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脂肪分解酵素 Pseudomonas cepacia 固定 於奈米纖維膜並應用在生質柴油製程之研究

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Academic year: 2022

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全文

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國 立 成 功 大 學

化 學 工 程 學 系 碩士論文

脂肪分解酵素 Pseudomonas cepacia 固定 於奈米纖維膜並應用在生質柴油製程之研究

Immobilization of Pseudomonas cepacia Lipase onto Nanofibrous Membrane for Biodiesel Production

研 究 生:范逸軒 (Yi-Hsuan Fan)

指導教授:吳文騰 博士(Dr. Wen-Teng Wu)

中 華 民 國 九 十 七 年 七 月 四 日

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(3)

摘要

本論文主要利用電紡織技術將聚丙烯腈高分子材料製備成奈米纖 維膜的形態。使用 amidination reaction 活化聚丙烯腈上的 CN 官能基,

藉此可與脂肪分解酵素上 NH2官能基形成NC-N 共價鍵結,達到脂肪分 解酵素固定在奈米纖維膜上的目標。在酵素固定化程序研究發現活化時 間 5 分鐘、固定化時間 30 分鐘、酵素濃度 0.5 wt%、固定化溫度 50°C 及固定化 pH 值 6 的條件下,可製備出最佳比活性之固定化酵素。測試 酵素安定性方面,固定化酵素儲存於水溶液 20 天後其活性沒有任何的 損失。此外在重複使用次數方面,固定化酵素經 10 次批次使用後仍保 有 其 原 始 活 性 。 酵 素 反 應 動 力 學 方 面 , 固 定 化 酵 素 Vmax 為 18.27 U/mg-protein 和 Km為 88.42 mM 與游離酵素的數值差異不明顯。固定化 酵素經過安定性及反應動力學分析所展現之特性為相當具有發展潛 力,因此進一步將固定化酵素應用於催化大豆油系統反應生成生質柴 油。經最適化反應條件研究發現脂肪酸含量 50%的油脂 10 克、甲醇量 4 克及水量 3.84 克於 30°C 下反應 24 小時即可達到 90%的轉化率,且經 重複使用 10 次後其生質柴油轉化率仍維持在 81.2%,不但改善了酵素製 程之高成本問題,也提升酵素製程生產生質柴油工業化之可行性。

(4)

Abstract

In the study, electrospun polyacrylonitrile (PAN) nanofibrous membrane was activated by amidination reaction for immobilized Pseudomonas cepacia lipase with covalent binding.

For optimized immobilization, different levels of temperature, pH value, immobilization time and enzyme concentration were investigated to determine the optimal specific activity of enzyme. The reaction conditions were obtained as the temperature at 50°C, pH value at 6, immobilization time of 30 min, and enzyme concentration for immobilized lipase of 0.5 wt%. The biocatalytic reaction between enzymatic active site and substrates can be described by using the Michaelis-Menten equation, so the kinetic parameters of immobilized lipase, Km and Vmax, were determined as 88.42 mM and 18.27 U/mg-protein, respectively. Besides, the thermal and pH stabilities of immobilized lipase were improved and still retained the activity as the original one after 10 times repeated uses.

The effects of methanol amount, water content, temperature and content of fatty acid on the conversion of biodiesel were also illustrated and the optimal operation condition was determined. Under the optimal condition, methanol of 4 g, water content of 3.84 g, temperature at 30°C and 10 g oil (contain 50% fatty acid) for biodiesel production, a conversion of 90% was obtained in 24 hours and can remain the conversion of 81.2% after 10 times repeated uses. This effective immobilized lipase demonstrated the high potential for biodiesel production in industrial applications.

