性。
實驗原理
光譜分析儀的應用範圍極廣 , 從表面特性到液體成分分析都可派上用場. 此 次實驗的應用, 是觀察不同物質對於光譜吸收的差異性, 以及吸收譜線的觀察.
溶液的光譜分析, 是藉由單一光源之光束, 選擇想要的波長, 利用分光器分成 兩道, 分別通過參考溶液以及樣品溶液後, 將光訊號轉換成電訊號, 以利的判讀.
一般光譜分析儀的設計如下:
www.beckman-coulter.com
實驗步驟
A.儀器用具1. JASCO V-550 Spectrophoto meter(光譜儀，見下圖)
光譜儀外觀 光譜儀內部
2. Cuvette *2 (5ml or Y-type 1.4ml，下圖為拋棄式 1.4ml cuvette)
B.藥品試劑
DNA 溶液(700bp， 500mg/1L or 1.11mM， SIGMA D6898).
BSA.
C.方法步驟
3. 接著進入 Spectrum Measurement(全光譜分析)
→
Measurement→
Parameter 進行參 數設定Photometric Mode:光度計模式 Abs 指吸光係數
Response :掃描速度
Band Width:帶寬，即狹縫之寬度 Scanning Speed : 光譜以每分鐘多 少nm 速度掃描。
Start and End : 即是指光譜掃描範 圍，
由高掃到低，所以Start 要比 End 數 字要高。
Data Pitch : 掃描時以每多少 nm 紀 錄一次數據。
注意事項 : Scanning Speed 限制 Band Width 及 Data Pitch。通常再高速掃描時 Data Pitch 就以最大值去設定，因為用小一點的數值去掃描有時紀錄的兩個數據是一樣 的，這樣是多餘的，如不會設定可以參考附錄。
4. 將兩個石英玻璃(光源透過的兩邊不要有指紋、油污)裝上溶劑(例如:水)放入光譜 儀凹槽 ，放置位置如下：
5. 進入 spectrum measurement
→
baseline→
measure 進行溶劑 baseline 量測，記得要 存檔，這樣接下來電腦才會存取。=============================================================
＊所謂的baseline，可以看作是針對基底溶液所做的儀器訊號歸一化資訊。方式是 將所取得的訊號資料以 baseline 資料一同處理後去掉非待測物體的光譜訊號以及 雜訊等等，得到真正所需物體之光譜訊號，如DNA 溶於水時前拿水溶液做 baseline，
即是為了得到輻射光源穿透容槽兩面鏡以及水溶液時的光譜吸收訊號稱為
bsaeline，接著將 DNA 溶液進行光譜量測就可以去掉兩面鏡及水溶液的光譜吸收訊 號，即可得到真正的DNA 的光譜吸收值。
=============================================================
6. 接下來將待測槽換成待測溶液，measurement
→
start 進行光譜儀測量，接著用 txt 檔存檔，接著使用 origin 進行分析。7. 將 DNA 溶液配成 0.01mM 看是否有峰值?將 DNA 稀釋小於 0.01mM 約 4~6 濃 度進行光譜分析，然後進行存檔。
Response 及 Band Width 都和 全波段設定一致，然後在
Wavelength 中選擇要掃描的光波 長，可同時進行好幾個單波長量 測。
10. 利用 DNA 在全光譜產生一 峰 值的光波長進行各濃度的單光譜
測量，並進行吸收強度對濃度的對照。
實驗二之二 定量分析: 測定溶液濃度與吸光值的關係
實驗目的
由測定標準溶液的吸光值(的特性)，來測定未知濃度溶液的濃度，並了解光譜 分析儀的操作。
實驗步驟
A.儀器用具1. Corning 塑膠離心管 15ml(no.430791)*16。
(欲測濃度：10mM、4 mM 、2 mM、1mM、0.4mM、0.2mM、0.1mM、0.04mM、
0.02mM、0.01mM、4μM、2μM 、1μM、0.4μM、0.2μM、0.1μM)
2. OHAUS 電子秤 Adventurer series，model：AR2140。
3. 塑膠量皿、藥匙。
4. 試管架。
