利用活性碳纖維乘載皮膚纖維母細胞於傷口修復之應用研究
Development of Wound Dressing with
Activated Carbon Fiber in Wound
Healing Study
何姿嫻 Zih Sian He1、王士豪 Shih-Hao Wang1、林瑞祥 Jui-Hsiang Lin2、葉家麟 Chia Lin Yeh1 陳鈺婷 Yu-Ting Chen1、洪雅萱 Ya-Shiuan Hung1、林宥欣 Yu-Hsin Lin1,*
1中國醫藥大學生物科技學系School of Biological Science and Technology, China Medical University,
Taichung, Taiwan;
2科云生醫科技股份有限公司R&D Center, Bio-medical Carbon Technology Co., Ltd., Taichung, Taiwan,
R.O.C.
*Corresponding Email: [email protected] 一、中文摘要 皮膚傷口的癒合過程中，為達到良好的傷口修 復目的，需一適當的傷口敷料覆蓋在傷口處，以提 供傷口在癒合過程中的良好修復環境及避免細菌 的入侵，造成傷口的感染，同時亦可促進細胞組織 的再生，達到有效的傷口治療。本實驗研究主要為 製備傷口敷料，其敷料上層為結合抗生素的生醫材 料與敷料下層為可承載皮膚細胞的基材。添加抗生 素的傷口敷料主要目的可有效地阻擋外在環境細 菌的入侵，避免傷口的二度感染；結合可承載皮膚 細胞的基材，當覆蓋於傷口患處時，可扮演提供健 康的皮膚細胞並吸引週遭健康組織的細胞聚集，藉 此分泌膠原蛋白以促進傷口的修復。本實驗研究將 所製備的傷口敷料分別在細胞相容性和動物實驗 進行觀察和分析，評估此活性碳纖維乘載皮膚纖維 母細胞的傷口敷料在修復受傷皮膚組織傷口的應 用。由實驗結果得知，製備的雙層型傷口敷料，對 於傷口組織的再生及傷口的修復，有明顯的增進癒 合的效果，極具發展的潛力。 關鍵詞：傷口敷料、皮膚細胞、活性碳纖維 Abstract
Wound healing is a complex and dynamic process that varies according to four phases: homeostasis, inflammation, proliferation, and remodeling. To accelerate the wound healing, an ideal wound dressing should protect the wound from bacterial invasion, maintain a moist wound healing environment, and promote fibroblasts to migrate into the wound situation. In our study, we fabricated the composite wound dressing, which used antibiotic (gentamicin)-loaded biopolymer and another polymer of cultured skin cells. Gentamicin, an aminoglycoside antibiotic, is used to treat many types of bacterial
infections (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus) and induce skin cells secrete type І collagen expression. Meanwhile, in vivo application, the prepared composite wound dressing and gauze were evaluated the wound closure in rat model. Our fabricated composite wound dressing could have the fine ability in wound healing result and the composite wound dressing increase the collagen production to reconstruct the wound in the immuno-histochemical staining. The prepared composite wound dressing could reduce inflammation and promote cell proliferation to accelerate wound healing produce and be a potential clinical treatment in wound healing system.