Keywords : biodiesel、electrospinning、immobilization、lipase

(5)

誌謝

本論文的順利完成,首要感謝恩師 吳文騰教授這二年來在學問研 究上的指導,並對於研究方向給予邏輯觀念的糾正,以及教導待人處世 之道,使得學生在研究與生活上獲得許多的想法。同時感謝口試委員 張 嘉修教授、吳俊毅教授與張德生教授,對於論文上給予相當多的寶貴建 議,使得本論文內容更加地豐富與完整。也感謝博士後研究員傅俊中博 士在論文撰寫上的指導,讓學生受益良多,在此謹致誠摯的謝意。

在研究所這二年和實驗室同伴們的風風雨雨,是這輩子難忘的過 程。感謝家弘學長在實驗上的教導,誌鴻學長與昇峰學長帶領大家去放 鬆心情,建瑋學長、裕翔學長與宥心學長陪我共同歡樂的時光,志瑞學 長為共遊日本的伙伴。與同學智傑、曼馨不管在實驗方面與平日生活相 處,互相鼓勵與支持最終順利地一起畢業。當然也感謝靜儀、毓涵、佳 瑋與 Devi 學妹們平日的幫忙,辛苦你們了。當然與吳文騰實驗室大家 認識和相處,是我阿胖最幸福的回憶,阿胖愛你們。

最後,在這裡感謝爸媽對我的照顧與栽培,謝謝您們。姐姐與哥哥 都在生活上給予我最大的協助,有你們的支持為我最大的助力,若未來 我的成功則將是你們所創造出來的,謝謝我親愛的家人。

(6)

目錄

摘要... I Abstract...II 誌謝...III 目錄... IV 表目錄...VIII 圖目錄... IX

第一章 緒論...1

1.1 前言 ...1

1.2 研究動機與目的 ...2

第二章 文獻回顧...4

2.1 奈米纖維膜 ...4

2.1.1 奈米纖維膜之製備程序 ...5

2.1.2 電紡織技術之原理 ...7

2.1.3 電紡織技術之操作變因 ...10

2.2 脂肪分解酵素 ...13

2.2.1 脂肪分解酵素之結構特性 ...16

2.2.2 脂肪分解酵素之現況 ...19

(7)

2.3 固定化技術 ...21

2.3.1 固定化方法 ...22

2.3.2 固定化酵素之性質 ...24

2.3.3 固定化酵素之安定性 ...25

2.4 生質柴油 ...27

2.4.1 生質柴油之製備方法 ...31

2.4.2 生質柴油之發展現況 ...34

第三章 實驗藥品與方法...37

3.1 實驗藥品與設備 ...37

3.1.1 實驗藥品 ...37

3.1.2 實驗設備 ...39

3.2 實驗方法 ...40

3.2.1 奈米纖維膜之製備 ...40

3.2.2 脂肪分解酵素種類之選擇 ...41

3.2.3 固定化酵素之製備 ...42

3.2.4 酵素蛋白質定量分析 ...43

3.2.5 酵素固定化之活性分析 ...44

3.2.6 酵素之安定性探討 ...45

(8)

3.2.8 固定化酵素轉酯化大豆油之探討 ...46

3.2.9 脂肪酸之定量分析 ...47

3.2.10 生質柴油之定量分析 ...49

第四章 結果與討論...50

4.1 奈米纖維膜製備 ...50

4.1.1 奈米纖維膜之表面分析 ...50

4.1.2 奈米纖維膜結構之物理特性 ...54

4.2 酵素固定化之參數探討 ...56

4.2.1 活化時間對酵素固定化的影響 ...56

4.2.2 固定化時間對酵素固定化的影響 ...57

4.2.3 酵素濃度對酵素固定化的影響 ...59

4.2.4 固定化溫度對酵素固定化的影響 ...60

4.2.5 pH值對酵素固定化的影響 ...62

4.3 固定化酵素之特性 ...64

4.3.1 酵素反應動力學 ...64

4.3.2 酵素之熱安定性 ...66

4.3.3 酵素之pH值安定性 ...67

4.3.4 酵素之儲存安定性 ...68

4.3.5 固定化酵素之操作安定性 ...70

(9)

