 28

第三章 實驗材料與方法 ... 30

第一節、實驗材料... 30

第二節、實驗方法... 33

第四章 結果與討論 ... 44

第一節、結果... 44

第二節、討論... 65

第五章 結論與未來展望 ... 66

第一節、結論... 66

第二節、未來展望... 67

第六章 參考文獻 ... 68

VIII

圖目錄

圖一、以人工固態培養之牛樟芝... 8

圖二、物質三相圖... 10

圖三、在不同狀態下之分子間勢能與平均分子動能關係圖... 16

圖四、實驗架構圖... 29

圖五、超臨界系統圖... 34

圖六、齊墩果酸之標準曲線圖... 40

圖七、不同萃取方法對樟芝總三萜之影響... 49

圖八、不同樟芝量對超臨界萃取樟芝總三萜之影響... 50

圖九、超臨界不同萃取時間對樟芝總三萜之影響... 51

圖十、超臨界不同萃取溫度對樟芝總三萜之影響... 52

圖十一、超臨界不同萃取壓力對樟芝總三萜之影響... 53

圖十二、超臨界添加不同濃度共溶劑對樟芝總三萜之影響... 54

圖十三、起始萃取溫度、萃取壓力與共溶劑濃度對超臨界萃取牛樟芝總三萜萃取 量之反應曲面圖 ... 57

圖十四、不同萃取方式對不同牛樟芝總三萜量之比較... 59

圖十五、不同萃取方法對不同牛樟芝樣品清除 DPPH 之影響 ... 60

圖十六、不同萃取方法下萃取 AC-1 及 AC-2 之 HPLC 分析圖 ... 61

圖十七、不同萃取方法下萃取 AC-3 及 AC-C 之 HPLC 分析圖 ... 63

IX

表目錄

表一、常用的超臨界流體及其臨界參數... 11 表二、超臨界流體與其他流體的傳遞性質... 13 表三、牛樟芝來源... 32 表四、最適超臨界萃取總三萜量之 RSM 三變數 - 三階層之中心旋轉組合設計

... 39 表五、牛樟芝三萜之 HPLC 分析條件 ... 43 表六、超臨界萃取牛樟芝總三萜之最適萃取條件探討三變數三階層反應曲面實驗

結果 ... 55 表七、超臨界萃取牛樟芝總三萜之最適萃取條件反應曲面試驗設計之變方分析

... 56

1

前言

俗稱臺灣紅色國寶的牛樟芝 (Antrodia camphorata)，是臺灣特有的真菌，由 於其子實體僅生長於臺灣一級保育牛樟樹 (Cinnamomum kanehirai Hayata) 腐朽 的中空內部，成長速率緩慢，故甚為珍貴 (Hsu et al., 2006)。而牛樟芝除了數量 稀少外最珍貴的是它具有的特殊三萜類為其他植物所沒有，且具有許多生物活性 如抑癌、解毒、保肝及降血壓等等，其中的功能機制，也陸續被研究學者證實 (沈 等，2001；Song and Yen, 2002；劉，2002；Lee et al., 2002；宋，2003)。

而以傳統的萃取方法存在著耗時耗能、溶劑用量大、會有溶劑殘留及生產成 本較高等缺點 (楊等，2009)，相較於超臨界二氧化碳流體萃取，其擁有多項優 點，諸如無毒性、溶劑殘留、步驟簡單、選擇分離效果好、萃取率高、有利於脂 溶性物質及熱敏感性物質的萃取等優點 (林，2004)，目前也正不斷的往食品、

石油、醫藥、化工等領域之工業化生產邁進 (張，2000；張等，2005，Stahl et al., 1998)。

以超臨界二氧化碳流體萃取牛樟芝並分析其總三萜含量，而超臨界萃取條件 以一次一變因的方式及反應曲面法來探討最適條件，起始操作的條件如下，為牛 樟芝量 6 g、萃取時間 30 min、萃取溫度 45^oC、萃取壓力 250 bar 及共溶劑濃 度 60% 酒精。

超臨界萃取近年在食品等工業上的應用愈來越受到重視，並將其無溶劑殘留 及高萃取率等優勢應用於牛樟芝成分的萃取上 (Smith et al., 1999)。過去研究指 出牛樟芝含有豐富的三萜類化合物，但三萜類成分較多數是屬於脂溶性，以傳統 方法萃取的效率不佳 (Brinkhaus et al; Li et al., 2005; Ming et al., 2007)。為了提高 牛樟芝三萜類萃取之效能，因此想利用超臨界萃取的方法取得其成分，並探討最 適的萃取條件。

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第一章 文獻回顧

第一節、牛樟芝介紹

俗稱臺灣紅色國寶的牛樟芝，在臺灣民間又稱為樟芝、樟菇、樟菰、樟內菰 或牛樟菇，是臺灣特有的真菌，由於僅附著在臺灣特有的牛樟樹 (Cinnamomum kanehirai Hayata) 中空樹幹內部，且其生長速率很慢，故甚為珍貴 (Hsu et al., 2006) 。最早發現牛樟芝的為臺灣的原住民，相傳原住民在採伐時，無意間發現 牛樟樹洞中的牛樟芝，食用後感到精神極佳；再者，原住民發現在大量飲酒後食 用牛樟芝可解宿醉並治療因飲酒過度所造成的肝臟病變，因此牛樟芝被原住民視 為珍寶 (林，1993)。

牛 樟 芝 為 臺 灣 特 有 生 物 。 只 生 長 於 特 定 的 宿 主 牛 樟 樹 (Cinnamomum kanehirai Hayata) 上，牛樟樹亦為臺灣特有生物，因瀕於滅絕，而被列為一級木 保護，牛樟芝僅長於其上，故更顯其珍貴。此外牛樟芝之受矚目乃是因傳說為原 住民之藥草，有保肝、抗癌的功效，加上全球發展草藥意識抬頭及國內人為炒作 所致，一時之間遂蔚為風潮。

1. 牛樟芝分類

牛樟芝在分類上屬於真菌界 (Fungi)、擔子菌門 (Basidiomycota)、擔子菌亞 門 (Basidiomycotina) 、 同 擔 子 菌 綱 (Homobasidiomycetes) 、 無 褶 菌 目 (Aphyllophorales)、多孔菌科 (Polyporaceae)、薄孔菌屬 (Antrodia) (Chang and Chou, 1995)。

2. 牛樟芝的命名

牛樟芝最早是在 1990 年由臧穆及蘇慶華教授於大陸雲南發表，因當時裝牛 樟芝的袋子中同時裝有其它的靈芝，因牛樟芝受到靈芝孢子的污染，導致鑑定時 以此孢子列入分類的依據，故將牛樟芝歸類為靈芝屬，命名為 Ganoderma camphoratum；但後來經林業試驗所張東柱博士重新鑑定，針對子實體的型態及 真菌的培養基特性，重新歸類為薄孔菌屬，命名 Antrodia cinnamomea (Chang and Chou, 1995)；而為了避免一株菌同時擁有兩個名字容易造成誤解，按先發表者種 名得以保留的國際通則，而後吳和張氏於 1997 年再次以組合的方式將其命名為 Antrodia camphorata。

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3. 牛樟芝的性狀

牛樟芝為多年生，外形平伏，無柄，邊緣反卷，呈圓狀、鐘狀或不規則狀，

與牛樟木接觸面緊且寬，蕈肉分兩層，表面散佈著菌孔，每毫米約有 4 ~ 5 個，

新鮮時表面呈橘紅色或橘褐色，老化時則會變成褚黑色。擔子柄呈棍棒狀，12 ~ 14 × 3.0 ~ 5.0 μm，擔孢子的型態呈平滑無色之透明微彎柱形，3.5 ~ 5.0 × 1.5 ~ 2 μm (高，1992；Chang and Chou, 1995)。

4. 牛樟芝的化學成分

牛 樟 芝 所 含 的 化 學 成 份 有 多 醣 體 (polysaccharides) 、 三 萜 類 化 合 物 (triterpenoids)、超氧歧化酶 (superoxide dismutase)、腺苷 (adenosine)、蛋白質、

維生素、菸鹼酸、微量元素 (如鈣、磷)、核酸、胺基酸、固醇類 (steroids)、木 質素 (lignin)、血壓穩定物質 (如 antrodia acid)、酚類 (phenolic content) 等 (Shu and Lung, 2008)。

