結節硬化症：REDCap資料庫的建立以及次世代定序基因檢測

國立臺灣大學醫學院分子醫學研究所 碩士論文

Institute of Molecular Medicine College of Medicine

National Taiwan University Master Thesis

結節硬化症：REDCap 資料庫的建立以及次世代定序 基因檢測

Tuberous Sclerosis Complex (TSC): REDCap Database Establishment and Next-generation Sequencing (NGS)-

based Genetic Testing 李昭萱

Chao-Hsuan Li

指導教授：陳沛隆 博士

Advisor: Pei-Lung Chen, M.D., Ph.D.

中華民國 107 年 7 月

July, 2018

國立臺灣大學碩士學位論文

口試委員會審定書

結節硬化症：REDCap 資料庫的建立以及次世代定序 基因檢測

Tuberous Sclerosis Complex (TSC): REDCap Database Establishment and Next-generation Sequencing (NGS)-

based Genetic Testing

本論文係李昭萱君（P05448003）在國立臺灣大學分子醫

學研究所完成之碩士學位論文，於民國 107 年 07 月 11 日承下

列考試委員審查通過及口試及格，特此證明

致謝

不知不覺兩年就過去了，想當初剛踏進來的一幕幕，至今仍歷歷在目。首 先，我要感謝一開始佳臻帶領我紮下所有實驗和概念的基礎；感謝毓慈和勝凱，

自從踏進這個實驗室，就接受了他們無數的幫忙，即使他們手邊也很忙，卻總願 意抽身相助；感謝育華，一步一步地教我如何設計 TSC panel；以及志善，協助 NGS 上機和資料分析；感謝杜博士全力協助 TSC REDCap 的建立以及後續多次修改 而不厭煩；感謝桂秋、雲潔和孟霖，在自己的研究計畫負擔之外，還額外花時間 和心力幫忙 TSC 計畫案進行 minigene 實驗。還有非常重要的孟涵，在我工作不 方便抽身時，給予全力的支援，沒有她的幫忙，我不可能忙得過來；感謝幼玫時 時提供各方面的經驗協助；感謝建銘在關鍵時刻相挺；感謝愛珠姐、奕蓁、惠 薰，隨時引導常不知所措的遺傳諮詢班學生，做為結節硬化症門診穩固的立基。

另外，謝謝我的遺傳諮詢班同學兼工作同事：瑞玲，做為我上課過程中最大 的陪伴和支持力量。讓心智脆弱、無毅力的我，不可思議地完成學業。還有謝謝 我公司實驗室的主管，支持我在職進修的決定，配合我上課實習的時間開會，接 受隨時消失不見的我；謝謝我的超級工作夥伴們，隨時做我的接應、完美地支援 我工作上各環節的進行。還要感謝我的家人，幫我省了非常多珍貴的時間；我的 朋友，在我低潮萎靡時給予鼓勵；也感謝實習每一站的醫師和每一個願意讓我諮 詢的病人，讓我能慢慢摸索遺傳諮詢的真諦。在碩士論文完成之際，感謝謝豐舟 教授和楊偉勛教授不畏颱風如期蒞臨口試，協助我完成碩士學位的重要里程碑。

最後，要謝謝讓我有機會認識這麼多超棒的人的陳沛隆醫師，引導我踏入陌 生的 NGS 領域。出社會，深深覺得機會很重要，尤其是非自己的專業，常常連嘗 試、學習、觸碰的機會都沒有。尤其在我一開始就展現出自己脆弱不合適的一 面，老師還願意給我機會努力去嘗試，真的非常感謝。整個求學過程中，老師細 膩的指點，讓我受益匪淺，見識到各領域強者雲集，共同激盪琢磨出的思想火 花，可以如此美。能當老師的學生是一件非常幸福的事。

中文摘要

結節硬化症是一種罕見的體染色體顯性遺傳疾病，因 TSC1 或 TSC2 基因生 殖細胞突變，導致全身各處器官和組織產生錯構瘤。目前有 10~25%臨床上確診 為結節硬化症的病人，取其周邊血液做次世代定序基因檢測，找不到致病位點。

其中有部分可能是 TSC1 或 TSC2 低比例鑲嵌型，或者致病位點隱藏在較深會影 響剪接的內涵子區域，於檢測時被忽略。

本研究收入了曾於臺大醫院結節硬化症整合門診看診的病人及其家屬共 508 位，含 222 個家族。根據臨床表徵，其中有 168 個家族先證者 (proband) 被確診 為結節硬化症；10 個家族臨床懷疑為結節硬化症但尚不足以確診；44 個家族原 本被懷疑是結節硬化症，經過轉介來臺大醫院評估後認為非結節硬化症。將這些 個案的家族史、臨床表徵、基因檢測、各科追蹤檢查紀錄等資訊，整理並在臺大 安全網域下建構線上 TSC REDCap 資料庫，呈現臺灣本土結節硬化症疾病的資 料。另外，進行兩代直系親屬的基因檢測，確認一同時患有結節硬化症和多囊腎 的病人身上兩個致病變異點在染色體上的相位關係；並從過去周邊血液基因檢測 未找到生殖細胞突變的 3 位病人中，取其皮膚病灶檢體進行基因檢測，偵測到低 比例的生殖細胞 TSC1 或 TSC2 突變鑲嵌型狀況；探討一患有肝細胞癌 (HCC) 的 B 型肝炎帶原結節硬化症病人，其肝臟腫瘤切片的基因狀況；設計 minigene 功能 性測試系統來確認未確定致病性的剪接位變異點其轉錄出的 mRNA 是否有異。

在本研究臨床確診為結節硬化症的家族中，次世代定序基因檢測確診檢出率 約 88%，另 3%為未能確定致病性的變異點 (VUS)，剩下 9%沒有發現任何懷疑的 變異點 (NMI)。其中有 20%為 TSC1 基因變異，80%為 TSC2 基因變異；30%為家 族遺傳而來，70%為新發生的變異。對於同時帶有結節硬化症和多囊腎兩個致病 變異點的病人，可以透過進行直系親屬基因檢測來釐清兩變異點的相位關係；並 利用皮膚病灶檢體提高低比例鑲嵌型患者，生殖細胞突變被檢測出來的比率；觀 察到一位帶有 TSC2 致病生殖細胞變異且同時為 B 型肝炎帶原的結節硬化症病

人，發展出肝細胞癌 (HCC) 時，則其肝腫瘤會較大且侵略性更強。針對肝腫瘤 切片做基因檢測，發現除患者原本在 TSC2 基因上的生殖細胞錯義突變之外，另 發生一個體細胞突變：約 2Mb 包含 TSC2 的大片段缺失，使此區域成為異合性丟 失的狀況 (LOH)。免疫治療搭配 everolimus 治療對此病人肝腫瘤擴張有控制效 果。最後，針對未確定致病性的剪接位變異點設計的 minigene 系統將繼續進行實 驗確認。

中文關鍵詞：結節硬化症、線上資料庫、致病性不明的剪接位變異、低比例鑲嵌 型、兩致病變異點的相位關係、B 肝帶原肝細胞癌病灶、次世代定序。

Abstract

Tuberous Sclerosis Complex (TSC) is a rare autosomal dominant disease due to germline disease-causing variants in either TSC1 or TSC2 gene, and may develop multisystem harmartomas. However, 10%-25% of TSC patients remain genetically undiagnosed after conventional genetic testing. Part of them may carry variant(s) with low percentage mosaicism or have variants affecting splicing in deep introns, which would be missed out during interpretation of the NGS data.

We enrolled 508 subjects from 222 families from the TSC Integrated Clinic at National Taiwan University Hospital (NTUH). Among them, 168 probands were TSC- confirmed, 10 probands were TSC-suspected, and 44 probands eventually did not meet the clinical criteria of TSC. We established an online REDCap database for our TSC cohort, and collected and uploaded family histories, phenotypes, genotypes, and the follow-up examinations of these subjects into the database. Additionally, we took advantage of the next-generation sequencing (NGS)-based genetic testing to solve several critical issues. Notable examples included, but not limited to, solving the

phasing issue of TSC2 and PKD1 variants in a family, detecting possible low percentage mosaic germline mutations in skin lesions of 3 TSC patients without identifiable

variants in peripheral blood samples previously, and analyzing the possible second hit of

from the hepatoma biopsy samples of a TSC patient with chronic hepatitis B and newly diagnosed hepatocellular carcinoma (HCC). Finally, we designed minigene experiments trying to confirm the pathogenicity of splicing variants of unknown significance (VUS).

In our study, for the 168 probands with clinically definite TSC, the detection rate of pathogenic and likely pathogenic germline variants in TSC1 or TSC2 gene was 88%;

additional 3% of TSC patients had VUS, and 9% remained no mutation identified (NMI). Among TSC probands with genetic diagnosis, 20% fell in TSC1 and 80% fell in

TSC2 gene. Thirty percent of the variants were inherited, while the other 70% were de

novo mutations. For the patient with two variants in the TSC2 and PKD1 genes, we confirmed that the two variants were on the same chromosome 16 haplotype, based on the co-segregation observed in his son. And, we could increase the detection rate of low percentage mosaic germline mutation by analyzing the NGS data of their skin lesion samples compared with the data of peripheral blood samples. For the TSC patient with chronic hepatitis B as well as newly diagnosed HCC, we found a pathogenic TSC2 germline missense variant and a TSC2 LOH somatic mutation at least 2Mb in size in the HCC biopsy. The HCC initially grew fast and developed aggressively. Treatment

combined with immunotherapy and everolimus, which is a mTOR inhibitor, seemed to be initially effective for disease control. Finally, the minigene experiments of VUS splicing variants are still underway.