4.4 固定化酵素於大豆油系統反應...71

4.4.1 甲醇濃度對生質柴油轉化率的影響...71

4.4.2 反應溫度對生質柴油轉化率的影響...73

4.4.3 反應物比例量對生質柴油轉化率的影響...74

4.4.4 脂肪酸含量對生質柴油轉化率的影響...76

4.4.5 催化油脂反應之操作安定性 ...77

第五章 結論與未來展望...79

5.1 結論 ...79

5.2 未來展望 ...80

參考文獻...82

自述...88

(10)

表目錄

表 2-1a 奈米纖維製備程序比較一覽表... 6

表 2-1b 奈米纖維製備程序之優缺點比較表 ... 6

表 2-2 電紡織參數對奈米纖維形態之影響 ... 11

表 2-3 酵素應用的領域...14

表 2-4 商業化脂肪分解酵素之活性統計表 ...15

表 2-5 微生物來源的脂肪分解酵素於工業上之應用 ...20

表2-6 固定化方法之特性比較表 ...24

表2-7 石化柴油與生質柴油之ASTM品質規範 ...30

表2-8 不同觸媒類型之反應比較表 ...34

表4.1 大豆油反應之實驗參數設計... 72

(11)

圖目錄

圖 2-1 奈米纖維之應用領域與用途 ... 5

圖 2-2 各國大學對電紡織技術研究之統計圖 ... 8

圖2-3 美國電紡織技術之應用與專利統計圖 ... 9

圖2-4 電紡織過程示意圖...10

圖2-5 纖維直徑與比表面積之關係圖 ...12

圖2-6 脂肪分解酵素之結構圖 ...17

圖2-7 脂肪分解酵素在界面上催化之示意圖 ...18

圖2-8 固定化方法之一般分類法 ...23

圖2-9 酵素熱展開失活之概念圖 ...26

圖2-10 不同比例生質柴油之氣體生成百分比 ...31

圖2-11 三酸甘油酯與醇類之轉酯化反應方程式 ...33

圖2-12 全球生質柴油 1991-2003 年產量圖 ...36

圖3-1 電紡織裝置圖...41

圖3-2 固定化脂肪分解酵素於奈米纖維膜之反應機制圖 ...43

圖3-3 脂肪分解酵素轉酯化之反應方程式 ...45

圖3-4 實驗室自製批次薄膜反應器裝置圖 ...48

(12)

圖 4-1 聚丙烯腈奈米纖維膜之SEM圖(5000 倍) ...51

圖 4-2 聚丙烯腈奈米纖維膜之SEM圖(50000 倍) ...51

圖 4-3 活化後聚丙烯腈奈米纖維膜之SEM圖(5000 倍) ...52

圖 4-4 活化後聚丙烯腈奈米纖維膜之SEM圖(50000 倍) ...52

圖 4-5 酵素固定化後聚丙烯腈奈米纖維膜之SEM圖(5000 倍) ...53

圖4-6 酵素固定化後聚丙烯腈奈米纖維膜之SEM圖(50000 倍)...53

圖4-7 聚丙烯腈奈米纖維膜上之水滴接觸角圖形 ...54

圖4-8 酵素固定化後奈米纖維膜上之水滴接觸角圖形 ...55

圖4-9 活化時間對蛋白質固定量之影響 ...57

圖4-10 固定化時間對蛋白質固定量與比活性之影響 ...58

圖4-11 酵素濃度對蛋白質固定量與比活性之影響 ...60

圖4-12 固定化溫度對蛋白質固定量與比活性之影響 ...61

圖4-13 pH值對蛋白質固定量與比活性之影響 ...63

圖4-14 基質濃度對酵素反應速率之影響 ...65

圖4-15 酵素反應速率之Lineweaver-Burk作圖 ...66

圖4-16 溫度對酵素安定性之影響 ...67

圖4-17 pH值對酵素安定性之影響...68

圖4-18 儲存天數對酵素安定性之影響 ...69

圖4-19 固定化酵素之重複使用性 ...70

(13)