(1) 多醣體

多醣體是由數十萬到數百萬的單醣類 (如：葡萄糖) 等組合而成。其最 主要的功能為增加人體的自然免疫力、對癌症有抑制及預防的效果，不過多 醣體的抗癌作用並非是直接對癌細胞抑制或攻擊，而是間接透過巨噬細胞、

Ｔ 細胞、Ｂ 細胞及殺手細胞等，來增強免疫系統之功能，進而達到與癌細 胞對抗之功效。主要功用： a. 強化細胞間的傳遞活性，尤其是免疫細胞間。

b. 活化體內巨噬細胞，並促其進行吞噬作用。 c. 強化參與細胞活化的細胞 激素 - 介白質素 interleukin (IL-1 、 IL-2) 與干擾素之生產。 d. 增加免疫 機能進而抑制癌細胞增殖 (水野和川合，1997；張，2004)。

(2) 三萜類

三萜類化合物是由六個異戊二烯單位 (isoprene) 組成，分子組成的通式 為 (C₅H₈)_n，難溶於水，易溶於親脂性的有機溶劑。線性結構的三萜類是鯊 烯 (Squalene)，是鯊魚肝油的主要成分，也是膽固醇的前驅物。鯊烯經過生 化反應可以產生環形結構，主要形式有四環三萜與五環三萜。而四環三萜有 羊毛甾醇 (lanosterol) 與麥角烷 (ergostane) 兩種結構。四環三萜與五環三萜 在很多中草藥中都可發現，例如靈芝、人蔘、牛樟芝、栝樓、雷公根、黃毛

4

楤木等 (Brinkhaus et al., 2000; Hsu et al., 2005a; Li et al., 2005; Ming et al., 2007; Tian et al., 2006; Yang et al., 2007)。

牛樟芝的特殊在其所含的三萜類是其他植物所沒有，在動物界也是為數 不多，而研究指出三萜類化合物具有一些生理調節功能，例如抗發炎、保護 肝臟、止痛、抗微生物、抗黴菌、與抑制病毒 (Yang et al., 2007)。研究指出 三萜類 dehydroeburicoic acid 具有抑制神經膠原瘤細胞及白血病細胞生長 與促進細胞凋亡的效果 (Deng et al., 2009 ; Du et al., 2012)。因此其具有潛力 被開發為醫療用品，是近年來最熱門的保健食品之一。目前針對牛樟芝生物 活性物質的研究主要著重在大分子的多醣體及小分子的三萜類和固醇類。其 中三萜類在生物活性方面的研究指出很多三萜類化合物都有抗發炎的能力，

包括 zhankuic acid、antcin K、antrocamphin A and B、dehydroeburicoic acid、

eburicol 和 ibuproden 等 (Chen et al., 2007;Shen et al., 2004)。

5. 生理功能

(1) 毒殺癌細胞

陳和楊在 1995 年分析牛樟芝子實體之三萜類時，發現 Zhankuic acid A 及 Zhankuic acid C 對 小鼠淋 巴 癌細胞 (P-388 murine lymphocytic leukemia cell) 具有毒殺作用，其半數毒殺濃度 (IC50) 分別是 1.8 μg/ml 及 5.4 μg/ml。而陳等人於 2001 年以牛樟芝子實體之熱水萃取物進行人體 癌細胞的抗癌測試，發現具有抗子宮頸癌、胃癌、肝癌及乳癌的能力。而 菌絲體和子實體的抗癌能力比較實驗中，如分別以子實體及菌絲體的甲醇 萃取物處理人類肝癌細胞株 HepG2 及 Hep3B 48 小時，子實體萃取物抑 制癌細胞能力較菌絲體萃取物強達五倍以上。並以細胞形態的變化 (細胞 萎縮、胞膜芽生及凋亡小體等) 及處理後細胞 DNA 呈規則性斷裂等現象，

認為牛樟芝毒殺肝癌細胞的作用方式應為誘導其產生凋亡 (apoptosis) (宋，

2003)。

(2) 抗病毒能力

牛樟芝菌絲的熱水萃取多醣體，在 50 μg/ml 的濃度下對 B 型肝炎病 毒表面抗原的抑制率為 32.2 ~ 51.6%，都比 α- 干擾素濃度為 250 U/ml 時 高，而且最高者還比 α- 干擾素為 1000 U/ml (50.4%) 還要高；而在同樣

5

濃度下對 B 型肝炎病毒抗原的抑制率，也都比 α- 干擾素濃度 100 U/ml 時為高，較高的兩個組別 B86 (31.1%)、35398 (31.6%) 比 α- 干擾素濃度 在 250 U/ml (21.2%) 的抑制率還高 (Lee et al., 2002)。

(3) 殺菌能力

牛樟芝子實體的甲醇萃取物可抑制 Staphylococcus aureus 和鬚瘡小 芽癬菌之生長 (簡等，1997)。而深層發酵濃縮液對 Bacillus cereus、

Staphylococcus aureus 及 Yersinia enterocolitica 有 殺 菌 作 用 ， 對 Escherichia coli 也有抑菌作用 (徐等，2000)。培養牛樟芝菌絲時，如採對 峙培養的方式，可以發現牛樟芝對 Laetiporus sulphreus、Gloeophyllum trabeum、Antrodia taxa、Lenzites betulina、Trametes versicolor、Ganoderma austral、Colletotrichum gloeosporioides、Pestalotiopsis funere 等菌都具有抑 制其生長的效果，在洋菜培養基上培養牛樟芝菌絲時，如有不慎污染雜菌 的情形，雜菌通常會受到牛樟芝菌絲的抑制，並被擴張的菌絲所覆蓋 (吳，

2002)。可見牛樟芝的抑菌範圍是很廣泛的。

(4) 保護肝臟

動物實驗中，如先以 DMF 餵食大白鼠 5 天後，再以四氯化碳誘導 急性肝損傷，血清中肝損傷指標 ALT (Alanine Aminotransferase)、AST (Aspartate Aminotransferase) 值會因之下降，再從組織切片中可明顯看出四 氯化碳所造成的嗜中性白血球浸潤 (neutrophil infiltration)、水泡性腫大 (hydropic swelling) 及壞死 (necrosis)，會因餵食 DMF 而顯著降低，且肝 臟 組 織 中 的 抗 氧 化 解 毒 酵 素 GST (Glutathione S-transferase) 、 GPx (Glutathione peroxidase)、GR (Glutathione reductase)，會因為先服用 DMF 而保持了較高比率的活性 (Song and Yen, 2003)。沈等在 2001 年測試牛樟 芝的 FEMA (Fermented extract of mycelia of Antrodia camphorata) 時，亦在 大白鼠的 GPx、GRd、GST 活性及血清 ALT、AST 值，都有比對照組較 好的結果。

(5) 抗氧化能力

以菌絲體和子實體抗氧化能力比較中，黃於 2000 年的研究報告中分

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別以甲醇萃取物進行分析，抗氧化力、脂質過氧化物的抑制、自由基 (DPPH‧) 的捕捉及鐵離子的還原能力，不論是新鮮或風乾後的子實體都 優於菌絲體；而自由基 (O₂^－‧, OH^－‧) 的捕捉能力方面，菌絲體是介於新 鮮或風乾子實體之間；而在螯合亞鐵離子部分是以菌絲體最好。牛樟芝菌 絲體的水萃取物可保護紅血球減少溶血的現象，且隨水萃取物的濃度提高 保護效果會更好；並能減少人類臍帶血管內皮細胞因自由基所造成的膜蛋 白改變 (Hseu et al., 2002)。

(6) 降血糖能力

牛樟芝發酵液或菌絲體亦具有降低血糖之效果，在進行葡萄糖口服糖 耐量試驗，可降低血漿中胰島素與葡萄糖濃度，且發現發酵液具有降低血 脂異常的趨勢與改善肝臟的氧化壓力，故對於糖尿病患者具有正面的保健 效果 (嚴，2001)。