Keywords: Wound healing, Fibroblasts, Collagen production 二、緣由與目的 皮膚為覆蓋人體表面的最大器官，保護人體不 受外來病原的入侵與外界傷害的第一道防線，在傷 口癒合過程中，一般人通常具有自行修復小面積的 傷口能力。但對大面積傷口或皮膚癒合能力較差的 患者，如糖尿病患者或重度癌症病患者，傷口修復 中除了需要使用抗生素避免傷口感染外，還需要利 用體外皮膚細胞移植技術，才可以達到良好傷口癒 合結果。在修復傷口的過程中，需要一個理想環境， 來達到良好的傷口癒合情況。臨床上為了促進傷口， 為常需要適當的傷口敷料來覆蓋傷口，提供傷口在 癒合過程中的良好環境及避免傷口感染。臨床上常 使用的傷口敷料基材如紗布或 3MTM TegadermTM 的人工皮膚，其功能常僅止於覆蓋在傷口患處的表 面，以避免傷口的再度感染。雖然市售的傷口敷料 基材對傷口具有一定的保護作用，仍無法改善傷口 組織液滲漏的情況與促進傷口的新生組織再生。因 此，如何製備一可同時避免傷口處再度感染及促進
傷口組織的再生，達到有效地治療傷口癒合結果， 是目前研究上的重大課題。在本實驗研究中，為了 同時達到上述目標，本實驗主製備出雙層型傷口敷 料，其敷料上層為結合抗生素的生醫材料與敷料下 層為可承載皮膚纖維母細胞的活性碳纖維。添加抗 生素的傷口敷料主要目的可有效地阻擋外在環境 細菌的入侵，避免傷口的二度感染；結合可承載皮 膚纖維母細胞的活性碳纖維敷料基材，其當覆蓋於 傷口患處時，可扮演提供健康纖維母細胞並吸引週 遭健康組織的細胞聚集，來分泌膠原蛋白以達到促 進傷口修復。本實驗研究將製備的雙層型傷口敷料 分別在細胞相容性和動物實驗的觀察進行分析，評 估傷口敷料在修復受傷皮膚組織傷口應用。 當皮膚受到傷害至癒合的過程中，共可區分為 四個階段，第一階段為凝血期(hemostasis)，血小板 會釋放一些因子，例如: plated derived growth factor (PDGF) 及 transforming factor β (TGF-β) 等，傳遞 訊號給 polymorphonuclear leukocytes (PMNs)及巨 噬細胞(macrophage) ，引起發炎反應和清除傷口壞 死組織。第二階段是發炎期(inflammantion)，血液 及含有胺類的滲出物滲出，使得血管通透性升高及 嗜中性白血球、血小板和血漿蛋白聚集於傷口處， 形成纖維蛋白(fibrin)。第三階段是結締組織增生期 (proliferation)，纖維母細胞移動至傷口處，來生成 膠原蛋白於修復傷口[1,2]。第四階段是組織重塑期 (remodeling)，當膠原纖維相互連結時，使得傷口處 逐漸縮小，達到傷口癒合結果[3-5]。綜合上述皮膚 傷口修復時期，若同時降低傷口發炎情況和促進傷 口處組織的再生，可達到良好傷口修復效果。 傷口敷料應能緊密的貼附在傷口處，除了需具 備良好的抗菌性質以防止微生物的感染[6-8]，亦須 維持良好保溼度和適當的水氣穿透性質，來提供傷 口良好的癒合環境。理想的傷口敷料須具備良好的 生物相容性和無毒性質，更為避免外界病原細菌的 感染，提供良好的抗菌能力，隔離傷口與外界之不 當接觸並減少疼痛來促進組織的修復。傷口敷料組 成，常以天然合成材料(如 polyurethane 和 polyvinyl alchol)與天然高分子聚合物(如: 幾丁聚醣、膠原蛋 白和明膠)組成，除能有效吸附傷口滲出的組織液外， 其高分子聚合物可和抗菌物質(如:奈米金或奈米銀) 結合，有效隔離外界病菌感染達到有效抗菌能力。 三、材料與方法 (一) 生物性材料
本 實 驗 利 用 gelatin 、 poly- γ -giutamic acid (γ-PGA)與 genipin 等生物性材料。材料選擇上還包 括活性碳纖維 (科云生醫科技股份有限公司所提 供)。濃度參數: 6 mg/mL gelatin、6 mg/mL γ-PGA、 2 mg/mL genipin。 (二) 結合活性碳纖維之雙層型傷口敷料的製備 經由傷口敷料的物理與化學性質分析結果得 知，我們選擇typeA gelatin (blood number 300) 與 γ-PGA 溶於 PBS buffer 中，二者最終濃度分別為 10% (w/v) 及 3.75% (w/v) ，接著加入濃度 0.05% 抗生素 gentamicin，再加入交聯劑 genipin 0.05% (w/v) 均勻混合，將此膠體溶液以 10 mL 倒入一直 徑9 cm 的塑膠培養皿中，於室溫交聯 10 hr 後， 將活性碳纖維覆蓋在敷料薄膜表面，覆蓋中需防止 gelatin/γ-PGA 溶液的滲出以阻塞每一根碳纖維上 的孔洞，再將雙層基質傷口敷材置 37℃ 烘箱烘乾， 再UV 燈殺菌做細胞培養與表面型態觀察(圖一)。 (三) 動物實驗 本實驗選取Sprague-Dawley rat，進行動物實驗。 在手術進行過程中，先紀錄老鼠的體重，以麻醉藥 Zoletil 50 (劑量約為0.1 mL/100 g) 進行腹腔注射， 將老鼠進行全身麻醉。當老鼠昏迷後，使用剃毛刀 將老鼠背後的毛髮清除乾淨，讓老鼠趴在手術台上， 使用膠帶固定四肢，再以 75% 藥用酒精消毒老鼠 背部，在老鼠背部兩側各開一約1 × 1 cm2 大小的傷 口。傷口處再使用不同條件的傷口敷料縫合在老鼠 背部的傷口處。手術結束後使用彈性繃帶裹住傷口 和網狀繃帶包紮固定。待手術完成後，分別在不同 天數(2、4、8及12天) 進行觀察，觀察過程為固定 的相機焦距及距離來拍照並記錄傷口癒合面積。 (四) 組織染色 在不同的傷口修復時間中犧牲老鼠，取下老鼠 背 後 傷 口 處 的 皮 膚 組 織 ， 將 皮 膚 組 織 以 4% formaldehyde 固 定 、 包 埋 、 切 片 和 進 行 Haematoxylin-Eosin (H&E) 組織染色。所得到的切 片組織利用正立式顯微鏡下進行觀察，其組織的免 疫反應和血管新生之分布情形。組織切片也使用 Masson Trichrome 組織染色，利用一正立式顯微鏡 來觀察不同傷口敷料條件對傷口處的膠原蛋白新 生情形和影響傷口組織修復時發炎情況。 四、結果與討論 (一) 製備傷口敷料對臨床的菌株之抑菌能力測試 傷口癒合過程中，傷口敷料須有效隔絕外在的 汙染源，避免病原菌的入侵。以提供舒適的修復環 境外，須避免病原菌的入侵。製備傷口敷料的過程 中，選擇包覆抗生素 gentamicin，針對臨床常見的 三種菌株(大腸桿菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌) 進行抑菌能力的分析測試，得知所製備傷口敷料有 具良好的抑菌能力(圖二)。 (二) 承載 RDF 細胞雙層型傷口敷料動物實驗應用 動物手術後，對不同敷料基質進行傷口癒合的 觀察。實驗動物在手術後的傷口癒合觀察，分析傷
口癒 維承 人工 知 型傷 修復 復的 (三 細胞 其所 活率 得知 焦顯 (四 觀察 維 亦 合能 合 天得 口深 載 相比 再生 管新 後 H& 藍色 圈標 的雙 胞的 域 形成 口修 天仍 口組 細胞 可明 布並 (七 纖維 敷料 原蛋 癒合面積的 承載 RDF 細 工皮膚3MT ，綜合上述 傷口敷料與 復過程中，同 的角色，來 三) 結合活性 細胞相容 為結合活 胞進行細胞 所製備的雙 率仍達95% 知 RDF 細胞 顯微鏡下進 四) 動物實驗 動物手術 察(圖五)。傷 母細胞製備 明顯較其他 能力。有承載 深度的癒合 得知，有承 深度癒合情 細胞製備的 比，在傷口 生及傷口修 觀察第 2 新生的表現 第 2 天時 &E 組織染色 色箭頭處) 及 標示) 的表現 雙層型傷口 的生成隨之 )，更在傷口 成薄薄的角 修復的第8 仍未觀察到 組織的 Mas 胞的雙層型 明顯觀察到 並無明顯發 七)共軛焦顯微 維蛋白的表 圖八所示 料與紗布於 蛋白和纖維 的收縮率。動 細胞的雙層 TM TegadermT 述結果，有承 與其他不同條 同時扮演著 來加速傷口癒 性碳纖維的傷 容性 活性碳纖維的 胞毒性的測試 雙層型傷口敷 %，無任何細 胞生長在活 進行螢光影像 驗傷口癒合和 術後，對不同 傷口癒合能力 備的雙層型傷 他不同敷料基 載細胞所製 合已呈現顯著 承載 RDF 細 情況已達至完 的傷口敷料與 口修復過程中 修復的角色， 、4、8 和 1 現。由免疫組 ，因為傷口修 色均可觀察到 及血管的新 現。隨著時間 口敷料在修復 之減少，膠原蛋 口修復後第1 角質層現象， 天，傷口組 到角質層的形 sson Trichro 型傷口敷料於 到新生的膠原 發現(圖六和圖 微鏡觀察皮膚 表現 ，利用承載皮 於共軛焦顯微 維蛋白情形， 動物實驗中， 層型傷口敷料 TM 進行傷口 承載 RDF 細 條件敷料基質 著重要的組織 癒合(圖三)。 