English key words: Tuberous Sclerosis Complex (TSC), online database, splicing

variants of unknown significance (VUS), low percentage mosaicism, haplotyping, HBV+HCC biopsy, next-generation sequencing (NGS)

目錄

論文委員會審定書---i

致謝---ii 中文摘要---iii-iv

Abstract--- v-vii

第一章 研究背景與動機

1.1 結節硬化症的疾病介紹 ---1 1.2 結節硬化症的歷史演進 ---1 1.3 結節硬化症的致病機轉 ---1-2 1.4 結節硬化症的臨床表徵 ---2-3 1.5 結節硬化症的診斷標準

1.5.1 臨床診斷標準 ---4 1.5.2 基因診斷標準 ---5 1.6 結節硬化症資料庫

1.6.1 國際上現有的結節硬化症 LOVD 資料庫---5-6 1.6.2 臺灣本土結節硬化症資料 ---6 1.7 結節硬化症在基因檢測診斷上遇到的困難

1.7.1 找不到懷疑的致病變異點---6-7 1.7.2 找到無法判讀其致病性的變異點 (VUS) ---7 1.8 TSC1 和 TSC2 基因變異點的功能性評估---8 1.9 遺傳諮詢 (genetic counseling) ---8-9

1.10 研究動機

1.10.1 臺大醫院 TSC REDCap 整合型資料庫的建立---9 1.10.2 結節硬化症患者基因檢測上難解的問題---10 第二章 研究方法

2.1 研究對象

2.1.1 受試者來源與收案標準---11 2.1.2 同意書簽署---12 2.1.3 檢體---13 2.2 研究方法

2.2.1 DNA 萃取---13-14 2.2.2 偵測 DNA 品質---14-15 2.2.3 TSC panel---15 2.2.4 次世代定序 (next-generation sequencing, NGS) ---16-17 2.2.5 變異點致病性的判讀---17-18 2.2.6 聚合酶連鎖反應 (PCR) 及傳統定序 (Sanger) ---18 2.2.7 minigene assay---18-19 2.2.8 REDCap 資料庫---19 2.2.9 PhenoTips 家族譜圖繪製---19 第三章 研究結果

3.1 REDCap 資料庫

3.1.1 REDCap 表單及項目欄位---20-27 3.1.2 臺大醫院結節硬化症整合門診病人的基因檢測結果統計---28-30

3-2 結節硬化症患者基因檢測上難解的問題

3.2.1 確認同一患者身上兩個致病變異點在染色體上的相位關係---31-33 3.2.2 提升低比例 TSC1 或 TSC2 鑲嵌型患者的基因檢測檢出率---34-36

3.2.3 檢測 HBV+HCC 的結節硬化症病人的 second hit ---37-38 3.2.4 利用 minigene 來確認基因剪接 (splicing) 狀況---39-50

3.3 遺傳諮詢

3.3.1 案例一 (TSC201)---51

3.3.2 案例二 (TSC419)---52-53 3.3.3 案例三 (TSC418)---54-55 3.3.4 案例四 (TTSC00480)---55-56 第四章 討論

4.1 臺灣的結節硬化症流行病學資料---57

4.2 基因檢測檢出率---57

4.3 HBV+HCC---58

4.4 遺傳諮詢---58

第五章 結論 ---59

參考文獻---60-63 附錄 附錄一、TSC PCR primers (1) TSC1 PCR primers---64-65 (2) TSC2, PKD1 PCR primers---65-67 (3) minigene PCR primers for insert DNA---68 (4) PCR programs---68-69 (5) minigene primers for Sanger sequencing---70-71 附錄二、minigene assay 實驗流程---71-74 附錄三、TSC panel---75-84 附錄四、結節硬化症臨床確診家族之 proband 基因檢測結果---85-92

圖目錄

圖一、 REDCap database - TSC enrollment list---20

圖二、 REDCap database - medical history ---21

圖三、 REDCap database - family TSC history---21

圖四、 REDCap database - education and occupation---22

圖五、 REDCap database - clinical diagnosis - major feature---23

圖六、 REDCap database - clinical diagnosis - minor feature---24

圖七、 REDCap database - clinical diagnosis - 復健科---24

圖八、 REDCap database - clinical diagnosis - 胸腔科及肝臟、腎臟科---25

圖九、 REDCap database - clinical diagnosis - 神經科---26

圖十、 REDCap database - clinical symptoms---26

圖十一、REDCap database - genetic testing---27

圖十二、受試 222 個家族 TSC 臨床診斷結果---28

圖十三、145 個家族進行基因檢測的結果---28

圖十四、受試家族 TSC1 和 TSC2 的比例---29

圖十五、TSC proband 遺傳/偶發比例 ---29

圖十六、基因變異點各類型的分佈比例---29

圖十七、基因變異類型分類中，在 TSC1 或 TSC2 基因的分佈比例---30

圖十八、TSC338 之 TSC2 基因次世代定序檢測結果---31

圖十九、TSC338 之 TSC2 基因桑格定序檢測結果---31

圖二十、TSC338 之 PKD1 基因次世代定序檢測結果---32

圖二十一、TSC338 之 PKD1 基因桑格定序檢測結果---32

圖二十二、TSC418 之 TSC2 基因桑格定序檢測結果---33

圖二十三、TSC418 之 PKD1 基因桑格定序檢測結果---33

圖二十四、TSC265 的周邊血液及皮膚病灶次世代定序檢測結果---35

圖二十五、TSC411 的周邊血液及皮膚病灶次世代定序檢測結果---35

圖二十六、TSC417 的周邊血液及皮膚病灶次世代定序檢測結果---36

圖二十七、TSC419 桑格定序結果---37

圖二十八、TSC419 次世代定序結果---38

圖二十九、TSC419 第 16 號染色體發生 LOH ---38

圖三十、TSC419 第 16 號染色體發生 LOH ---38

圖三十一、TSC144 (TF042) 家族譜圖---39

圖三十二、TSC144 次世代定序結果---39

圖三十三、TF042 家族桑格定序結果---40

圖三十四、TSC144 minigene insert DNA 設計---40

圖三十五、TSC201 (TF064) 家族譜圖---41

圖三十六、TSC201 次世代定序結果---41

圖三十七、TF064 家族桑格定序結果---42

圖三十八、TSC201 minigene insert DNA 設計---43

圖三十九、TSC160 (TF051) 家族譜圖---44

圖四十、TSC160 次世代定序結果---44

圖四十一、TF051 家族桑格定序結果---45

圖四十二、TSC160 minigene insert DNA 設計---46

圖四十三、TSC203 (TF065) 家族譜圖---47

圖四十四、TSC203 次世代定序結果---47

圖四十五、TF065 家族桑格定序結果---48

圖四十六、TSC203 minigene insert DNA 設計---48

圖四十七、TSC270 (TF085) 家族譜圖---49

圖四十八、TSC270 次世代定序結果---49

圖四十九、TF085 家族桑格定序結果---50

圖五十、TSC270 minigene insert DNA 設計---50

圖五十一、TSC201 家族譜圖---53

圖五十二、TSC419 家族譜圖---53

圖五十三、TSC418 家族譜圖---55

圖五十四、TSC00480 家族譜圖---56

表目錄

表一、結節硬化症臨床診斷標準---4 表二、TSC NGS panel---15

第一章 研究背景與動機

1.1 結節硬化症的疾病介紹

結節硬化症 (tuberous sclerosis complex, TSC) 是一種會系統性影響人體全 身，使各處器官容易產生良性錯構瘤 (hamartoma) 的遺傳疾病，影響的部位包 括：腦部、皮膚、腎臟、肺部、心臟等，患者通常也會有癲癇、心智發展遲緩等 症狀。發病的年齡分布很廣，從嬰兒到成人皆可見。臨床表現每個患者間差異性 很大，從嚴重到輕度都有可能。

結節硬化症在新生兒的盛行率約 1/6000~1/10000[1]，目前無發現族群或性別 上的差異。結節硬化症是一種體染色體顯性遺傳的疾病，大約 1/3 的患者是從父 母遺傳而來，2/3 的患者是本身產生了偶發性基因突變。目前已知結節硬化症是 患者身上的 TSC1 或 TSC2 基因，產生致病性的變異所造成，影響該基因製造出 來的蛋白質功能[2]。在有找到致病基因變異的患者中：約 21%是 TSC1，79%是