6. 牛樟芝培養方式

目前牛樟芝的來源主要有野生、液態培養、太空包及椴木培養四種方式。

(1) 野生的牛樟芝其生長的時間較長，三萜類成分含量較多且豐富，但價格 高昂且不易取得。

(2) 液態培養為目前市面上最常用於牛樟芝的生產方式，優點為培養時間短，

可以大量生產牛樟芝的多醣體，但在液態培養下生產出的三萜類化合物 量及種類都遠不及野生的牛樟芝。

(3) 在太空包培養方面，為四種培育方式中成本最低，但培養出的牛樟芝的 成份比椴木培養的還少，且太空包培養基質不同，代謝路徑也會不一樣，

得到的三萜類成份亦不同。

(4) 椴木培養部分，培養之牛樟芝成分與野生的較為接近，但其牛樟椴木取 得不易，所費時間及成本也較昂貴 (Lin et al., 2006)。

嘗試以人工固態培養基模擬牛樟芝在牛樟樹上生長之環境，在人工培養基質 中加入牛樟木萃取液可提高牛樟芝的生長優勢，增加牛樟芝菌絲的生長量也有助 於抑制其他雜菌生長以避免汙染 (施，2009；許等，2000)，為萃取液中所含的 牛樟精油可促進牛樟芝菌絲的生長及抑制其他雜菌之生長。

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7. 牛樟芝萃取相關研究

羅在 2013 年分別以酒精萃取、水萃取及超臨界萃取對皿式培養的牛樟芝進 行萃取，並比較其有效成分的萃取量，在酒精萃取條件以 95% 酒精、溫度 45^oC、

萃取時間 24 小時可得到最多量的有效成分 3.69 mg/g，以超臨界條件 60% 酒 精作共溶劑、萃取壓力 250 bar、溫度 45^oC 進行萃取可得有效成分量為 28.99 mg/g。

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圖一、以人工固態培養之牛樟芝1

Fig. 1 Antrodia camphorata cultured by artificial solid-state fermentation (拍攝至兆豐生技)

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第二節、超臨界流體介紹

物質存在著氣、液、固三種狀態，當控制溫度及壓力達到某一特定點時，其 氣-液兩相的密度趨於相同。而此一特定點即定義為該物質的臨界點如圖二。

每一種純物質都有其固定的臨界溫度 (Critical Temperature，Tc) 和臨界壓力 (Critical Pressure，Pc)，在增加壓力至臨界點以上時，使溶劑從氣體變為液體時 所需要的最高溫度稱為臨界溫度；在臨界溫度時，使溶劑由氣態變為液態時所需 要的最小壓力稱為臨界壓力。而該物質的溫度和壓力皆達到或超過臨界點時，便 會處在超臨界的狀態，形成超臨界流體 (Supercritical Fluid，SCF)。SCF 是指其 溫度及壓力皆超過物質本身的臨界溫度和臨界壓力時的流體。SCF 兼具有氣體 和液體的優點，其黏度遠小於液體，只有氣體的幾倍，密度接近液體；擴散係數 比液體大約 100 倍，因而易於傳質；此外 SCF 也具有低的表面張力，較容易 透過微孔介質材料，表一為常用的超臨界流體及臨界參數 (張，2000；張等，2005；

彭等，2005)。

SCF 具有選擇性溶解物質的能力，而且其溶解力會隨著超臨界條件 (如溫 度、壓力) 而改變，因此在 SCF 的狀態下，可以有選擇性地從混合物中溶解出 某些成分，然後透過升溫減壓或吸附將其成分分離析出，而這種萃取分離方式稱 為 Supercritical Fluid Extraction (SFE)。當以一般的萃取方法分離具熱敏感性的成 分時，容易破壞熱敏感性成分，然而以 SFE 技術，選擇適當的溶劑即可在較低 的溫度下操作，如使用溶劑 CO₂，其操作溫度為接近室溫的 31.3^oC，操作溫度 低，適合用於分離含有熱敏感性成分的原料，此項特性對於食品工業應用上十分 重要。在食品工業中，分離後之產品要求不但純度要高，也不能含有有毒物質，

而一般萃取技術往往不能滿足這些要求，但 SFE 卻可實現產品中無溶劑的殘留。

在 SFE 中應用最多的是超臨界 CO₂ 流體萃取，常用於親脂性且相對分子質量 較小的藥物的萃取，而對於極性大、相對分子質量大的天然產物，則需添加共溶 劑或使用較高的壓力 (張，2000；張等，2005)。

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圖二、物質三相圖2

Fig. 2 Three phase diagram of pure substance (劉，2003)

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表一、常用的超臨界流體及其臨界參數 1

Table 1. Commonly used of supercritical fluid and critical parameters (Filippi, 1982)

流體

偶極距 μdm

(debyes)

臨界溫度 (^oC)

臨界壓力 (atm)

臨界密度 (g/mL)

CO2 0.00 31.3 72.9 0.47

H2O 1.84 374.2 217.6 0.32 CH3OH 1.70 239.4 79.9 0.27 C₂H₅OH 1.70 243.4 63.0 0.28 N2O 0.17 36.5 72.5 0.45 NH3 1.47 132.5 112.5 0.24

SF6 0.00 45.5 37.1 0.74

CHF₃ 1.47 25.9 46.9 0.52

n-C3 0.00 152.0 37.5 0.23 n-C4 0.00 152.0 37.5 0.23 n-C5 0.00 196.6 33.3 0.23 CCl₂F₂ 0.17 111.8 40.7 0.56 C2H2F4 1.83 101.2 37.2 0.51

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1. 超臨界流體技術的歷史

關於 SCF 的發現和研究，至今已有近 200 年的歷史，但是將 SCF 應用在 醫藥、化工、石油、食品等方面的研究僅有近幾十年的歷史。早在 1822 年，

Baron Cagnigard de la Tour，就以耐高壓之砲管進行實驗，並發現在某個溫度時，

砲管內的氣體與液體混合成為一相，早期稱此點為 Baron Cagnigard de la Tour Point。在 1850 年英國女王學院 Andrew 博士即研究 CO₂ 的超臨界現象，而在 1869 年時 Thomas Andrews 發現了二氧化碳的重要臨界參數，其臨界壓力和臨 界溫度分別為 7.20 MPa 和 304.065 K，其結果已和目前公認值 7.185 MPa 和 304.265 K 相當的接近 (張，2000；張等，2005， McHugh and Krukonis, 1986)。

1879 年，英國科學家 Hannay 和 Hogarth 將乙醇放置於小直徑的玻璃管內，

並藉由改變壓力使乙醇達到超臨界的狀態，並將此流體稱為超臨界流體，並發現 了 SCF 溶解固體物質的能力主要仰賴於壓力的大小。而在 Hannay 之後，科學 家又陸續發現許多的超臨界溶劑，例如 N₂、SO₂、N₂O 等。1978 年在原西德首 次舉行的 SCF 技術研討會，該會議不但對該技術的推廣與應用有莫大的影響，

也促進許多相關研究的發展。1988 年國際型的超臨界學術期刊『超臨界流體學 報』 (Journal of Supercritical Fluids) 正式出版，同年在法國 Nice 召開了第一屆 世界超臨界流體學術研討會。而目前超臨界流體萃取技術也正不斷的往食品、石 油、醫藥、化工等領域之工業化生產邁進 (張，2000；張等，2005，Stahl et al., 1998)。

2. 超臨界流體特性

當物質處在其臨界溫度和臨界壓力以上的狀態時，再對其狀態的氣體加壓，

氣體並不會產生液化，只是密度會變大且具有類似液態性質，還能同時保有氣體 的性能，在這種狀態的流體稱為 SCF，其表現出以下幾個方面。在表二中列出 超臨界流體的密度、擴散係數以及黏度與一般氣體、液體的比較 (張，2000；張 等，2005；彭等，2005)。

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表二、超臨界流體與其他流體的傳遞性質2

Table 2. Transmission nature of Supercritical fluid and other fluid (Filippi, 1982)

性質

氣體 SCF 液體

101.325 kPa 15 ~ 30^oC

T_c , P_c T_c , 4P_c 15 ~ 30^oC 密度

(g/cm³) (0.6~2) × 10^-3 0.2~0.5 0.4~0.9 0.6~1.6 黏度

g/ (cm×s) (1~3) × 10^-4 (1~3) × 10^-4 (3~9) × 10^-4 (0.2~3) × 10^-2 擴散係數

(cm²/s)

0.1~0.4 0.7 × 10^-3 0.2 × 10^-3 (0.2~3) × 10^-5

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(1) 密度

超臨界流體具有可壓縮性，其密度會隨壓力的增加而變大，當控制在適 當的壓力下，其密度相當於液體的密度。在臨界點以上的流體皆有其臨界密 度 (Critical Density，dc)，且超臨界流體的密度比氣體的密度要大數百倍，其 數值與液體相當。