圖 4-20 甲醇濃度對生質柴油轉化率之影響 ...73

圖 4-21 反應溫度對生質柴油轉化率之影響 ...74

圖4-22 反應物比例量對生質柴油轉化率之影響 ...75

圖4-23 脂肪酸含量對生質柴油轉化率之影響 ...77

圖4-24 固定化酵素催化油脂反應之重複使用次數 ...78

圖5-1 薄膜過濾分離油脂與脂肪酸甲酯示意圖 ...81

(14)

第一章 緒論

1.1 前言

自工業革命以來,工業迅速地發展不但改善了人類的生活品質,造 就當今文明社會,發展過程中所消耗大量石油,造成國際間原油供需失 衡,導致石油價格持續上升,而且使用石油產生的二氧化碳會造成溫室 效應的問題。

石油消耗產生的二氧化碳為溫室氣體主要成分之一,使地球平均溫 度有明顯上升的趨勢,導致北極冰原溶化使得海平面上升,持續衝擊著 地球的生態環境。為了減緩地球年均溫上升的現象,以減少全球溫室氣 體排放為目標。在高石油價格與減少排放二氧化碳的因素下,各國無不 積極開發各種再生性的替代能源,因各國不同地理環境、氣候、政策等 因素,發展替代能源的種類也不盡相同。

目前主要的替代能源包括太陽能、地熱能、風能、生質能等。所謂 的生質能包含有生質酒精、生質柴油與氫能三種,其原料來源主要為植 物,因此使用生質能所產生的二氧化碳量不會超過植物生長所吸收的二 氧化碳量,於是生質能有二氧化碳淨排放量為零的優勢可減緩二氧化碳 的排放。

(15)

在生質能發展方面,生質柴油具有高焓值的優點,並可與石化柴油 混合使用於柴油引擎,因此生質柴油在生質能中為最具有發展的潛力。

1.2 研究動機與目的

生質柴油的原料主要為植物或動物的油脂,生產生質柴油的製程可 分為鹼製程、酸製程和酵素製程三種。生質柴油的優點在可和石化柴油 混合使用,不須修改目前市面上的柴油引擎,因此相當受到矚目。在工 業上,主要以鹼製程生產生質柴油,其優勢為生產成本低和反應時間 快,但是要求高純度原料、分離純化困難以及會產生大量廢液等缺失需 改善;此外,以酸製程生產生質柴油,存在著反應速率緩慢且會產生廢 液等問題,為需要改進之要點。由於環保意識的抬頭,脂肪分解酵素生 產生質柴油擁有低污染的優點,引起學者投入發展相關之研究,許多研 究指出酵素製程由於脂肪分解酵素成本高與易被低碳數醇抑制或毒 化,為酵素製程需改善的缺失。在 1916 年 Nelson 和 Griffin 提出酵素固 定化的構想(Nelson et al., 1916),將酵素固定於載體之上製備成固定化 酵素,將有利於酵素的回收並可再重複使用,進而降低酵素製程生產成 本;經固定化程序後,穩固了酵素的構形可防止被低碳醇毒化,使得酵 素失活可能性降低,因此藉由固定化技術的應用將可提升酵素的安定

(16)

奈米科學技術為各國積極發展的科技,此技術製備出的奈米材料擁 有高比表面積、體積小等優點,可表現出不同大尺寸的特性,使得其應 用領域廣泛於是受到學者的矚目。奈米材料在結構上可分為奈米顆粒、

奈米纖維以及奈米管三種形態,其中奈米纖維的構形為線狀,具有高機 械強度與高孔隙度的優點,使得奈米纖維廣泛應用於微導線與微光纖方 面。目前已可應用電紡織技術製備奈米纖維,此技術以成本低、程序簡 單及可連續式操作的優勢受到青睞。

由於酵素製程生產生質柴油主要礙於生產成本過高及酵素不易回 收等缺失可供改進的方向,因此本研究希望藉由固定化技術,將酵素固 定於高比表面積之奈米纖維上,以提升酵素的固定量及提高固定化酵素 之安定性,並且增加固定化酵素重複利用之可能性。此外,透過實驗方 式探討固定化酵素之影響變因,以求得最佳操作參數,期望發展出酵素 製程並進一步將其應用於生產生質柴油。