TSC2 基因造成[3]。疾病穿透率高 (penetrance)，若兩條染色體其中一條染色體帶

有致病的基因變異，一生中幾乎都會發病。

1.2 結節硬化症的歷史演進

結節硬化症最早被詳細報導出是在 1862 年 von Recklinghausen 首先提出：剛 出生即死亡的嬰兒身上，心臟腫瘤和腦內結節可能存在的疾病關聯性[4]。1880 年 Bourneville 首次深入描述此疾病[5]。1993 年發現了在第 16 號染色體上的 TSC2 基因[6]，1997 年又發現了第 9 號染色體上的 TSC1 基因[7]。2012 年開會制定了 結節硬化症的臨床和基因診斷標準[8]。

1.3 結節硬化症的致病機轉

TSC1 基因位於人類第九號染色體 9q34.3 的位置，由 23 個外顯子組成

(NM_000368)，整個 TSC1 基因共 53,273 個核苷酸，會轉錄出 8.6 kb 的 RNA，轉

譯出 30 kDa 的 TSC1 (hamartin) 蛋白；TSC2 基因位於第十六號染色體 16p13.3 的 位置，由 41 個外顯子組成 (NM_000548.3)，整個 TSC2 基因共 41,255 個核苷 酸，會轉錄出 5.5 kb 的 RNA，轉譯出 180 kDa 的 TSC2 (tuberin) 蛋白。TSC1 和

TSC2 皆屬於抑癌基因 (tumor suppressor gene)，所轉譯出的 TSC1 和 TSC2 這兩個

蛋白會形成一個蛋白複合物 (TSC1-TSC2 complex)，作用於人體內調控細胞生長 的 mTOR (the mammalian target of rapamycin) 路徑中上游，抑制體內細胞過度增 生。

結節硬化症的患者在受精卵形成時，細胞就已在 TSC1 或 TSC2 其中一個等 位基因 (allele) 上，帶有第一個致病性的變異 (first hit)，稱為生殖系突變

(germline mutation)。若在接下來的細胞分裂過程中，有細胞在同一基因的第二的 等位基因 (allele) 上，再發生第二次致病突變 (second hit)，即體細胞突變 (somatic mutation)，則此細胞所在器官或組織的細胞生長會不受控制，而產生腫 瘤[9]。

1.4 結節硬化症的臨床表徵

結節硬化症患者在臨床上的表徵很廣泛，每個人的嚴重程度差異性也很大，

可能表現在皮膚、神經、心臟、腎臟、肺臟、眼部、口腔或其他器官，臨床多因 為癲癇、智能不足、皮膚表徵、全身多處產生腫瘤……等而被發現。任何單一症 狀都不足以診斷為結節硬化症，需要同時符合數個表徵，綜合評估才能下診斷。

不同的臨床表徵，發生在不同的發展階段。例如：腦皮質不良增生 (cortical tubers) 和心臟橫紋肌瘤 (cardiac rhabdomyomas) 發生在胚胎生成時期，是嬰兒時 期結節硬化症表徵的典型。有 90%以上的結節硬化症病人有皮膚表徵。脫色斑 (hypopigmented macules)，通常在嬰兒期 (小於一歲) 或兒童早期 (一至五歲) 發 現；鯊魚皮斑 (shagreen patch) 通常在五歲以後，發生率增加；指甲邊纖維瘤 (ungual fibromas) 通常發生在青春期以後到成人階段；臉部血管纖維瘤 (facial

angiofibromas) 則通常在兒童晚期或青春期被發現。

其他症狀如：腦室管下巨細胞星狀瘤 (subependymal giant-cell tumor) 通常發 生在兒童期或青春期；腎臟囊腫 (renal cysts) 在嬰兒期或兒童早期被發現；血管 平滑肌脂肪瘤 (angiomyolipomas) 發生在兒童期、青春期、成人期；肺淋巴血管 平滑肌增生症 (pulmonary lymphangiomyomatosis) 則常發生在青春期女生或女性 結節硬化症患者[2] 。

1.5 結節硬化症的診斷標準

結節硬化症的診斷標準分為臨床診斷標準和基因診斷標準兩種，只要符合其 中一種，就可以確診患者為結節硬化症。

1.5.1 臨床診斷標準：

表一、結節硬化症臨床診斷標準 主要表徵 (Major features)

1.脫色班 (Hypomelanotic macules) ≥ 3，至少直徑 5mm

2.臉部血管纖維瘤 (Angiofibromas)或頭部纖維化斑塊 (fibrous cephalic plaque) ≥3 個 3.指甲邊纖維瘤 (Ungual fibromas) ≥2 個

4.鯊魚皮班 (Shagreen patch)

5.多個視網膜錯構瘤 (Multiple retinal hamartomas) 6.腦皮質不良增生 (Cortical dysplasias)

7.腦室管下結節 (Subependymal nodules, SENs)

8.腦室管下巨細胞星狀瘤 (Subependymal giant cell astrocytoma, SEGAs) 9.心臟橫紋肌瘤 (Cardiac rhabdomyoma)

10.肺淋巴血管平滑肌增生症 (Lymphangioleiomyomatosis, LAM) 11.腎血管平滑肌脂肪瘤 (Angiomyolipomas, AML) ≥2 個

次要表徵 (Minor features)

1.斑駁樣的皮膚斑 “Confetti”skin lesions 2.牙齒琺瑯質凹痕 (Dental enamel pits) >3 個 3.口腔內纖維瘤 (Intraoral fibromas) ≥2 個 4.視網膜無色斑 (Retinal achromic patch) 5.多囊腎 ( Multiple renal cysts)

6.非腎臟錯構瘤 (Nonrenal hamartomas)

確診：兩個主要表徵或者一個主要表徵加上兩個以上次要表徵。

疑似：一個主要表徵或兩個以上次要表徵。

*若同時有肺淋巴血管平滑肌增生症 (LAM) 和腎血管平滑肌脂肪瘤 (AML) 存在，

僅視為一個主要表徵[8]。

1.5.2 基因診斷標準

經由檢測個案正常組織中的 DNA，在 TSC1 或 TSC2 基因上是否存在一個致 病性變異，做為結節硬化症的基因診斷標準。致病性變異的定義是此變異會明確 造成 TSC1 或 TSC2 基因：

(1)轉譯出來的蛋白質喪失原有的功能，如：移碼突變 (frameshifmutation)、無義 突變 (nonsense mutation)。

(2)無法轉譯出蛋白質，如：大片段的刪除 (large deletion)。

(3)轉譯出的蛋白，過去曾接受過功能性評估，被認為會影響蛋白質原有的功能而 致病，如：錯義突變 (missense mutation)。

其他 TSC1 或 TSC2 的變異點，若無足夠證據確認其對所轉錄出的蛋白質功 能的影響，就無法確診此個案為結節硬化症。大約有 10%~25%的結節硬化症病 人在目前的基因檢測方法下，找不到 TSC1 或 TSC2 致病變異點，因此即使基因 檢測結果正常，仍無法排除是結節硬化症病人[8]。

1.6 結節硬化症資料庫

1.6.1 國際上現有的結節硬化症 LOVD 資料庫

目前國際上已經存在可靠的結節硬化症資料庫有 LOVD (Leiden Open

Variation Database)- Tuberous Sclerosis Database，於 2015 年建立，由英國學者 Sue Povey 和 Rosemary Ekong 收集，針對和結節硬化症相關的 TSC1 和 TSC2 基因，

將 2004~2014 年曾經有研究團隊發現的變異點全都登錄其上，包含 Cardiff- Rotterdam Tuberous Sclerosis Mutation Database 和 David Kwiatkowski's Tuberous Sclerosis Project，以及各出版文獻和各來源提供的資料整合而成。由荷蘭萊頓大 學醫學中心 (Leiden University Medical Center) 持續更新至今，並試著預測各變異 點的致病性。目前此 LOVD 資料庫中，TSC1 基因有 2540 個變異點被紀錄，893 種；TSC2 基因有 7239 個變異點，2610 種。成為目前世界上結節硬化症最完整的

基因變異點資料庫。

但我們在從事結節硬化症的基因檢測時，發現僅約 40%的變異點可以在現有 的 LOVD 資料庫找到紀錄，找不到資料的需要額外搜查文獻，而多數時候在文獻 上也未曾被報導過。可能是因為結節硬化症並沒有特別容易發生基因變異的位點 (hot spot)，也可能是各族群容易發生變異的點位具差異性。

1.6.2 臺灣本土結節硬化症資料

若以全球結節硬化症約萬分之一的發生率來推估，臺灣大約有 2300 名結節 硬化症患者，但目前依健保就醫紀錄，至 2017 年 8 月為止，僅約 557 人就醫確 診。其中有 179 位 (3 成) 曾到臺大醫院看診。近來臺大成功研發出的國內第一支 給結節硬化症患者專用的皮膚外用藥膏 Rapamycin，於 2017 年 9 月始提供給結節 硬化症病人有效的皮膚治療，如此更促使了平時在各地醫院看診或沒在定期追蹤 的病人集中到臺大來看診，使得臺大醫院成為臺灣研究結節硬化症最完整的立 基。臺大的「結節硬化症整合門診」從 2010 年 7 月 12 日開辦，整合了 9 科：神 經科、泌尿科、胸腔科、皮膚科、復健科、心臟科、眼科、牙科、基因醫學部遺 傳專科的醫生，並搭配社工師、心理諮商師、遺傳諮詢師、結節硬化症協會參 與，定期追蹤臺灣結節硬化症病人的肺部、腹部、神經、復健…等，給予病患最 有效的整合性評估和照護。