(2) 黏度

超臨界流體的黏度極小，與氣體的黏度相當，但比液體小兩個數量級，

其具有良好的傳遞性與快速的移動能力，因此它能快速擴散進入溶質的內 部。

(3) 擴散

超臨界流體的擴散系數介於氣體與液體之間，大約是氣體的 1/100，比 液體的要大數百倍，因此比液體的傳質好，並具有良好的滲透力。

(4) 溶解

超臨界流體相對於不同的溶質，在不同的溫度和壓力下，其溶解性會不 同。一般以接近液體密度狀態的超臨界溫度和壓力為條件，其溶解性最高，

是常溫常壓條件下溶解性的 100 倍以上。此外，極性溶劑與非極性溶劑的超 臨界狀態溶解性對溶質亦具有選擇性，如超臨界 CO₂ 溶劑單獨使用時為非 極性，一般對於分子量較小的脂溶性物質具有良好的溶解性。而對於大分子 之極性物質，可在 CO₂ 流體打入的同時添加共溶劑 (如乙醇)，即可將溶質 溶解。

(5) 選擇

超臨界流體具有選擇提取不同物質的特性。在同一種植物中往往有兩種 以上不同的化合物組分，一般要單獨提取某種組分，需要選擇性提取，超臨 界流體可在不同的溫度、壓力、共溶劑條件下，完成不同成分的單獨提取。

不同種類的溶劑，對不同性質的溶質具有選擇性，如酯類、醚類、酮類的溶 質適合用非極性的溶劑提取，而苷、堿、糖等溶質適合用極性溶劑提取。超 臨界 CO₂ 在常溫下不能提取水，當溫度升高時，溶解度會提高，水就可以 被提取出來。當溶質在分子量、蒸氣壓和極性上有明顯差異時，可進行分步 萃取。

(6) 導熱

在臨界點附近，物質的熱導率對溫度和壓力的變化十分敏感。在超臨界

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條件下，若壓力衡定，隨溫度升高，熱導率先減小至一個最小值，然後增大；

若溫度衡定，熱導率隨壓力升高而增大。對於對流傳熱，包括強制對流與自 然對流，當溫度和壓力較高時，容易產生自然對流。如超臨界 CO₂ 在 38^oC 時 ， 只 需 3^oC 的 溫 差 即 可 引 起 自 然 對 流 。 再 進 一 步 以 分 子 間 勢 能 (intermolecular potential) 和平均分子能量 (average molecular energy) 的觀點 來討論氣相、液相及超臨界流體狀態下分子的行為如圖三所示。

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圖三、在不同狀態下之分子間勢能與平均分子動能關係圖 3

Fig. 3 In different states of intermolecular potential and average molecular energy graph (Saito et al., 1994)

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在分子處於液態時由於分子與分子間的能量較為穩定，所以平均分子動能小 於分子間相互吸引的位能，這也就是液態分子間距離較小的原因。而分子處於氣 態時，分子獲得足夠的能量，使得平均分子動能大於分子間相互吸引的位能，所 以氣體分子大多都有足夠的能量來脫離，所以在氣態時分子間的距離較大且能自 由膨脹其體積。在超臨界流體的臨界溫度附近，其分子動能大約分佈在平均動能 附近，因此一些分子能夠自由的移動，另一部份則因動能不足而被限制在 potential well 中，因此造成了所謂的群聚 (Clusters) 現象 (Saito et al., 1994 ；劉，

2003)。

當一溶質分子處於超臨界流體中，若此分子與溶劑間之引力大於溶劑與溶劑 之間的引力時，該分子會被周圍的溶劑分子所包圍，稱為群聚效應，因此溶質與 溶劑間的吸引力大於溶劑分子間的吸引力時，就會產生群聚現象；群聚現象目前 已被認為是超臨界流體增加溶解能力的主要原因之一，此現象可由光譜儀所測得 的波長變動加以證實 (Saito et al., 1994)。

3. 超臨界二氧化碳特性介紹

二氧化碳的臨界溫度 (Tc = 31.06 ^oC)、臨界壓力 (Pc = 7.39 MPa) 如圖一，

在超臨界溶劑中比較適中的，其 CO₂ 的臨界密度 Dc (0.448 g/cm³) 是常用超臨 界溶劑中最高的 (合成氟化物除外)。因此其臨界溫度相近於室溫，且操作溫度 低，可減少對於熱敏感的物質的破壞，如酵素、天然藥物等生化物質，適合用於 藥品、天然物以及食品方面的萃取，且二氧化碳在常壓下為氣體，因此以 CO₂ 當 溶劑萃取後，經減壓程式即會變回氣相，因此可以有效將溶劑與溶質或其他固、

液相有效完全分離，固可以將 CO₂ 經壓縮及冷凝後回收再利用 (張，2000)。

超臨界二氧化碳之特性如下： (林，2004)

(1) 超臨界溫度低 (31.06 ^oC)，低溫操作，不易改變或破壞熱敏感性成份；適 合熱敏感性物質的分離。

(2) 化學惰性、不含氧氣；不會起化學作用，不會改變或破壞萃取物中有效成 份。

(3) 無毒性、無殘留，在常壓下為氣體；所以很容易與產物分離，免去一次分 離產物與溶劑的手續。

(4) 無毒、無色、無臭、不可燃性、無腐蝕性、對人體無害；可降低操作時的 危險性。

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(5) 安全，即使洩漏也無太大的毒害危險問題。

(6) 二氧化碳高純度製備容易，且價格較其他溶劑低，且容易回收萃取物與二 氧化碳分離，係為節省能源的分離技術。

(7) 黏度低且溶質擴散係數高，易於輸送與攪拌操作。

(8) 功能性廣、可做為區分性之萃取及分離，可藉由調節萃取溫度及壓力以得 到各成份之最佳溶解度；或可藉由加入共溶劑，及使用高純度之二氧化碳，

而得到高純度之萃取物。

(9) 無殘留性，可防止產品受氧化並且有淨菌功能。

4. 超臨界流體基礎理論

影響超臨界流體性質最重要的因素即為溶解度參數，而密度更是溶解度參數 的重要變因超臨界二氧化碳流體的溶解能力受壓力和溫度的影響極大，在 1962 年代 Hildebrandt and Scott 首先提出用溶解參數 (solubility parameter) 加以解 釋。

1966 年 Giddings 等人利用凡得瓦爾方程式將此理論擴展成為適用超臨界 流體溶劑的公式 (1) ： (Hildebrand and Scott, 1963；Giddings, 1966)

δ = 1.25P_c^-1/2 (ρ_r/ρ_{r (liq)} ) (1) δ : 超臨界流體的溶解參數 (cal /cm³ ) ^{1/ 2}

Pc : 臨界壓力 critical pressure (atm)

ρr : 對比密度 reduced density in supercritical state (=ρ/ρ_c) ρr (liq) : 流體液態時的對比密度 reduced density in liquid state

( =ρr/ρr ≈ 2.66) Ρ : 超臨界流體的密度

ρc : critical density 達到臨界溫度與壓力時流體的密度

由上式將 ρ 與 ρ_c 與代入可得公式 (2) ：

δ = 1.25Pc ^(-1/2) ρ/2.66 = 0.47Pc^-1/2ρ (2) 因此我們可以知道 δ 與流體液態時的對比密度之間成正比關係，而物質的 密度又與其溫度、壓力有關，所以當物質的溫度或壓力有所改變時，皆會影響其 溶解度參數 (劉，2003)。

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5. 共溶劑的添加

超臨界 CO₂ 流體對極性極強的溶質溶解能力明顯不足，這將限制該分離技 術的實際應用。為了增加 CO₂ 流體的溶解性能，人們發現在 CO₂ 流體中加入 少量第二溶劑，可能大大地增加其溶解能力，特別是原來溶解度很小的溶質。這 種第二組溶劑稱為共溶劑、提攜劑、修釋劑或夾帶劑 (張，2000)。共溶劑又分 為極性共溶劑及非極性共溶劑，由於極性共溶劑與極性溶質分子間的極性力，形 成氫鍵或其他特定的化學作用力，可使某些溶質的溶解度和選擇性有很大的改善，