(17)

第二章 文獻回顧

2.1 奈米纖維膜

奈米技術的發達,開啟奈米材料的研究風潮,由於奈米材料表現出 不同以往大尺寸材料的物理效應,有小尺寸、表面與量子尺寸效應等,

造就了相同材料卻擁有著廣泛的用途,因此受到學者的青睞。奈米材料 在結構上可分為奈米顆粒、奈米纖維以及奈米管三種形態,其中奈米纖 維具有高機械強度與高孔隙度的優點,使得其廣泛應用於奈米纖維薄膜 之領域。

奈米纖維(nanofiber)結構為長條狀圓柱體直徑可達到奈米級的尺 寸,擁有高表面積及高孔隙度等特性,使得奈米纖維已應用於醫療、能 源與環境工程的領域,如圖 2-1 所示。例如:生物降解性的天然材料纖 維素與甲殼素製備成奈米纖維,發展了人體可消化醫療敷料,不但有奈 米尺寸的優勢,而且材料性質有助於提升奈米纖維的應用領域。奈米紡 織品在市場上的需求量逐漸地提升,Nonwovens Report International 研 究報告預測奈米技術紡織品市場需求於2012 年提升到 1150 億美元的價 值(Shri, 2006),因此奈米纖維為相當具有應用價值性。

(18)

圖2-1 奈米纖維之應用領域與用途(Ramakrishna et al., 2006)

2.1.1 奈米纖維膜之製備程序

由於奈米纖維比一般纖維具備了高比表面積與高孔隙度等優勢,於 是其未來發展性相當具有前景。直至目前為止,製備奈米纖維可分為五 種不同程序,其中包括有抽絲製程(Drawing)、模板聚合(Template synthesis)、相分離法(Phase separation)、自組裝程序(Self-assembly)

以及電紡織技術(Electrospinning)。此五種程序製備奈米纖維各有不同 的優勢,其優缺點及特性比較如表2-1a 和表 2-1b 所示。從表 2-1a 和表 2-1b 中可發現,以電紡織技術製備奈米纖維不僅成本較低且程序簡單,

更重要的是電紡織技術工業化之可能性較高,有利於大量生產以供應市 場需求。由於各方面發展結果顯示,電紡織技術優於其他四種製程,因 此本研究選用電紡織技術來製備奈米纖維。

(19)

表2-1a 奈米纖維製備程序比較一覽表(Ramakrishna et al., 2005)

程序 發展規模 工業化可行性 重複使用 製備過程 品質

抽絲製程 實驗室 否 可 簡單 低

模板聚合 實驗室 否 可 簡單 高

相分離法 實驗室 否 可 簡單 低

自組裝程序 實驗室 否 可 複雜 低

電紡織技術 實驗室 可 可 簡單 高

表2-1b 奈米纖維製備程序之優缺點比較表(Ramakrishna et al., 2005)

程序 優點 缺點

抽絲製程 製造成本低廉 不可連續式操作

模板聚合 纖維製備容易

相分離法 製造成本低廉 限於特定材料使用

自組裝程序 製備極小纖維 製程複雜

電紡織技術 纖維形態均勻 操作不穩定

(20)

2.1.2 電紡織技術之原理

電紡織技術(Electrospinning)發明於二十世紀初,隨後在 1902 年 被發表於電紡織技術領域的專利(Morton, 1902),此後電紡織技術便引 起學者的注視。1914 年 Zeleny 等學者已開始相關之研究,但當時的研 究只侷限於熔融狀態之物質,以致於發展性不高。直至 1934 年針對於 溶液狀態的物質,開發出三項有關電紡織技術之專利(Formhals, 1934;