1.7 結節硬化症在基因檢測判讀上遇到的問題 1.7.1 找不到懷疑的致病變異點

目前臨床症狀評估後確診是結節硬化症的病人，在做次世代定序基因檢測 時，仍有約 10~25%的病人找不到懷疑的致病變異點。可能的解釋原因包括：

(1)尚存在現階段的次世代定序或桑格定序基因檢測方法，無法偵測出的 TSC1 和

TSC2 致病變異型式。

(2)目前只有位在外顯子上下游 1 至 2 個鹼基的內涵子區域發生變異，會被判定為 確定會影響 RNA 剪接 (splicing) 的功能。但會影響基因剪接的 DNA 區域，還可 能位於啟動子 (promoter)、增強子 (enhancer)，或位在更深的內涵子內，而在判 讀上被忽略。

(3)可能是極低比例 TSC1 和 TSC2 基因變異的鑲嵌型 (mosaicism)，在資料分析的 過程中被當成背景雜訊而被忽略。

(4)除了 TSC1 和 TSC2 基因以外，可能還存在第三個或以上的基因，會造成結節 硬化症而尚未被發現或釐清[10-13] 。

1.7.2 找到無法判讀其致病性的變異點(VUS)

最常見難以判定其變異致病性的狀況即是：錯異變異 (missense variant)、非 移碼類型的小片段插入或刪除 (in-frame deletion/insertion)、隱藏在外顯子上下游 1 至 2 個鹼基以外會影響 RNA 剪接的變異 (splice site variant)、太靠近蛋白尾端 不足以造成 nonsense-mediated mRNA decay (NMD) 的 nonsense 突變[14, 15]，如 果基因檢測實驗室本身無足夠資源做進一步 TSC1 或 TSC2 轉錄或轉譯的功能性 評估 (functional assessment)，判讀其致病性就變得較困難。

這些類型的變異點通常需藉助同時檢測其父母或其他患病/非患病家屬是否帶 有相同變異點，比對臨床表現，判定此變異點是否遺傳自父母，在有結節硬化症 疾病的家族各代成員中，此變異點是否有共分離 (co-segregation) 的狀況。搭配 相關軟體如：SIFT[16, 17]、Polyphen-2[18, 19]、HSF[20]等預測來推估其致病 性；或者需要仰賴過去世界各國累積在資料庫中的資料紀錄，若資料庫中沒有被 記錄過，或有被報導過但臨床無法確定是否致病時，就會造成基因診斷結節硬化 症的困難。

1.8 TSC1 和 TSC2 基因變異點的功能性評估

針對不確定其致病性的錯義變異 (missense variant)，欲評估其蛋白功能，可 以將帶有目標 TSC1 或 TSC2 錯義變異點的 DNA 送進細胞，利用 in-cell western (ICW) assay 半定量的方式，分別偵測 TSC1 和 TSC2 蛋白被製造出來的量，以及 偵測 S6K 和 T389-phosphorylated S6K 的量。若 T389-phosphorylated S6K 的量較 正常為多，代表 TSC1 或 TSC2 抑制 mTOR 的功能變低，代表此 TSC1 或 TSC2 錯 義變異點具有致病性[21-25]。

針對不確定其致病性、隱藏在外顯子上下游 1 至 2 個鹼基以外會影響 RNA 剪接的剪接位變異 (splicing site variant)，可以利用設計一個 minigene 系統，將懷 疑的剪接位變異所位在最近的外顯子，至其前後一個外顯子的範圍區域，設計特 殊的引子，利用 PCR 的方式，製造此範圍區域的 DNA 片段。將此目標 DNA 片 段利用Gibson assembly 的方式 clone 進 vector 中，送入 HEK293 細胞表現。最後 再抽取 RNA，以 RT-PCR 翻轉回 DNA 序列，做定序，觀察帶有目標剪接位變異 和不帶有目標剪接位變異的基因剪接產物是否有異，來判定此剪接位變異是否具 致病性[26, 27] 。

1.9 遺傳諮詢 (genetic counseling)

美國早在 1969 年就開始針對遺傳諮詢做專業領域的培訓。隨著桑格定序、

次世代定序基因檢測技術逐漸成熟，基因診斷成為趨勢，遺傳諮詢的角色和功能 愈來愈被重視。臺大醫學院從 2004 年以來，也開始培訓遺傳諮詢人才，作為醫 生和病患之間遺傳疾病的溝通橋樑。

1974 年，Fraser 醫生整理了 1973 年一場美國人類遺傳學會 (the American Society of Human Genetics) 的年度會議內容，針對遺傳諮詢進行論辯後所達到的 共識，希望喚起大眾對遺傳諮詢的規範和重視。遺傳諮詢是處理一個家族遺傳疾 病的再發率及風險的一個溝通過程，需要借助一個經過適當訓練的人來幫助個人

及家庭一同面對：

(1)瞭解醫學事實，包含醫學診斷、疾病的可能進程，和可行的處置方法。

(2)理解疾病在此家族間的遺傳模式，在某個家族成員身上及後代的發生風險。

(3)了解針對此疾病的再發風險，有什麼選擇可以應對。

(4)評估他們承擔的風險及其家族目標後，選擇對他們來說適合採取的措施。

(5)對已患病或有患病風險的家族成員，面對疾病做最好的可能調適[28] 。 隨著遺傳諮詢的倫理問題逐漸被重視，1992 年國家遺傳諮詢學院 (National Society of Genetic Counselors, NSGC) 始納入遺傳諮詢的倫理規範 (The Code of Ethics, COE)，並於 2006 年重新修正[29]。2016 年倫理委員會 (the NSGC Code of Ethics Review Task Force, COERTF) 又再次進行道德審查修正[30]。針對遺傳諮詢 人員本身、遺傳諮詢人員和被諮詢者之間、遺傳諮詢人員和其所屬機構之間、遺 傳諮詢人員和整個社會之間的關係、行為，進行倫理規範。

1.10 研究目標

1.10.1 臺大醫院 TSC REDCap 整合型資料庫的建立

有鑒於目前國際上現有的結節硬化症資料庫 Leiden Open

source Variation Database (LOVD)，多來自國外的研究發表，國內結節硬化症患者 的狀況，缺乏系統性的統整和管理。臺大結節硬化症門診從開辦以來，已有 508 位懷疑或確診是結節硬化症的病人及其家屬參與結節硬化症的研究。希望能將這 些寶貴的臨床表徵和基因檢測資料加以統整，在臺大醫院的安全網域下，建立一 個線上的 REDCap 結節硬化症整合型資料庫，成為未來研究或診斷參考的依據。

有別於現有的國際 LOVD 資料庫，除了登錄各個病人基因檢測找到的變異點 以外，另外納入病人的臨床症狀表現以及家族譜圖，也將各科醫師定期追蹤病人 的肺部、腹部、心理行為等所留下的紀錄，一併納入資料庫中。讓我們未來能 更容易做各方面的整合比對，對結節硬化症能有更全面性的研究和了解

1.10.2 結節硬化症患者基因檢測上難解的問題

目前對結節硬化症病人做基因檢測，仍有 10~25%找不到致病變異點，根據 過去文獻，其中主要有可能是屬於鑲嵌型或剪接位變異的病人[12]。鑲嵌型的病 人，因周邊血液中含的致病變異點比例太低，在次世代定序結果判讀時，易被當 成雜訊而忽略。希望能找到一個方法提高低比例鑲嵌型病人的致病變異基因檢出 率。另一種是屬於隱藏在較深內涵子中，會影響基因剪接 (splicing) 的變異點。

若找到懷疑的致病變異點，希望設計一個相應的功能性測試，實際確認此剪接位 變異是否會造成剪接出來的 RNA 與正常的情況下有差異，以確認其致病性。

否則即使臨床上可以確診，若基因檢測無法提供致病的變異點，病人在計畫 生育時，也無法藉由基因檢測防止下一代罹患相同的疾病。會造成結婚和生育的 顧慮和壓力；若臨床診斷也未能確定，病人只能長期追蹤，無法確切知道如何看 待自己的疾病狀況，容易追蹤疏失延誤病情的處置，也無法獲得診療費用的協 助。

另外，如何確認同一患者身上兩個致病變異點在染色體上的相位關係，在次世 代定序基因檢測上也是一個挑戰。若一人同時帶有兩種疾病的致病變異點，且恰好 兩基因位在同一條染色體上，如果要生育下一代，兩變異點的相位關係就顯得重要，

會直接影響病人的疾病會如何遺傳給後代，對於遺傳諮詢是必須了解的資訊。

最後，希望就現有收集到的結節硬化症病人的病灶檢體來探討 second hit 存

在的狀況，以及 second hit 是以什麼樣的角色影響著結節硬化症病人在病灶上的 進程發展。

第二章 研究方法

2.1 研究對象

2.1.1 受試者來源與收案標準：

曾懷疑是結節硬化症，且於臺大醫院結節硬化症整合門診看診的病人中：

(1)同意參與研究提供之 TSC 相關基因檢測的病人及其家屬

邀請加入通過台大倫理委員會審核的研究：「201104026RB 結節硬化症之基 因體學、蛋白質體學及代謝體學研究 (Genomics, proteomics and metabolomics study of tuberous sclerosis complex (TSC)」。