而非極性共溶劑與非極性溶質的分子間作用力主要是色散力，它與分子的極化率 有關，極化率越大，色散力越大。

共溶劑在超臨界 CO₂ 流體萃取的作用如下： (張等，2005) (1) 增加被分離成分在超臨界流體中的溶解度。

(2) 加入與溶質起特定作用的共溶劑，可使該溶質的選擇性提高。

(3) 增加溶質溶解度對溫度、壓力的敏感度，使被萃取成分在操作壓力不變的 情況下，適當的提高溫度，就可使溶解度大大降低，從循環氣體中分離出 來，以避免氣體再次壓縮的高能耗。

(4) 共溶劑可用作反應物。

(5) 能改變溶劑的臨界參數。

而使用共溶劑添加方式有三種： (陳，2000) (1) 預先混合好比例的共溶劑鋼瓶：

這種方式可混合多種共溶劑，以達到更好的萃取效果，且方便於動態超 臨界流體萃取的操作，但隨著時間的增加，對於共溶劑與流體的混合比例會 有所改變，且更換不同混合比例之共溶劑，所需鋼瓶之花費較多。

(2) 將共溶劑添加至原料上：

此種方式對於動態超臨界萃取的操作並不適合，因為隨著萃取時間的增 加，共溶劑會被流體帶出而逐漸減少，因而影響共溶劑和流體混合的比例。

但此方法為最方便添加共溶劑之方式，且花費之成本較低，適於實驗條件之 探討。

(3) 使用雙幫浦系統：

此方法由一個幫浦提供流體，另一幫浦提供高壓的共溶劑，兩者與混合

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管中予以混合。此方式雖然可以隨意調整共溶劑與流體的混合比例，但需多 購買一幫浦。

6. 超臨界流體萃取方式

利用超臨界流體萃取的方式主要有三種： (林，1991) (1) 靜態萃取方式

此種方式為溶劑靜置萃取。主要步驟是將萃取槽封閉後加溫加壓至所需 溫度和壓力，待系統達平衡後，靜置一段時間進行萃取，再打開閥件而將萃 取物沖出並同時與溶劑分離，此方法之優點為流體消耗量少、缺點為無法有 效的完全萃取出所需的萃取物。

(2) 動態萃取方式

此種方式為利用溶劑進行多次萃取。主要步驟是於萃取槽的入口加裝一 壓力控制器以保持萃取槽中的壓力，並控制超臨界流體以一定的流速流經萃 取槽，不斷以新鮮的超臨界流體進行連續萃取，此方法之優點為有效的完全 萃取出所需的萃取物、缺點為流體消耗量大。

(3) 靜態－動態萃取方式

此種方式為靜態萃取與動態萃取組合在一起的方式。主要步驟為先做一 段時間的靜態萃取，而後進行動態萃取。如此一來，萃取效率會比靜態萃取 的方式高且流體的消耗量會比動態萃取的方式較少。

7. 超臨界流體萃取裝置與儀器

一般而言，主要有流體來源、高壓幫浦、萃取槽、限流器和收集裝置等五大 部分： (劉，1997)

(1) 流體來源 (Fluid Source)

一般操作流體大多以內裝液態流體的高壓鋼瓶所提供，再根據操作需要 而選擇不同流體，及其純度等級，如需進一步純化流體，則可以在流體與幫 浦之間放置過濾器以去除雜質。

(2) 高壓幫浦 (Pump)

高壓幫浦是超臨界流體萃取裝置的核心，價格也是最昂貴的，在整個萃 取運轉的過程中佔有舉足輕重的地位。大多數以壓力或密度控制的方式輸出 流體，且針對使用上的需要，高壓幫浦頇具備加壓過程時間短、加壓過程穩

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定、高壓狀態時能穩定提供流體，而現今實驗室所使用的超臨界流體裝置的 高壓幫浦有針筒式幫浦 (syringe pump) 和往復式幫浦 (reciprocating piston pump) 二種。

(3) 萃取槽 (Extraction Vessel)

萃取槽為放置樣品的地方，其材質需能耐高壓且不能與樣品中物質反應，

又因在操作過程需時常打開以更換樣品，所以設計上主要以裝卸方便，且在 高壓狀態中不能有漏氣的現象產生為主要的訴求。

(4) 限流器 (Restrictor)

限流器的主要功能為一方面維持萃取槽內的壓力一定，另一方面則是為 穩定地控制流體排出的速度。

(5) 收集裝置 (Collection Device)

超臨界流體萃取裝置對於萃取物收集方式，可依標的物或共溶劑的特性 改變不同的收集裝置。

8. 超臨界流體在各項方面上的應用

超臨界流體經常應用在萃取、層析、反應、清洗、染色、分離與造粒等方面，

而下面為超臨界流體在各方面上的應用介紹：

(1) 在食品方面的應用：

過往大都利用水蒸氣蒸餾或有機溶劑萃取方式來獲得取這些成分，然而 一般植物至少含有上百種化合物，故欲正確萃取出所需之有效成分將十分困 難，且易產生熱敏感化合物之熱分解及水解作用和氫化反應等現象，並且因 使用有機溶劑於製造食品時，仍有部分停留在產品內之有機溶劑殘渣會對人 體產生重大傷害。因此低萃取溫度、無溶劑殘留、低氧化反應之特性使得超 臨界萃取技術相當合適應用於食品工業 (Nieto et al., 1993)。

在食品 工業上 以 超臨界 二 氧化碳 為 萃取溶劑 ，先從 1978 年德國 Bremen 公司使用超臨界二氧化碳萃取咖啡豆中之咖啡因成分，使咖啡因含 量由原本的 0.7~3% 降低至 0.02% 且依然存有咖啡原本之香味；同年，美 國 SKW 公司利用超臨界二氧化碳萃取法萃取啤酒中之苦味花成分以去除 苦味，其萃取率高達 99 % ，煙草中去除尼古丁，從蛋黃中萃取膽固醇，以 及萃取大蒜中的蒜油，而 2000 年義大利的 Boselli 則用來萃取純度高的不 飽和脂肪酸，1991 年法國 Pellerin 使用該法，從啤酒及葡萄酒中分離乙醇

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來製備無醇啤酒及無醇葡萄酒等 (Partt and Hudson, 1990；Pietta et al., 1998；

Wang et al., 1996)。

(2) 在天然物及藥品方面的應用：

超臨界萃取技術可用於中草藥有效成分的提取，熱敏感性生物製品藥物 的精製，及脂質類混合物的分離，從中草藥材中萃取出具有藥效的成份。其 應用的實例為萃取月桃、肉桂、砂仁、丁香、當歸等，中草藥的藥材所具有 藥效的成份 (Nieto et al., 1993；Partt and Hudson, 1990；Pietta et al., 1998；

Wang et al., 1996)。

在抗生素藥品生產中，傳統法常使用丙酮、甲醇等有機溶劑，但要將溶 劑完全除去，又不使藥物變質非常困難，若採用超臨界流體萃取法萃取則完 全可以符合要求。美國 ADL 公司從 7 種植物中萃取出治療癌症的有效成 分，並將其應用於臨床研究上 (Nieto et al., 1993)。

另外，用超臨界流體萃取法從魚的內臟，骨頭等提取的多烯不飽和脂肪 酸，從沙棘籽萃取的沙棘油，從蛋黃中提取的卵磷脂等對心腦血管疾病具有 獨特的療效。日本學者宮地洋等從藥用植物蛇床子、桑白皮、甘草根、紫草、

紅花、月見草中提取了有效成份。還有 2003 年德國的 Nagesha 等人及 2002 年美國的 Mendes 等人用於精製天然維生素 E、1998 年澳大利亞的 Badalyan 等人則用於精製人蔘精油 (Rice-Evans et al., 1997；越智，1996；

須田等，1997)。

(3) 天然香精香料的萃取：

從天然物中萃取精油、色素、高級香料、色素原料。其應用的實例為萃 取橘子皮中的精油及檸檬皮中的精油，以及黑胡椒辣味成份的萃取，啤酒花 中萃取啤酒花香精 (Nil, 1994；Marie-Helene et al., 1996)。

用超臨界流體萃取香料不僅可以有效地萃取芳香成分，而且還可以提高 產品純度，能保持其天然香味，如從桂花、茉莉花、菊花、梅花、玉蘭花、

玫瑰花中萃取花香精，從胡椒、肉桂、薄荷萃取香辛料，從芹菜籽、生薑、

莞荽籽、茴香、八角等原料中萃取精油，不僅可以用作調味香料，而且一些 精油還具有較高的藥用價值。啤酒花是啤酒釀造中不可缺少的添加物，具有 獨特的香氣、清爽度和苦味。傳統方法生產的啤酒花浸膏不含或僅含少量的