1939; 1940),與以往的研究重點大不相同,使得此三項專利為電紡織技 術發展的里程碑。1996 年 Reneker 等人則利用多種高分子溶液來實驗,

驗証了電紡織製程可運用於多種不同性質的高分子溶液中,提供更廣泛 之應用。近年來,由於奈米科技的發展,使得許多學者對電紡織技術產 生興趣,以致於其相關之研究大量增加,証明了電紡織技術的應用是具 有前景,如圖 2-2 與圖 2-3 所示。

電紡織技術發展至今,已可製備出達到奈米尺寸的纖維。以電紡織 技術製備奈米纖維的過程,首先將正負極分別接於金屬噴頭與收集板之 上,藉由微量蠕動幫浦(syringe pump)推動高分子溶液通過金屬噴頭,

並應用高電壓產生靜電效應,在高電壓差的情況下溶液會在噴頭外形成 泰勒錐(Taylor cone),當電壓逐漸升高,所產生的靜電斥力大於溶液的 表面張力(內聚力),溶液隨即脫離泰勒錐射出形成微細的噴射流(jet),

在噴射路徑上高分子溶液中的溶劑會迅速揮發,最後高分子噴射流逐漸

(21)

圖2-2 各國大學對電紡織技術研究分佈之統計圖(Ramakrishna et al., 2006)

(22)

圖2-3 美國電紡織技術之應用與專利統計圖(Ramakrishna et al., 2006)

(23)

接近子噴射流逐漸接近噴頭下方的收集板(collector)時,由於拉扯的 電場面積變大,便會發生展開(splaying)的現象,使噴射出的高分子 分裂成更細小的纖維,沈積於收集板上如圖 2-4 所示。分裂之後的高分 子纖維直徑可藉由電場強度、溶液黏度等變因控制纖維直徑在數毫米到 一百奈米(1 μm~100 nm)間,形成沒有方向性的不織布薄膜(Reneker et al., 1996)。

圖2-4 電紡織過程示意圖(Reneker et al., 1996)

2.1.3 電紡織技術之操作變因

如前所述,奈米纖維的形態會受制於電紡織參數所影響,主要變因 可分為溶液特性、儀器參數與環境因素三部份。表 2-2 整理了電紡織參

(24)

狀物的形成皆會受到參數影響而改變,此外也發現纖維直徑與比表面積 有著密切的相互關係,如圖 2-5 所示。因此可經由電紡織參數的調整,

製備出均勻且高比表面積的奈米纖維,以因應各領域之所需。

表2-2 電紡織參數對奈米纖維形態之影響(Sill et al., 2008)

操作參數 纖維形態

操作電壓 電壓愈高,纖維直徑愈小

操作流速 流速愈快,纖維直徑愈大;流速過大易形成珠

狀物

噴射頭與收集板之距離 距離愈大,纖維直徑愈小;距離過小易形成珠 狀物

溶液濃度 濃度愈大,纖維直徑愈大

溶液導電度 導電度愈大,纖維直徑愈小

溶劑揮發度 揮發度愈大,纖維直徑愈小

(25)

圖2-5 纖維直徑與比表面積之關係圖(Reneker et al., 2006)

(26)

2.2 脂肪分解酵素

脂肪分解酵素(lipase, triacylglycerol acylhydrolases; EC 3.1.1.3)為 水溶性酵素,其作用為代謝和轉換脂質,是人體中不可或缺之蛋白質。

脂肪分解酵素具有基質特異性、位置選擇性和立體選擇性等特點,脂肪 分解酵素依照催化基質不同位置可分為三大類:

(1) 非特異性脂肪分解酵素(non-specific lipase):

此類型酵素的特性可對三酸甘油酯上之酯鍵產生作用,並將三酸甘 油酯完全水解成脂肪酸與甘油,目前此種酵素已被使用於清潔劑中作為 去除油脂的配方。

(2) 1,3-特異性脂肪分解酵素(1,3-specific lipase):

此類型酵素的特性主要針對三酸甘油酯上 1,3 位置之酯鍵進行作 用。由於 2 位置之酯鍵結構不穩定,在醯基轉移作用(acylmigration)