共有 146 個家族 (TF001-TF146)，含 424 位 (TSC001-TSC424) 受試者。其 中 3 個家族共 6 個人中途離開研究，故最終實際進行研究的有 143 個家族，共 418 位受試者。經過臨床表徵評估後，有 117 個家族先證者 (proband) 被醫生判 定為結節硬化症，有 26 個家族先證者 (proband)，被認為實際上非結節硬化症患 者。

(2)同意臨床看診資料、基因檢測結果、相關追蹤檢查紀錄，登錄於 TSC REDCap 資料庫以進行研究整合分析的病人或其家屬

邀請加入通過台大倫理委員會審核的研究：「201801015RIND 建立結節硬化 症之整合型資料庫 Establishment of an Integrated Database of Tuberous Sclerosis Complex (TSC)」。

共有 224 個家族 (TTF00001-TTF00224)，含 514 位 (TTSC001-TTSC514) 受 試者。其中 2 個家族共 6 個人中途離開研究，故最終實際納入資料庫研究的有 222 個家族，共 508 位受試者。經過臨床表徵評估後，有 168 個家族先證者 (proband) 被醫生判定為結節硬化症；10 個家族先證者 (proband)，尚未能確認是 否為結節硬化症患者；44 個家族先證者 (proband)，被認為實際上非結節硬化症 患者。

2.1.2 同意書簽署

被邀請加入「201104026RB 結節硬化症之基因體學、蛋白質體學及代謝體學 研究 Genomics, proteomics and metabolomics study of tuberous sclerosis complex (TSC)」以及被邀請加入「201801015RIND 建立結節硬化症之整合型資料庫 Establishment of an Integrated Database of Tuberous Sclerosis Complex (TSC)」的受 試者，各會簽署該研究的一份符合台大倫理委員會規範之「國立台灣大學醫學院 附設醫院臨床試驗/研究受試者說明及同意書」。

若年紀在 12 歲以上不滿 20 歲的受試者，上述同意書除了受試者本人簽屬之 外，需同時獲得法定代理人的同意及簽名；若年紀滿 7 歲以上不滿 12 歲的受試 者，上述同意書需法定代理人的同意及簽名，而受試者本人簽屬額外提供的兒童 版的同意書，具注音標示且文句較淺顯易懂，以確保兒童理解所進行研究的權 益；若受試者不滿 7 歲，或者受試者本身具認知障礙，則需經由法定代理人的同 意及簽名，始得納入研究。

2.1.3 檢體 (1)周邊血液

抽取受試者週邊血液 10 ml，於 2 管 EDTA 紫頭管。放於室溫馬上處理或置 於 4 度冰箱 2~3 天內完成 DNA 的萃取。

(2)皮膚病灶組織

由皮膚科醫師常規手術切除病灶如：臉部血管纖維瘤或手腳趾甲週邊的纖維 瘤組織，裝於放有生理食鹽水中的離心管中，暫冰於 4 度冰箱一天內馬上處理，

或者倒掉生理食鹽水冰於-20 度冰箱，於一個月內完成 DNA 的萃取。

(3)福馬林/石蠟包埋組織切片(formalin-fixed para-embedded, FFPE)

向臺大病理部申請病人手術切除的 HCC (hepatocellular carcinoma) 肝臟腫瘤 組織 1.3 x 0.1 x 0.1cm，經由福馬林固定和蠟塊包埋後，取厚度 10um 的組織切片 共 4 捲，萃取 DNA。

2.2 研究方法 2.2.1 DNA 萃取

(1)周邊血液白血球 DNA 萃取

使用 QIAgne Gentra Puregene Blood Kit 來萃取 EDTA 管周邊血液中白血球的 DNA。首先將採完血的採血管離心，取中間白血球層 (buffy coat)，放入 5ml RBC Lysis Solution 溶解摻混到的紅血球，接著離心去除上層液，留下的細胞即為 白血球沉澱物。將白血球沉澱物打散後，加入 3ml Cell Lysis Solution，溶解白血 球外層的蛋白質等物質，再加入 1ml Protein Precipitation Solution 將溶出的蛋白質 沉澱出來。離心後留下上層液，加入等體積 Isopropanol，讓白色 DNA 核酸析 出。撈起 DNA 放入 eppendorf，以 500μL 70%酒精清洗兩次後烘乾，再加入 400 μL 10 mM Tris buffer 置於 65℃dry bath 1 小時溶解 DNA，即完成周邊血液的白 血球 DNA 萃取。

(2)皮膚病灶組織的 DNA 萃取

病人經手術切下的皮膚病灶檢體，裝於放有生理食鹽水的離心管，離心去除 生理食鹽水。將檢體置於培養皿上以刀子盡量切碎後，放入乾淨的離心管，加入 3ml Cell lysis solution 及 15μl Puregene Proteinase K 混勻，置於 56℃水浴槽中作 用，待 14-16 小時後檢體完全溶解呈透明膠狀或水狀。再加入 15μl RNase A solution ，混勻後置於 37℃水浴槽作用 15 分鐘。加入 1ml Protein Precipitation 混 勻後離心留下上層液，再加入 4ml Isopropanol，可見白色核酸析出。將上述含核 酸的溶液以每次 1ml 分次轉移入一個乾淨的 eppendorf，以高速離心機離心去除 上清液，如此重複，最後可見 eppendorf 底部管壁有白色沉澱物，再以 500μl 75%酒精重複清洗兩次，離心倒掉上清液後烘乾，最後加入 30-60μl Tris buffer，置於 Dry bath 2 小時溶解 DNA，即完成皮膚病灶細胞的 DNA 萃取。

(3)福馬林/石蠟包埋組織 (formalin-fixed para-embedded, FFPE) 的 DNA 萃取

利用 truXTRAC™ FFPE DNA microTUBE Kit (Column Purification) 進行 DNA 萃取：利用 Covaris Adaptive Focused Acoustics (AFA™) 技術去除石蠟並使組織 重新獲得水分；接著加入 20μl proteinase K 於 56℃下作用 1 小時（視組織大小調 整作用時間）去除蛋白質；再於 80℃下乾浴槽作用 1 小時，去除福馬林造成的 DNA-蛋白質聯結；之後再利用聚焦超聲波裝置 (M220 Focused-ultrasonicator™) 將 DNA 打碎成約 350bp 長的片段；最後再以 NEBNext FFPE DNA Repair Mix 於 20℃下作用 15 分鐘進行 DNA 的修復。

2.2.2 偵測 DNA 品質

使用 Nanodrop 2000 spectrophotometer，取 1.25μl 溶解均勻的 DNA，在核酸 (Nucleic Acid) 模式下，偵測波長 230nm（有機鹽類）、260nm（核酸）、280nm 的吸光值（蛋白質），得知 260/280 比值（核酸純度）、260/230 比值（殘留鹽 類）、核酸濃度。260/280 介於 1.8~2.0 代表核酸純度高；260/230 介於 1.8~2.2 表 示純化過程殘留鹽類較少。接著使用 1% 洋菜凝膠進行電泳，確認 DNA 的大小

與完整性。

2.2.3 TSC panel

涵蓋 mTOR 路徑中，上下游相關基因，共 29 個。其中 4 個基因設計的探針 涵蓋整個基因全長：包含結節硬化症的主要致病基因 TSC1 和 TSC2；以及緊鄰於

TSC2 下游的 PKD1 基因，多次被報導和 TSC2 一併發生缺失，造成 TSC2-PKD1

contiguous gene syndrome [31, 32]；另外是會造成 Birt-Hogg-Dubé syndrome 的

FLCN 基因，因臨床症狀與結節硬化症類似，有時會被誤認為是結節硬化症的病

人[33]。另外的 25 個基因，是過去文獻報導過位於 mTOR 路徑上下游的基因 [34]，或者曾被懷疑可能是造成結節硬化症致病的第三個候選基因[12, 35]，都一 併納入此 TSC panel。以 Roche NimbleGene 探針設計，可涵蓋目標定序區域 (0.5Mb) 的 93.1%（表二）（附錄三）。

表二、TSC NGS panel

4 個基因 (整個基因範圍+上下游)

TSC1 TSC2 PKD1 FLCN

以上 4 個基因包含整個基因全部區域，以及：

TSC1 上游 50kb 以內，下游 20kb 以內

TSC2 上游 50kb 以內，下游接 PKD1，到 PKD1 上游 10kb 以內 FLCN 上游 20kb 以內，下游 10kb 以內

25 個基因 (所有外顯子區域+上下游)

MTOR PRKAA2 IRS1 PLD1 GSK3B

NPRL2 RICTOR TBC1D7 PKHD1 RHEB

DEPTOR MAPKAP1 PTEN DDIT4 NPRL3

RPTOR RPS6KB1 AKT1S1 FKBP8 FKBP1A

PKD2 PIK3CA PRR5 MLST8 DEPDC5

以上 25 個基因包含其所有外顯子區域，以及各外顯子上下游 50bp 內的位置

2.2.4 次世代定序 (next-generation sequencing, NGS)