傷口敷料對承 的雙層型傷口 試 (MTT assa 敷料對 RDF 細胞毒性的產 活性碳纖維的 像的觀察(圖四 和免疫組織切 同敷料基質進 力觀察中， 傷口敷料其 基材呈現的 製備的雙層型 著差異，更在 細胞的雙層型 完全。綜合上 與其他不同 中，同時扮演 來加速傷口 14 天發炎細 組織染色觀察 修復處於凝 到發炎細胞( 新生(紅色點狀 間的增長，承 復傷口的過程 蛋白逐漸生成 14 天時，發 相對的，對 組織仍呈現發 形成(紫色箭頭 ome 染色結果 於手術後第2 原蛋白生成， 圖七)。 膚組織第一 皮RDF 細胞 微鏡的觀察， 觀察結果， 利用活性碳 料與市售紗布 口修復。結果 細胞製備的雙 質相比，在傷 織再生及傷口 承載 RDF 細 口敷料於 R ay)，結果得知 細胞的細胞 產生。接著， 的情況，由共 四)。 切片觀察 進行傷口癒合 有承載皮膚 傷口修復面 更良好傷口 型敷料其傷口 在手術後第 型傷口敷料其 上述結果，有 條件敷料基 演著重要的組 口癒合。 細胞的生成及 察發現，在手 凝血發炎期， (紫色顆粒狀 狀區域，紅色 承載RDF 細 程中，其發炎 成(淡粉紅色 發現皮膚組織 對照組紗布在 發炎狀態，第 頭處)。根據 果，承載 R 2、4 和 8 天 此現象市售 一型膠原蛋白 胞的雙層型傷 分泌第一型 雙層型傷口 碳纖 布及 果得 雙層 傷口 口修 細胞 RDF 知， 胞存 為 共軛 合的 膚纖 面積 口癒 口癒 12 其傷 有承 基質 組織 及血 手術 由 狀， 色圓 細胞 炎細 色區 織已 在傷 第14 據傷 RDF 天均 售紗 白與 傷口 型膠 口敷 料對皮 維形狀 敷料於 較紗布 層型傷 型膠原 的重建 五、結 綜 層 型 gent 活性 傷口 般市 應用 六、參 [1] K [2] F 1 [3] A 1 [4] S [5] T ( [6] P 7 [7] L a [8] H S 皮膚組織於 狀的螢光分布 於傷口癒合過 布呈現明顯 傷口敷料在 原蛋白及纖維 建。 結論 綜合上述細胞 型 傷 口 敷 料 tamicin 的生 性碳纖維的生 口的修復，有 市售紗布及市 用上，極具發 參考文獻 Kearney JN ( Falanga VJ 15–19. Alsbjorn B ( 18: 127–133. Sheridan RL Tavis MJ, Th 1978) Surg C Phillips TJ ( 794–800. Lansdown and Benfield Hull BE, F Surgery, 107 圖一 於第一型膠原 布。在圖九結 過程中，其纖 。上述觀察結 在傷口修復過 維蛋白的生成 胞及動物實驗 料 ， 其 敷 料 生醫材料與下 生醫素材，對 有明顯增進癒 市售商 3MTM 發展的潛力 (2001) Burns (2000) Adv 1984) Scand . and Moreno hornton J, D Clin North A (1993) J De A, William S (2005) Nu Finley RK : 496–502. 一、傷口敷料 原蛋白型態呈 結果得知，雙 纖維蛋白的螢 結果顯示，所 過程中可同時 成，達到傷口 驗結果，得知 料 上 層 為 結 下層可承載R 對於傷口組織 癒合的效果 M TegadermT 。 s, 27: 545–55 Skin Woun d J Plast Re o C (2001) Bu Danet R and Am, 58: 1233– ermatol Surg ms A, C urs Times, 10 and Miller 料製備流程 呈現細長纖 雙層型傷口 螢光表現也 所製備的雙 時促進第一 口組織修復 知製備的雙 結 合 抗 生 素 RDF 細胞的 織的再生及 ，相較於一 TM於臨床的 51. d Care, 13: constr Surg, urns, 27: 92. Bartlett RH –1248. g Oncol, 19: Chandler S 01: 45–46. SF (1990) 纖 口 也 雙 一 復 雙 素 的 及 一 的 : , H : S )