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香精油，破壞了啤酒的風味，而且殘存的有機溶劑對人體有害。超臨界萃取 技術為啤酒花浸膏的生產開闢了廣闊的前景，1983 年法國 Cal/Pfizer 公司 利用超臨界萃取法萃取啤酒花浸膏並轉為大規模之工業化生產，此外該公司 也大量使用超臨界技術來精製香料。美國 SKW 公司從啤酒花中萃取啤酒 花油，已形成生產規模 (賴等，2003；Partt and Hudson, 1990)。

(4) 天然色素的萃取：

天然色素是食品工業、化妝品工業和醫藥工業廣泛應用的著色劑。隨著 人類對合成色素的慢性毒性和致畸致癌性的認識，人們開始尋求自然。並且 天然色素本身就是營養源或具有比較強的保健功能，如 β - 胡蘿蔔素。利用 超臨界 CO₂ 流體萃取技術，可以避免萃取物在高溫下熱劣化，還保護了生 理活性物質的活性，並且能保持天然萃取物的天然風味 (張等，2005)。

(5) 化學工業方面的應用：

超臨界流體近來被利用以取代傳統有機溶劑之角色，目前普遍應用於利 用超臨界流體作為合成有機物質之催化劑，於超臨界流體中合成有機聚合物 等方面，此外超臨界流體還具有不易污染環境及化學性質安定等優點，實為 良好之有機溶劑取代 (萬，2005)。

其主要的應用為從煤炭中萃取出石油及從中去除瀝青，並從石油或煤炭 中萃取多環芳香烴化合物，在美國超臨界技術還用來製備液體燃料。此外，

從煤炭中還可以萃取硫等化工產品。美國最近研製成功利用超臨界二氧化碳 做為反應劑及萃取劑的新型乙酸製造方式。俄羅斯、德國還把超臨界流體萃 取法用於油料脫去瀝青技術。

(6) 生物工程方面的應用：

超臨界二氧化碳於生物分離的應用，是發現蛋白質可溶解在二氧化碳所 形成的反分子團 (reverse micelles) 後才開始應用的大門。生物分離技術之 目標產物具有高附加價值，可彌補超臨界二氧化碳高壓設備之昂貴成本，此 目標產物經常高濃度出現於發酵培養液中，並使用傳統溶劑時經常受到法令 的限制或有回收困難之窘境 (陳，2000)。

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(7) 超臨界色層分析：

超臨界流體色層分析是超臨界流體萃取與色層分析技術相結合，其可結 合 GC 及 HPLC 的偵測器，由於超臨界流體的性質介於氣體和液體間，

因此超臨界層析法綜合 GC 和 HPLC 的優點。而從第五屆國際 SFE and SFE 會議資訊證明，超臨界色層分析繼續朝著使用 GC 和 HPLC 分析法 難於分析的領域擴展。對那些通常被認為不揮發、沸點高達 1300 K 的物 質，透過改變參數，可按照化學類型或沸點進行分離 (林，2004)。

(8) 在環境污染上的應用：

可從廢水、土壤及空氣灰塵中萃取有毒物質，如多苯環芳香烴化合物及 多氯聯苯等。1998 年日本興建第一座 SCWO (Supercritical Water Oxidation) 超臨界水氧化工廠以完全燃燒廢棄物為目標，而達到有效的處理廢棄物上的 成效。還有現已運用於商業化的廢水處理以及化學武器與彈藥的銷毀。此法 是在超臨界水中進行氧化反應，由於超臨界水呈酸性且與氧完全互溶，故可 有效分解水中有機物，分解率高達 99.99％ 以上 (潘，2002)。

(9) 在矽半導體工業上的應用：

隨著積體電路製造技術的快速發展，矽晶片之表面污染控制及清洗則是 越來越重要，過去所用的清淨方法，為使用酸鹼性溶液，雖然相當有效，但 也衍生出一些問題，例如頇使用大量純水和化學試劑，這會造成產品及環境 的污染，以及在處理後頇費時的加以乾燥。而在新一代製程中，晶圓具有渠 溝或高深寬比結構時，由於液體表面張力大，不易進入結構內部加以清洗且 更不易乾燥。超臨界流體具有低表面張力及低黏度，因此可以有效進入細微 孔洞，並移除光阻劑 (photoresist) 或其他殘留物。美國國際商業機器公司 (IBM)、惠普公司 (HP)、休斯 (Hughes) 及日本 SRC 株式會社等，開發出 以利用超臨界流體低黏度、高擴散性、低表面張力等特性，來清洗矽晶片上 之微粒和金屬雖然目前仍屬開發階段，但已顯示確可克服前述使用水溶液的 問題(談，2002)。

(10) 奈米顆粒製造與粉粒體形成 (Particle formation) ：

利用超臨界或次臨界流體亦可製備微米 (10^－6 m) 及奈米 (10^－9 m) 粒

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子，所採取的操作方式則視溶解度而有所不同。如製造奈米金屬，常採用的 方法是微乳液或逆微胞法，由於二氧化碳在超臨界狀態下具親有機性，以其 替代有機溶劑，藉由還原反應，奈米金屬可在有限大小的微胞中形成，進而 製得奈米金屬。以銀為例，可藉由硝酸銀水溶液在超臨界二氧化碳流體中形 成微乳液，再經還原反應而製得 5 ~ 15 奈米的銀顆粒 (潘，2002；Peter et al., 1996)。

目前利用超臨界製程製備奈米顆粒與製備粉粒體主要可分為下列幾種 方式：

a. 超臨界溶液快速膨脹法 (Rapid Expansion of Supercritical Solutions, RESS)。

b. 氣體飽和溶液造粒法 (Particles from Gas-Saturated Solutions, PGSS)。

c. 氣體抗溶劑結晶法 (Gas Anti-Solvent Crystallization, GAS)。

d. 超臨界流體分散溶液法 (Solution Enhanced Dispersion by Supercritical fluids, SEDS)。

e. 連續式反溶劑法 (Aerosol Solvent Extracion System, ASES)。

f. 壓縮反溶劑沉澱法 (Precipitation with Compressed Fluid Anti-Solvent, PCA)。

g. 超臨界抗溶劑法 (Supercritical Anti –Solvent, SAS)。

第三節、反應曲面法

1. 反應曲面法 (Response surface methodology，RSM) 簡介

反應曲面法為一結合數學及統計學之技術，它可將一問題數學模式化，並分 析以求出變數 (Variables) 對系統的影響。它是試驗設計學的一種，可以同時考 慮兩個或兩個以上的影響因子，而設計出一最適化的反應。反應曲面法為試驗設 計學中討論最適化條件的一種統計方法，而試驗設計基本上是統計學中的一門分 支，最早的雛形可回溯至 Wishart、Winsor、Mitscherlich 及 Yates 等人的研究。

在 1951 年 Box 及 Wilson 首先提出反應曲面法的設計概念，其基本的構想為 結合統計實驗方法，與數據契合技巧 (Data-fitting technique)。根據實驗的數據，

建立描述一群受測因子及目標函數 (Objective function) 間相互關係之數學模式，

及而藉由此一模式探求其最佳化點之所在。經多年來的研究發展，此一方法已經

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發展得相當完整，並且已經普及應用於農業、化學工業、生物科技等等領域。

2. 反應曲面法之優點

反應曲面法應用上有下列幾點優點：

(1) 經濟性：反應曲面法可使用部分因子設定，故可以較少的試驗成本及 時間而獲得正確而有用的資訊。

(2) 可獲得最適化的技術條件：由於電腦繪圖的發展，反應曲面法所得的 迴歸方程式可以很快的被描繪成等高線圖 (Contour plot)，並且可以快 速的看出三度空間的曲面圖，經由圖形可以更有效且快速的看出最適 化的條件所在。

(3) 強化因子間的交互作用之影響:反應曲面法可經由反應區分析所得的 統計資料和迴歸方程式來瞭解各因子間的交互作用，可真正達到深入 探討多因子對其系統的貢獻及影響程度 (王，1997)。