次世代定序為一種大量平行的定序方式（Massively Parallel Sequencing, MPS），可同時進行大量不同核酸檢體來源的短片段定序，達成高速及高通量的 效果[36]。本研究利用 Illumina 的 Miseq 儀器進行核酸次世代定序。主要流程可 分為以下步驟：

(1) 核酸片段化 (fragmentation) 與建庫 (library construction)

首先利用Qubit 2.0 螢光分析儀偵測 DNA 的含量，調成適當濃度；以 Covaris DNA 超聲波斷裂儀將 genomic DNA 打碎成約 800bp 的黏狀末端 (sticky end) 片 段。使用Illumina TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit，將片段末端不完 整處以End Repair Mix 作用進行修復，並形成平滑末端 (blunt-end)，同時將 DNA 片段5’端磷酸化；再用磁珠 (Sample Purification Beads) 篩去過長和過短的片段；

接著用A-Tailing Mix 作用，將 DNA 片段 3’端加上一個腺嘌玲 (adenylate, A)，提 供後續和接頭 (adapter) 3’端的 T 互補的核酸，以利接合 (ligation) 的進行。

接著利用DNA 接合酶 (ligase) 於片段兩頭接上接頭 (adapter)、索引 (index)、P5 和 P7，接頭 (adapter) 是一段可以讓定序引子 (primer) 結合的序 列，索引 (index) 為用來區分不同檢體來源的標示，P5 和 P7 做為讓 DNA 片段附 著到Miseq 流動池 (flow cell) 表面的媒介。

(2) 捕捉目標基因區域的片段進行擴增 (capture-based target enrichment) 並定序

針對 TSC panel 中欲定序的基因區域，設計相應的 Roche NimbleGene 探針

（probe）捕捉含有這些基因區域之 DNA 片段，以 Illumina 的 Miseq system 進行 定序。使用Illumina MiSeq Reagent Kit v3.，單股 DNA 片段之 P5 或 P7 端隨機和 流動池 (flow cell) 表面的 P7 或 P5 互補結合，並以橋式聚合酶鏈鎖反應（bridge PCR）進行擴增，形成叢集（cluster）。

定序引子 (primer) 和接頭 (adapter) 結合，在 DNA 合成酶作用下，在合成 的同時也進行雙端 (paired-end) 定序。帶有不同螢光的四種鹼基 (dNTPs) 依互補

原則結合上，反覆進行螢光標記的偵測與移除 (fluorescently labeled reversible terminator)，達到大量定序的目的。

(3) 定序資料輸出與分析

Miseq 定序輸出的原始數據為 FASTQ 檔案 (R1 fastq.gz 和 R2 fastq.gz)，需利 用BWA 軟體[37]將數據比對回貼到人類基因體參考序列 (GRCh37/hg19)，輸出資 料為SAM 檔，帶有每個片段被回貼到人類基因體參考序列哪個位置的訊息；利 用Picard 和 GATK 軟體將 SAM 檔轉換成電腦可處理的 bam 檔，再利用 GATK Haplotype 軟體標示出和參考序列不同的變異點位置，並把低於 10%變異點當做 定序背景雜訊而刪除，資料輸出成VCF 檔；最後利用 ANNOVAR 軟體判定變異 點位置落在哪一個基因上，輸出成TXT 檔。從所有在 TXT 檔的變異點中，評估 哪些變異點可能具致病性，同時也搭配可圖示化bam 檔的 Integrative Genomics Viewer (IGV) 軟體檢視定序資料。

2.2.5 變異點致病性的判讀

2.2.5.1 結節硬化症資料庫 (Leiden Open source Variation Database, LOVD)

Tuberous sclerosis database-TSC1:

http://chromium.liacs.nl/LOVD2/TSC/home.php?select_db=TSC1 Tuberous sclerosis database-TSC2:

http://chromium.liacs.nl/LOVD2/TSC/home.php?select_db=TSC2

2.2.5.2 變異點致病性的預測軟體

利用 SIFT[16, 17]、polyphen-2[18, 19]軟體，預測錯異變異點 (missense variant) 的致病性；利用 Human Splicing Finder (HSF) 軟體[20]，預測剪接位變異 (splicing site variant) 的是否會影響基因剪接功能。

2.2.5.3 變異點致病性的綜合判讀準則

依據 The American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) 準則

[38]，將找到的變異點根據：其變異類型是否會造成蛋白沒有辦法被完整製造出 來、過去是否有文獻報導過會造成同位置相同胺基酸變化的致病變異、是否是正 常父母皆不帶有的新發生突變、過去是否有針對此點位的功能性測試、在結節硬 化症人群中此變異點存在的比率是否比在正常人群中存在的比率還高、同家族中 多位患有結節硬化症身上是否都帶有此變異點、變異點致病性預測軟體的結 果……等，將變異點分為：致病性 (pathogenic)、高度懷疑致病 (likely

pathogenic)、臨床意義不明 (variant of unknown significance)、懷疑良性 (likely benign)、良性 (benign)。

2.2.6 聚合酶連鎖反應(PCR)及傳統定序 (sanger sequencing）

次世代定序基因檢測若找到懷疑致病的變異位點：點突變 (SNV)、小片段插 入或缺失，會針對此區域設計相應的引子 (primer)，利用 Promaga GoTag Green Master Mix 和 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 進行聚合酶連鎖反應

(polymerase chain reaction, PCR)，放大此區域片段，再經傳統桑格定序方式 (ABI PRISM BigDye Terminator) 進行確認[39] （附錄一）。

2.2.7 minigene assay

將待測的剪接位變異所在的外顯子，以及其前後一個外顯子的範圍區域，設 計特殊的引子，利用 PCR 的方式，製造此範圍區域的 DNA 片段。將此目標 DNA 片段利用 Gibson assembly 的方式 clone 進 pcDNA3.1 vector 中，送入 DH5α Competent Cells，經培養後，挑菌做 PCR 確認 insert DNA 有接進 vector，且送定 序確認序列正確。並將產物分為兩組，其中一組利用Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit 進行 mutagenesis，製造出欲測試的變異點位。接著萃取純化 plasmid，

transfect 入 HEK293 細胞表現。最後再抽取 RNA，以 RT-PCR 翻轉回 DNA 序 列，做定序，觀察帶有目標剪接位變異和不帶有目標剪接位變異的基因剪接產物

是否有異，來判定此剪接位變異是否具致病性（附錄一、附錄二） [26, 27] 。

2.2.8 REDCap 資料庫

在臺大醫學院的網路下建構結節硬化症 REDCap 資料庫，REDCap 是一個安 全的網路應用平台，可用來建立與管理線上資料庫與問卷。提供自動化的程序，

可搭配各種統計軟體格式 (Excel, SPSS, SAS ,Stata, R) 或連結其他外部應用程 式，也可簡單產生個人化需求的報表，大批匯入或匯出資料。便於資料管理、備 份和應用，也利於多人共同編輯、分享[40]。

2.2.9 PhenoTips 家族譜圖繪製

納入研究受試者及其家族時，用單機版的 PhenoTips 軟體統一繪製家族譜圖 (pedigree)。PhenoTips 可以多人共同編輯，且可隨著家族成員狀況做更動修改[41]

。

第三章 研究結果

3.1REDCap 資料庫

3.1.1 REDCap 表單及項目欄位

TSC REDCap 總共含有七大類表單，每一個表單之下又設有各相關子項目。

七大類表單包括：

(1) 受試者納入研究的基本資料 (TSC enrollment list)

此表單是紀錄受試者納入本研究案時，登錄的基本資料。包含個人基本資 料、受試者及其家族的研究編號、結節硬化症診斷概要等。

(2)結節硬化症及相關疾病就醫紀錄 (medical history)

此表單紀錄受試者在來台大醫院就診之前，是否有結節硬化症相關的就醫紀錄。

圖二、 REDCap database - medical history

(3)結節硬化症家族史 (family TSC history)

此表單紀錄受試者的家人是否有結節硬化症相關表徵，及是否做過相關基因 檢測，並記錄受試者家族譜圖 (pedigree)。

圖三、 REDCap database - family TSC history

(4)教育程度及工作狀況 (education and occupation)

此表單紀錄受試者在各個階段的教育程度及工作狀況，可供評估受試者的智 力發展和社會適應能力情形。

圖四、REDCap database - education and occupation

(5)臨床診斷 (clinical diagnosis)

包含各項結節硬化症臨床診斷標準中的 11 項主要表徵 (major feature) 和 6 項次要表徵 (minor feature) [8]，提供可以上傳圖檔紀錄以及文字描述的空間，並 加上牙科、復健科、肺臟、肝臟、腎臟、神經各科別的專屬紀錄追蹤細項。