5. 光譜分析儀 Jasco V-550 spectrophotometer w/ computer 6. Cuvette*2(容量 1.4ml)
B.藥品試劑
島久藥品 Potassium Permanganate；extra pure reagent (試藥一級)。
C.方法步驟
2. 配置 10 mM，15 ml：
（1） 取 158.04*0.1(M)*0.015=0..23709(g) KMnO4。
（2） 將 KMnO4加進倒有一些ddH2O 的容器中，再加水至總體積 15 ml。
（3） 將溶液搖盪均勻。
（4） 取 4.5 ml*2 的 ddH2O 加入離心管，再加入 1ml，100 mM KMnO4， 振盪均勻。
2. 配置 4 mM、 2 mM ，各 15 ml：
（1） 取 100 mMKMnO4各0.4ml、0.2ml，加入裝有 4.8*2ml、4.9*2ml ddH2O 之離心管。
（2） 將溶液搖盪均勻。
3. 稀釋各濃度 KMnO4：
（1） 取 10 mM、4 mM、2 mM 各 1 ml 加入裝有 9 ml ddH2O 離心管中，
並振盪均勻，配出1 mM、 0.4 mM、 0.2 mM 的 KMnO4溶液。
（2） 同上做法，將 1 mM、 0.4 mM、 0.2 mM 的 KMnO4溶液稀釋0.1x。
（3） 重複上述步驟，配出 100μM、40μM、20mΜ及 10μM、4μM、
2mΜ和 1μM、0.4μM、0.2μM、0.1mΜ的 KMnO4溶液。
4. 使用光譜分析儀。
（1） 將光譜分析儀打開熱機 30 min。
（2） 使用微量滴管，先將ddH2O 注入兩支 Cuvette 中，再放入光譜儀裡。
結果與分析
DNA (0.1mg/ml)與 BSA(0.4mg/ml)之特性光譜如下:
300 400 500 600 700 800
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
0.00 0.00 0.25 0.50 0.50 0.75 1.00 1.00 1.25 1.50 1.50 1.75 2.00 2.00 2.25 2.50 2.50 260279
BSA (ABS )
Wave length (nm)
BSA 0.4mg/ml
D N A (A BS)
DNA 0.1mg/ml
其中可以注意到分別在260nm, 280nm 附近有很強的吸收. 一般來說我們會利用此 特徵波長來做為更進一步的定量分析. 而合適的濃度範圍則依各種不同物質而有所 差異, 需逐一檢視.
問題與討論
1. 吸收度(ABS)的定義為何? 當吸收度接近 0 或超過 1 以上時, 準確度是否有 差異? 若有差異, 則應該避免的情況為何?
2. 為何 DNA 與 BSA 的吸收特性曲線有所差異? 其特徵波長是怎麼來的?
若時間允許, 試著調整各種掃描參數, 並比較其結果差異
附錄
比爾定律 (Beer’s Law)
考慮一束強度為 I0之平行輻射光線，垂直投射於長方形物體。光行經途徑長度 為b 後，因物體之吸受使光強度減低為 I。物體於單位截面積與厚度為 dx 中，含有 dn 個可吸收輻射質點(分子或離子) 。假設每一質點可捕獲光子之機率相等，則光 單位強度之衰減(單位時間內被捕獲吸收之能量)將正比於行經體積內之總質點數，
亦即
ρ α α
⋅ =− ⋅ ⋅−
=
N dx
I0
dI
其中α 為比例常數，稱為質點之捕獲截面積。N 為行經體積內可吸收輻射之總質點 數，而
ρ
為該質點粒子數密度。於位置 x =0 時，光未被吸收所以其強度為原入射光 強度；當位置 x = b，光之強度衰減為 I。利用此條件，上式積分可得∫
∫
II =− b ⋅ ⋅dx I
dI
0 0
0
ρ α I b
I = − ⋅ ⋅
α ρ0
ln
人們習慣上使用
303 . log 2
0
b I
I ⋅ ⋅
−
=
α ρ
若將濃度單位改為莫爾濃度C，其換算為
1023
02 . 6 C 1000
×
=
ρ
⋅(每升所含的莫耳數) 將此新濃度單位代入，上式可得
A bC I bC
I
= =×
⋅
= ×
α ε
1000 303 . 2
10 02 . log 6
23 0
式子中A 為吸收值(absorbance)或稱 OD 值(optical density)，而ε為莫爾吸收係數