3. 反應曲面法的應用及研究

Baskar 以反應曲面法獲得靈芝培多醣產量最高之條件 (Baskar et al., 2011)。

Fasting 和 Gisvold 在 2003 年利用反應曲面法探討改進麻醉劑量的控制以避 免區域麻醉不足，難以出現麻醉，氣管、插管困難和藥物的錯誤，提高麻醉之穩 定性。陳在 2011 年也以反應曲面法探討澱粉濃度、磷酸鹽及油脂對花枝魚漿之 咀嚼度影響。可見反應曲面法已應用於醫學、食品、生物科技等等領域。

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第二章 實驗動機、目的與架構

第一節、實驗動機與目的 1. 實驗動機

由於超臨界萃取的開發與應用中發現超臨界二氧化碳流體萃取擁有多項優 點，如無毒性、溶劑殘留、步驟簡單、選擇分離效果好、萃取率高、有利於脂溶 性物質及熱敏感性物質的萃取等優點 (林，2004)，且可於室溫下操作等，很適 合於食品工業應用，尤其在天然物的萃取上，如中藥、薑與茶類萃取 (Rice-Evans et al., 1997；越智，1996)。目前市場上牛樟芝保健食品種類繁多，很多牛樟芝產 品以總三萜作為指標性功效成分 (Cherng et al., 1995)。

牛樟芝三萜類化合物不僅是當前牛樟芝化學及藥理研究的重點，而且具有較 好的應用前景。而從過去研究中發現牛樟芝含有豐富的三萜類化合物，且三萜類 化合物具有很好的生物活性，而其三萜類成分較多數是屬於脂溶性 (Brinkhaus et al; Hsu et al., 2005a; Li et al., 2005; Ming et al., 2007)，而以傳統溶劑萃取存在著耗 時耗能、溶劑用量大、會有溶劑殘留及生產成本較高等缺點 (楊等，2009)，因 此想利用超臨界 CO2 的萃取方法取得其中之三萜成分，並找到最適的萃取條件，

為進一步萃取牛樟芝總三萜奠定基礎。

2. 研究目的

此研究以超臨界二氧化碳技術萃取牛樟芝總三萜含量及其抗氧化能力，此次 研究主要是以經過冷凍乾燥與研磨成粉狀之兆豐生技人工培養牛樟芝及野生牛 樟芝，比較其酒精靜置萃取、震盪萃取及超臨界二氧化碳流體萃取並分析其總三 萜含量與抗氧化之能力，而超臨界萃取條件是以一次一變因及反應曲面法來探討，

操作的變因如下，有樟芝量、萃取時間、萃取溫度、萃取壓力及共溶劑濃度等五 項，並得到一最適萃取總三萜量之條件，預期將實驗成果，應用於牛樟芝產品之 開發，將其中三萜類成分應用生物萃取技術結合活性成份分析數據，進行相關加 值性活性成份之純化及進一步提昇為機能性，甚至醫藥級的產品。

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第二節、實驗架構

本實驗架構如圖四所示，而超臨界萃取的起始操作變因之條件為牛樟芝量 6 g、萃取時間 30 min、萃取溫度 45 ^oC、萃取壓力 250 bar 及共溶劑濃度為 60%

酒精，而此操作條件經由文獻參考所定。實驗先比較超臨界萃取、酒精靜置及震 盪萃取總三萜量萃取率之優劣。在超臨界萃取部分以一次一變因找出最佳的樟芝 量及萃取時間的條件，再進行單因子的萃取溫度、壓力及共溶劑濃度對總三萜量 的影響探討中心點，再利用反應曲面法探討萃取溫度、萃取壓力及共溶劑濃度之 間的相互關係並找出其最佳萃取總三萜量的條件以獲得最大的萃取量。最後比較 不同的牛樟芝在酒精靜置萃取、震盪萃取及在最適的超臨界萃取條件下總三萜量 之影響。

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圖四、實驗架構圖4 Fig. 4 Outline of experiment

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第三章 實驗材料與方法

第一節、實驗材料 一、儀器設備

1. 實驗室級超臨界流體萃取系統 (Supercritical Fluid Extraction System) Applied Separations Inc, USA

2. 空氣壓縮機 (Air compressor) 竣幃企業有限公司， JW-2025, Taiwan 3. 真空減壓濃縮機 (Rotary evaporatoes) EYELA Rotary Vacuum Evaporator

N-1000V, USA

4. 高速冷凍離心機 (Micro high speed refrigerated centrifuge) HIMAC CR22E, HITACHI, Japan

5. 電子分析天平 (High precision electronic balance) TB-2150D DENVER, USA 6. 盤式全光譜儀 (Absorbance monochromator-based readers) Multiskan GO,

Thermo Co.

7. 震盪清洗機 (Ultrasonic steri-cleaner) 敦華電子材料有限公司， LEO-S1424, Taiwan

8. 針頭式過濾器 (0.22 μm syringe filter nylon membrane) ChromTech Co.

9. 高效能液相層析儀 (High performance liquid chromatography, HPLC) Model L-2130, Hitachi Co., Tokyo, Japan

10. HPLC 積分儀 (Integrator Model D-2500, Hitachi Co., Tokyo, Japan) 11. HPLC 偵測器 (UV/VIS Detector Model L-2455 DAD, Hitachi Co., Tokyo,

Japan)

12. HPLC 層析管柱 (column) RP-18 GP 250-4.6 (5 μm) , (Kanto Chemical Co., Tokyo, Japan)

二、藥品試劑

1. 95% 酒精 (Ethanol) 購自 臺灣菸酒股份有限公司 2. 甲酸 (Formic acid, FA) 購自 日本試藥工業株式會社 3. 乙腈 (Acetonitrile, ACN) 購自 Honeywell Co.

4. α,α-Diphenyl-β-picrylhydrazyl free radical (DPPH) 購自 Sigma Chemical Co.

5. 香草素 (Vanillin) 購自 Sigma Chemical Co.

6. 冰醋酸 (Glacial acetic acid) 購自 Merck Co.

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7. 過氯酸 (Perchloric acid) 購自 島久藥品株式會社 8. 液態 CO₂ 購自 臺東蒙恩氣體行

9. 牛樟芝粉末 (AC) 詳表三

三、標準品

1. 齊墩果酸 (Oleanic acid) 購自 Sigma Chemical Co.

2. 維他命 C (L (+) -Ascorhic acid) 購自 Panreac Co.

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表三、牛樟芝來源3

Table 3. Source of Antrodia camphorata.

組別 培養 方式

基質成分

來源 樣品

型態 顏色 保存 牛樟木水 方式

萃液 (%) 糙米 (%)

靈芝粉 末 (%)

微量元 素 (%) AC-1 人工

固態 基質*

45 55 0 0.1

兆豐

生技 皆為 粉末 狀

黃褐色

4^oC 冰箱

AC-2 41 51.3 7.7 0.1 黃褐色

AC-3 40 50 10 0.1 褐色

AC-C 野生 ― ― ― ― 指導老

師提供 米黃色

* 固態培養是以 250 mL 錐形瓶填裝經處理的糙米基質約 200 g ，瓶口以透氣 布封住後經高溫滅菌，在各瓶中接種牛樟芝菌絲，並靜置在常溫下培養 4 周，

將牛樟芝發酵物取出收集，經冷凍乾燥後磨成粉末狀。

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第二節、實驗方法 第一部分

1. 超臨界萃取的操作步驟 (詳圖五)

(1) 開始操作前檢查所有閥 (V1~V5) 是否為關閉。

(2) 將恆溫循環水槽 (B) 開啟設定所需之溫度。

(3) 依序開啟恆溫烘箱 (F) 、空氣壓縮機 (D) 、電熱器 (H) 及閥 (V1) 。 (4) 將恆溫烘箱 (F) 及電熱器 (H) 設定所需之溫度。

(5) 將樣品秤重後填充入萃取管柱 (E) ，再將萃取管柱 (E) 裝置於恆溫烘箱 (F) 裡並開啟閥 (V2) 及共溶劑幫浦 (G) 打入所需之共溶劑量後停止共 溶劑幫浦 (G) 。

(6) 待萃取管柱之溫度達預設值即開啟加壓幫浦 (C) 使壓力上升至預設 值。

(7) 溫度及壓力皆達實驗預設值，即開始計時。

(8) 待萃取時間結束後，關閉加壓幫浦、空氣壓縮機及閥 (V1) 並緩慢開啟 閥 (V3 和 V4) 使流速計 (J) 流速維持在 2 NL/min 。

(9) 待壓力洩壓至 65 Bar 時開啟閥 (V5) 使萃取管柱內之壓力全部洩完後，

再依序關閉閥 (V3、V4、V5、V2) 。

(10) 收集萃取管柱及收集瓶 (I) 內之樣品，確認所有閥 (V1~V5) 為關閉，

並且切斷所有電源，清洗萃取管柱。

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設備編號 設備名稱 設備編號 設備名稱

A CO2 鋼瓶 G 共溶劑幫浦

B 恆溫循環水槽 H 電熱器

C 加壓幫浦 I 收集瓶

D 空氣壓縮機 J 流速計

E 萃取管柱 V1~V5 閥

F 恆溫烘箱

圖五、超臨界系統圖5

Fig. 5 Supercritical Fluid Extraction System.