圖五、REDCap database - clinical diagnosis - major feature

圖六、REDCap database - clinical diagnosis - minor feature

圖七、REDCap database - clinical diagnosis - 復健科

圖八、REDCap database - clinical diagnosis - 胸腔科及肝臟、腎臟科

圖九、REDCap database - clinical diagnosis - 神經科

(6)臨床表現症狀 (clinical symptoms)

做為受試者一開始納入研究時的問卷調查表單，整體性地了解受試者的臨床 表現。

圖十、REDCap database - clinical symptoms

(7)基因檢測結果 (genetic testing)

記錄受試者納入本研究後，以次世代定序的方式做出的基因檢測結果。若已 知家族致病點位，則直接以桑格定序針對特定點位作確認。或受試者已在外面做 過基因檢測且不重覆進行，則直接記錄其點位。

圖十一、REDCap database - genetic testing

3.1.2 臺大醫院結節硬化症整合門診病人的基因檢測結果統計

總共納入 222 個家族，其中有 168 個家族臨床確診為結節硬化症；10 個家族 臨床懷疑為結節硬化症但尚不足以確診；44 個家族原本被懷疑是結節硬化症，經 過轉介來臺大醫院評估後認為非結節硬化症（圖十二）。

此 168 個臨床確診為結節硬化症的家族中，有 23 個家族選擇不做基因檢 測，剩下的 145 個家族都進行次世代定序基因檢測。有 88%的家族有在 TSC1 或

TSC2 基因上找到確定或高度懷疑致病的變異點；3%的家族有在 TSC1 或 TSC2 基

因上找到變異點，但尚無法確認其致病性；9%的家族在 TSC1 或 TSC2 基因上均 沒有找到任何懷疑致病的變異點（圖十三）（附錄四）。

圖十二、受試 222 個家族 TSC 臨床診斷結果

圖十三、145 個家族進行基因檢測的結果

在 88%有在 TSC1 或 TSC2 基因上找到確定或高度懷疑致病變異點的家族 中，20%的致病變異點位在 TSC1 基因，80%的致病變異點位在 TSC2（圖十 四）。約 30%的致病變異點是從父母遺傳而來，70%的結節硬化症病患是自發性 產生的致病變異點（圖十五）。

圖十四、受試家族 TSC1 和 TSC2 的比例 圖十五、TSC proband 遺傳/偶發比例

基因變異點各類型的分佈比例，以造成終止密碼子提前產生的變異點 (stop- gain SNV) 佔的比例最高 (32%)，其次是造成移碼的小片段刪除 (17%)、剪接位 變異 (16%)（圖十六、圖十七）。

圖十六、基因變異點各類型的分佈比例

圖十七、基因變異類型分類中，在 TSC1 或 TSC2 基因的分佈比例。

3-2 結節硬化症患者基因檢測上難解的問題

3-2-1 確認同一患者身上兩個致病變異點在染色體上的相位關係

TSC338 於 2014 年加入研究，進行次世代定序基因檢測，發現此個案同時帶 有 TSC2 基因約 0.2 Mb 的大片段缺失（圖十八）以及 PKD1 基因帶有一個 SNP 變異導致終止密碼子提前出現（圖二十、圖二十一），使兩基因皆失去功能。

(1)TSC2 基因約 0.2 Mb 大片段缺失

圖十八、TSC338 之 TSC2 基因次世代定序檢測結果- TSC2 約 0.2 Mb 大片段缺失 由 IGV 軟體上可見 TSC2 基因的定序深度從平均約 200 倍降為 100 倍，可見 此區域有大片段的缺失。針對 IGV 圖上看到的前後斷點，設計一組引子（附錄 一），若個案的染色體上帶有此大片段缺失，則可以經由 PCR 產生一產物，並可 經由桑格定序出來。由定序出的序列可確定此大片段缺失的範圍為第 16 號染色 體 192227745 至 2138606 的位置，總共有 215862 個核酸缺失（圖十九）。

圖十九、TSC338 之 TSC2 基因桑格定序檢測結果- TSC2 共有 215862 個核酸缺失

(2)PKD1 基因變異導致終止密碼子提前出現

圖二十、TSC338 之 PKD1 基因次世代定序檢測結果-PKD1 (NM_000296) ex15 c.3561C>A; p.Y1187X

圖二十一、TSC338 之 PKD1 基因桑格定序檢測結果- PKD1 (NM_000296) ex15 c.3561C>A; p.Y1187X

當初因為 NGS 方法上的限制，無法確切釐清 TSC338 帶有的兩個致病變異位 置之相位狀況 (haplotype)，因為 TSC2 和 PKD1 基因皆位於第 16 號染色體上，且 兩個變異位置之間的距離過長，無法藉由 NGS 定序片段 (read) 上帶有的其他 SNP 做推斷。如今 TSC338 的兒子 (TSC418) 也來做檢驗，即可釐清 TSC338 的 兩個致病變異是否位於同條 16 號染色體上。若位於同條 16 號染色體上，則兒子 (TSC418) 理論上會同時遺傳到父親 (TSC338) 的兩個致病變異；反之，若位於

200X coverage

不同條 16 號染色體上，則兒子 (TSC418) 只會遺傳到其中一種致病變異。但也 代表父親 (TSC338) 若想要再有一個後代，則必會遺傳到其中一種疾病。

將兒子 (TSC418) 周邊血液檢體針對此兩致病變異做桑格定序，確認皆和其 父親 (TSC338) 相同，同時帶有此兩致病變異（圖二十二、圖二十三），也藉此 確認這兩個基因變異是位於同一條 16 號染色體上。

圖二十二、TSC418 之 TSC2 基因桑格定序檢測結果- TSC2 有 215862 個核酸缺失

圖二十三、TSC418 之 PKD1 基因桑格定序檢測結果- PKD1 (NM_000296) ex15 c.3561C>A; p.Y1187X

3-2-2 提升低比例 TSC1 或 TSC2 鑲嵌型患者的基因檢測檢出率

根據 two hits 理論[42]，我們預期在結節硬化症病人皮膚病灶的檢體中，找到 除了病人當初基因檢測找到的生殖細胞突變 (first hit) 之外，可以再找到第二個 體細胞突變 (second hit)。若患者屬於較低比例的生殖細胞變異鑲嵌型，導致判讀 上被忽略，可以藉由檢測皮膚病灶的 DNA，先找到 second hit，而依據 second hit 所在的基因是 TSC1 或 TSC2，推估 first hit 也在同一基因上，藉此縮小尋找低比 例鑲嵌型生殖細胞變異的範圍，提高低比例鑲嵌型病患的基因檢測檢出率。

但實際上我們將皮膚病灶檢體進行 NGS 後，並未發現 second hit，可能是取 檢時沒有取到或者只含少量帶有 second hit 的 fibroblast-like 細胞[43]，但可以觀察 到的是：皮膚檢體內含的 first hit 比例比周邊血液還要高[12]。可能是因為鑲嵌型 患者身上所含帶致病點的細胞，在體內並非均勻分布，而是有些組織或器官帶有 致病變異的比例較高，而有些正常細胞比率較高。而含致病變異點比率較高的組 織或器官較易產生病灶，故取病灶組織周圍的細胞，其 first hit 的比例相較於周邊 血液，可能是比較高的。

因為目前我們次世代定序出來的資料進行分析時，會將低於 10%的變異訊號 當作是背景雜訊而過濾掉。因此若鑲嵌型病人周邊血液的變異點比例低於 10%，

或者較難在 IGV 軟體被確認的結構性異常，就會被忽略掉，變成沒有找到致病變 異點的狀況，如在此描述的 TSC256 (7%)、TSC411 (4.7%)、TSC417 (28%)。而此 3 位病人的 first hit 皆在我們分析他們的皮膚病灶基因時，因含量比例提高至超過 10%：TSC256 (17%)、TSC411 (13.7%)，或者在 IGV 軟體檢視下使結構性異常較 易被確認：TSC417 (35%)，使 first hit 意外地被發現（圖二十四、圖二十五、圖 二十六）。

圖二十四、TSC265 的周邊血液及皮膚病灶次世代定序檢測結果- TSC2 (NM_000548) c.2498_2499del; p.I833fs [44]

圖二十五、TSC411 的周邊血液及皮膚病灶次世代定序檢測結果-TSC2 (NM_000548): c.5170C>T; p.Gln1724* [44]

200X coverage

200X coverage

400X coverage

400X coverage

圖二十六、TSC417 的周邊血液及皮膚病灶次世代定序檢測結果-TSC1 ex19 (NM_000368) 結構性異常

900X coverage 400X coverage

3-2-3 檢測 HBV+HCC 的結節硬化症病人的 second hit

個案 (TSC419) 周邊血液於 2016 年的基因檢測結果（圖二十七），和其女 兒帶有同樣的

TSC2 基因突變第 18 外顯子 (LOVD) c.2086 T>C, p.Cys696Arg 之錯

義突變（異型合子），進而影響的 TSC2 蛋白功能。

圖二十七、TSC419 桑格定序結果-TSC2 exon18 (LOVD) c.2086 T>C

個案 (TSC419) 於 2017 年取肝臟腫切片進行基因檢測，發現 TSC2 基因在原 本發生 germline mutation 的位置：第 18 外顯子 (LOVD) c.2086 T>C 異型合子 (heterozygous) 變為全部為 c.2086 T>C 突變型，而且次世代定序讀值深度 (read depth) 約 20，只有總平均讀值深度約 50 的一半，顯示此區域發生 (loss of heterozygosity, LOH) 的現象（圖二十八），也就是此位置從原本 50%T/50%C，