A

B

C

D

F

H

I V1

V2

V3 V4

V5

G

J

E

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本研究主要以靜態萃取法 (static sxtraction method)；此法又稱 steady-state extraction。本實驗考慮到牛樟芝樣品量的因素，因此在超臨界萃取部分皆以樟芝 AC-1 組來進行最適條件的探討。其相關操作變因為樟芝填充量、萃取時間、萃 取溫度、萃取壓力與共溶劑濃度共五項。並將其萃取物以 80% 酒精定量稀釋至 15 mL 後，依 (總三萜測定之流程) 步驟 (3) ~ (7) 之方法依序加入藥品後測定 其吸光值。

1. 比較不同萃取方法對三萜量之影響 (1) 超臨界萃取

以起始條件 6 g 樟芝 AC-1、萃取時間 30 min、萃取溫度 45 ^oC、萃 取壓力 250 bar 進行萃取，將萃出物以 80% 酒精定量稀釋至 15 mL 後，

依 (總三萜測定之流程) 步驟 (3) ~ (7) 之方法依序加入藥品後測定其吸 光值。

(2) 酒精靜置萃取

參考郭在 2012 年所使用之方法，秤取樟芝 AC-1 組的粉末 0.02 g 加入 1 mL 80% 酒精，並置於 45^oC 水浴靜置萃取 30 min，並以 5000 × g 離心 15 min 後，取上清液以 0.22 μm filter 過濾後將萃取液依 (總三萜 測定之流程) 步驟 (3) ~ (7) 之方法依序加入藥品後測定其吸光值。

(3) 酒精震盪萃取

秤取樟芝 AC-1 組的粉末 0.02 g 加入 1 mL 80% 酒精，於常溫下在 超音波震盪清洗機中進行震盪萃取 30 min，再以 5000 × g 離心 15 min 後，取上清液以 0.22 μm filter 過濾後將萃取液依 (總三萜測定之流程) 步驟 (3) ~ (7) 之方法依序加入藥品後測定其吸光值。

2. 探討樟芝量對萃取三萜量之影響

操作變因為樟芝 AC-1 填充量分別為 6、8、10 g，及起始條件萃取時間 30 min、萃取溫度 45^oC、萃取壓力 250 bar 。

3. 探討萃取時間對萃取三萜量之影響

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操作變因為萃取時間分別為 0、30、60 min，及起始條件 6 g 的樟芝 AC-1、

萃取溫度 45^oC、萃取壓力 250 bar。此處萃取時間為當超臨界萃取系統溫度及 壓力達到預設值後，進行靜置萃取所設定的時間。

探討萃取溫度、萃取壓力及共溶劑濃度對總三萜量之影響

此部分探討的三個條件皆為可影響 CO₂ 在超臨界狀態下的溶解度與極性 而達到不同的萃取效果，因此欲了解此三個條件對超臨界萃取牛樟芝三萜量是否 有所影響。

4. 探討單因子之萃取溫度、萃取壓力及共溶劑濃度對總三萜量之影響 (1) 探討萃取溫度對萃取三萜量之影響

操作變因為萃取溫度分別為 35、40、45、50^oC，及起始條件為 6 g 樟 芝 AC-1、萃取時間 30 min、萃取壓力 250 bar。

(2) 探討萃取壓力對萃取三萜量之影響

操作變因為萃取壓力分別為 150、250、350 bar，及起始條件 6 g 樟 芝 AC-1、萃取時間 30 min、萃取溫度 45^oC。

(3) 探討共溶劑濃度對萃取三萜量之影響

操作變因為共溶劑濃度分別為 30、60、90%，及起始條件 6 g 樟芝 AC-1、萃取時間 30 min、萃取溫度 45^oC、萃取壓力 250 bar。

5. 三因子 (萃取溫度、萃取壓力、共溶劑濃度) - 三階層反應曲面法探討最適條 件

傳統上大多以一次實驗決定一個因子的方式來篩選最佳條件，但卻無法考 慮各因子之間的相互關聯效應。因此許多實驗設計法陸續被發展出來，如梯度 法、三角點搜尋法、開展操作法及反應曲面法等實驗設計方法 (Himmelblau, 1970)。

在超臨界 CO₂ 流體萃取中，可藉由改變萃取的溫度、壓力及共溶劑濃度 來改變 CO₂ 的極性而達到不同的萃取效果。選擇三種因子 (X₁、X₂、X₃)，以 反應曲面法找出最適的萃取條件。本實驗是用 Box 和 Behnken 所提的三變 數三階層之中心旋轉 (three-variable and three level central rotatable design) 及

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反應曲面法實驗設計。以 (X₁、X₂、X₃) 為變數因子，每一變數有三階數值，

經編碼後分別以標準值 -1、0、+1 代表，每個平面皆有一可旋轉之中心點 (座 標為 0，0，0) 進行重複實驗。以此中心向兩端各擴展一單位，因此本實驗設 計共有 15 組試驗點數。

RSM 之實驗設計如表四所示， X₁、X₂、X₃ 之變數因子分別為萃取溫度、

萃取壓力與共溶劑濃度。試驗後分析各組之總三萜量 (Y) 作為反應性狀，所 得數據再 Microsoft Excel 中的數據回歸程式進行分析，可得萃取條件之總三 萜量模式之回歸係數值，並以此求得下列之三變數二次方程式：

Y=A₀+A₁X₁+A₂X₂+A₃X₃+A₁₂X₁X₂+A₁₃X₁X₃+A₂₃X₂X₃+A₁₁X₁²+A₂₂X₂²+A₃₃ X₃² (A 表示各項係數) 。

進行變異數分析可以得到變異度 (R²)、不適合度 (lack of fit)、顯著性、

回歸方程式之各項細數及各因子對反應觀測值的顯著程度，再將求得之回歸方 程式利用 Sigma plot 10.0 統計與繪圖軟體完成反應曲面圖，找出最適萃取條 件。

6. 總三萜測定之流程

參考 Cui 等人在 2006 年所使用之方法再加以調整其條件，以 oleanolic acid 作為標準品做回歸曲線回推三萜的濃度。而目前研究尚未有針對牛樟芝 三萜量的測定方式，目前都是以靈芝的標準品齊墩果酸來做標準曲線回推其三 萜的含量。總三萜量測定流程如下。

(1) 精秤 2.5 mg 的 oleanolic acid ，放入 2 mL 離心試管中，以 pipette 加 入 1 mL 80% 酒精，並搖盪至完全溶解為止，濃度為 2.5 mg/mL。

(2) 經序列稀釋後，配置濃度分別為 2.25、2、1.75、1.5、1.25、1、0.75 mg/mL 等 8 個濃度。

(3) 取步驟 (2) 中之液體每管各取 80 μL 放入另外 8 支離心試管中分別 於各管中加入 120 μL 的 5% vanillin-glacical acetic acid 將其混和均 勻。

(4) 再加入 400 μL 的 perchloric acid 混勻後置於 60^oC 水浴中 20 min。

(5) 待時間到再將其取出後冰浴至室溫，每管各取 150 μL 至 96 孔盤上，

再以 550 nm 測其吸光值。

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(6) 繪製濃度和吸光值的標準曲線，得回歸方程式：Y=0.0015X - 0.8677，

R²=0.9953，線性範圍 0.75～2.5 mg/ml (詳圖六)。

(7) 將所計算出之總三萜量換算為每克 (g) 牛樟芝樣品所能萃出的總三萜 量 (mg)。