變成只剩50%C，而原本 50%T 所在的那一股片段發生缺失。而此 LOH 區域在進 行本TSC panel 的範圍下，涵蓋第 16 號染色體上的 NPRL3、PKD1、MLST8 等基 因共至少約 2.1Mb 以上（圖二十九、圖三十）。

圖二十八、TSC419 次世代定序結果-TSC2 exon18 c.2086T>C, p.Cys696Arg

圖二十九、TSC419 第 16 號染色體發生 LOH- 涵蓋第 16 號染色體上的 NPRL3、

TSC2、PKD1、MLST8 等基因共至少約 2.1Mb 以上

圖三十、TSC419 第 16 號染色體發生 LOH- 涵蓋第 16 號染色體上的 NPRL3、

TSC2、PKD1、MLST8 等基因共至少約 2.1Mb 以上

3.2.4 利用 minigene 來確認基因剪接 (splicing) 狀況

案例一、TSC144 (TF042)

1.臨床表徵

受試者 (TSC144) 為其家族 TF042 第一個被發現有結節硬化症的人。其父親 (TSC176) 和母親 (TSC145) 同時也加入研究。

圖三十一、TSC144 (TF042) 家族譜圖

2.基因檢測

在受試者 (TSC144) 找到一個懷疑會影響 splicing 的變異點：TSC2

(NM_000548) exon19: c.1947-3C>G (heterozygous)，過去此位點也沒有被文獻報導 過的紀錄，故無法斷定其影響 splicing 的實際狀況。

圖三十二、TSC144 次世代定序結果- TSC2 (NM_000548) exon19: c.1947-3C>G

30X coverage

以桑格定序確認受試者 (TSC144) 次世代定序發現的變異點，並同時對其父 親 (TSC176) 及母親 (TSC145) 針對相同點位進行桑格定序，確認其無結節硬化 症表徵的父母不帶有此位點。為受試者 (TSC144) 身上新發生的變異 (de novo)。

TSC176 (父親) TSC145 (母親)

TSC144 (proband)

圖三十三、TF042 家族桑格定序結果-TSC144、TSC145、TSC176

3.Human Splicing Finder (HSF) 軟體預測及 ACMG 判讀

軟體預測 TSC2 (NM_000548) exon19: c.1947-3C>G，改變了原本的 acceptor site，可能會影響 splicing[20]。且此變異點為 de novo。根據 ACMG 準則屬於高度 懷疑致病的程度[38]。

4.minigene insert DNA 設計

圖三十四、TSC144 minigene insert DNA 設計

案例二、TSC201 (TF064)

1.臨床表徵

受試者 (TSC201) 為其家族 (TF064) 第一個被發現有結節硬化症的人。其父 母親、配偶、弟弟、兩個兒子同時也加入研究。其父親、弟弟、一個兒子，在臨 床上也有結節硬化症相關的臉部皮膚表徵，但先前都沒有特別確診或追蹤。

圖三十五、TSC201 (TF064) 家族譜圖

2.基因檢測

在受試者 (TSC201) 找到一個懷疑會影響 splicing 的變異點：TSC2

(NM_000548) exon2: c.138+5G>T (heterozygous)。在 TSC2 LOVD 資料庫沒有查到 曾發現 c.138+5G>T 的紀錄，但可查到過去曾有被文獻報導過 4 次 c.138+5G>A，

認為具致病性[45, 46]。

圖三十六、TSC201 次世代定序結果- TSC2 (NM_000548) exon2: c.138+5G>T

90X coverage

以桑格定序確認受試者 (TSC201) 次世代定序懷疑的變異點，並對其父親 (TSC412)、母親 (TSC413)、配偶 (TSC403)、弟弟 (TSC414)、大兒子

(TSC402) 、二兒子 (TSC401) 針對相同點位進行桑格定序，確認其有結節硬化 症表徵的父親 (TSC412)、弟弟 (TSC414)、第二個兒子 (TSC401) 帶有同樣位 點，在其他人身上則不帶有此點位。符合 co-segregation 的原則，帶此變異點位者 為 TSC 病人。為受試者 (TSC201) 從父系家族遺傳而來，並傳給了下一代的第二 個兒子 (TSC401)。

TSC412 (父親) TSC413 (母親)

TSC201 (proband) TSC403 (配偶) TSC414 (弟弟)

TSC402 (大兒子) TSC401 (二兒子)

圖三十七、TF064 家族桑格定序結果-TSC2 (NM_000548) exon2: c.138+5G>T

3.Human Splicing Finder (HSF) 軟體預測及 ACMG 判讀

軟體預測 TSC2 (NM_000548) exon2: c.138+5G>T 會改變原來的 donor site，會 創造一個 exonic ESS (an exonic splicing silencer site)，可能會影響 splicing[20]。且 此變異點符合共分離 (cosegregation) 的原則。根據 ACMG 準則屬於高度懷疑致 病的程度[38]。

4.minigene insert DNA 設計

圖三十八、TSC201 minigene insert DNA 設計

案例三、TSC160 (TF051)

1.臨床表徵

受試者 (TSC160) 為其家族 TF051 第一個被發現有結節硬化症的人。其父母 親和另外三位手足也同時也加入研究。其父親、兩個姊姊、一個哥哥，在臨床上 也有結節硬化症相關的表徵。

圖三十九、TSC160 (TF051)家族譜圖

“？”表示沒經過臨床醫師評估，且受試者表示不清楚家人狀況

2.基因檢測

在受試者 (TSC160) 找到一個懷疑會影響 splicing 的變異點：TSC1

NM_000368 exon8: c.737+3A>G (heterozygous)。在 TSC1 LOVD 資料庫曾被報導 2 次，但不確定其致病性[47, 48]。

圖四十、TSC160 次世代定序結果- TSC1 NM_000368 exon8:c.737+3A>G

以桑格定序確認受試者 (TSC160) 次世代定序發現懷疑的變異點，並對其父 親 (TSC159)、母親 (TSC250)、大姊 (TSC168)、二姊 (TSC170)、哥哥

(TSC169) 針對相同點位進行桑格定序，確認其有結節硬化症表徵的父親

(TSC159)、大姊 (TSC168)、二姊 (TSC170)、哥哥 (TSC169) 帶有同樣位點，在 母親 (TSC250) 身上則不帶有此點位。符合 co-segregation 的原則，帶此變異點位 者為 TSC 病人。為受試者 (TSC160) 從父系遺傳而來。

TSC159 (父親) TSC250 (母親)

TSC168 (大姊) TSC170 (二姊)

TSC169 (哥哥) TSC160 (proband)

圖四十一、TF051 家族桑格定序結果- TSC159、TSC250、TSC168、TSC170、

TSC160

3.Human Splicing Finder (HSF) 軟體預測及 ACMG 判讀

軟體預測此位點 TSC1 (NM_000368) exon 8: c.737+3A>G 會改變原本的 donor site，創造一個 exonic ESS site，可能會影響 splicing[20]。在家族中各患有結節硬 化症的家屬中，此變異點符合共分離 (co-segregation) 的原則，根據 ACMG 準則 屬於高度懷疑致病的程度[38]。

4.minigene insert DNA 設計

圖四十二、TSC160 minigene insert DNA 設計

案例四、TSC203 (TF065)

1.臨床表徵

受試者 (TSC203) 為其家族 (TF065) 第一個被發現有結節硬化症的人。其小 女兒 (TSC204) 同時也加入研究。其另兩個女兒，在臨床上也有結節硬化症相關 的表徵，但先前都沒有特別確診或追蹤，也沒有加入本研究。

圖四十三、TSC203 (TF065) 家族譜圖

2.基因檢測

在受試者 (TSC203) 找到一個懷疑會影響 splicing 的變異點：TSC2

(NM_000548) exon12: c.1257+5G>C (heterozygous)，無法斷定其影響 splicing 的實 際狀況。在 TSC2 LOVD 資料庫沒有被報導過[46]。

圖四十四、TSC203 次世代定序結果- TSC2 (NM_000548) exon12: c.1257+5G>C

以桑格定序確認 TSC 受試者 (TSC203) 次世代定序發現懷疑的變異點，並對其 非 TSC 女兒 (TSC204) 針對相同點位進行桑格定序，確認在女兒 (TSC204) 身上 則不帶有此點位。

TSC203 (proband) TSC204 (女兒)

圖四十五、TF065 家族桑格定序結果- TSC203、TSC204

3.Human Splicing Finder (HSF) 軟體預測及 ACMG 判讀

軟體預測此位點 TSC2 (NM_000548) exon12: c.1257+5G>C 會改變原本的 donor site，創造一個 intronic ESE site，可能不會影響 splicing[20]。根據 ACMG 準則尚未能達到確定或高度懷疑致病的程度[38]。

4.minigene insert DNA 設計

圖四十六、TSC203 minigene insert DNA 設計