下轉變為 1 或 3 位置之酯鍵後,仍可繼續被酵素作用,此特異性酵素已 被應用於生產特異性結構油品。

(3) 脂肪酵特異性脂肪分解酵素(fatty acid specific lipase):

此類型酵素的特性屬於針對特定脂肪酸結構之酯鍵產生作用。

(27)

近年來,由於科技領域的發展,許多酵素的應用陸續被學者所發 現,如表 2-3 所示。由表中可發現脂肪分解酵素廣泛的應用在各個領域 中,預期脂肪分解酵素的發展相當具有前景,於是往後創造出更多不同 類型之脂肪分解酵素可為發展的方向,表 2-4 整理了目前已商業化之脂 肪分解酵素。

表2-3 酵素應用的領域(Sharma et al., 2001)

領域 應用

科學研究 水解*、合成*、分析、生物轉換*、純化分離 化妝品 皮膚清理*、假牙清洗劑*

醫療診斷與化學分析 血糖、尿酸、膽固醇*、ELISA 系統、酵素電 極、分析套件

治療應用 抗血拴劑、抗腫瘤、消炎劑*、助消化

工業特殊催化 酒類釀造、牛奶製品*、水果,肉品以及蔬菜加 工、澱粉修飾、皮革加工*、紙漿製造*、糖及 糕點加工、果糖製造、清潔劑*、化合物及氨基 酸合成*、廢水處理、棉花乾燥

*表示使用脂肪分解酵素。

(28)

表2-4 商業化脂肪分解酵素之活性統計表(Pencreac’h et al., 2001)

排名 菌種名稱 商品代號 供應商 蛋白質(mg/g) 比活性(U/g)

1 Burkholderia cepacia PS Novo Nordisk 950 252,632

2 Chromobacterium viscosum Purified protein Asahi 1000 138,823

3 Burkholderia cepacia PS (3) Amano 181 306,790

4 Burkholderia cepacia PS (1) Amano 84 167,976

5 Burkholderia cepacia PS (2) Amano 104 120,483

6 Pseudomonas fluorescens Biocatalysts 97 32,912

7 Mucor miehei Novo Nordisk 1000 2,941

8 Thermonyces lanuginosis SP 523 Novo Nordisk 810 1,714

9 Thermonyces lanuginosis Novo Nordisk 1000 1,195

10 Candida sp. AY 30 Amano 27 37,004

11 Alcaligenes sp. Biocatalysts 390 2,051

12 Candida (B) Biocatalysts 170 4,594

13 Mucor miehei SP 524 Novo Nordisk 518 1,273

14 Candida rugosa MY 152 3,729

15 Candida cylindracea Biocatalysts 104 4,519

16 Mucor miehei Biocatalysts 171 1,683

17 Candida antartica SP 525 Novo Nordisk 785 23

18 Mucor miehei Lypozyme Novo Nordisk Nd Nd

19 Rhizopus oryzae

(Rhizopus javanicus) Biocatalysts 476 8

20 Penicillium aurantiogriseum Biocatalysts 226 13

21 Rhizopus oryzae

(Rhizopus arrhizus) Gist Brocades 357 7

22 Aspergillus niger Biocatalysts 177 11

23 Aspergillus sp. A6 Amano 165 12

24 Porcine pancreas Biocatalysts 504 2

25 Porcine pancreas Biocatalysts 663 2

26 Mucor sp. M10 Amano 218 3

27 Candida antartica Novozyme Novo Nordisk Nd Nd

28 Bacillus lentus SP 539 Novo Nordisk 1000 0.2

29 Rhizopus niveus Biocatalysts 336 0.3

30 Penicillium roquefortii Biocatalysts 194 0.5

31 Penicillium roquefortii R Amano 90 < 0.7

32 Rhizopus sp. N.conc Amano 123 < 0.5

(29)

2.2.1 脂肪分解酵素之結構特性

脂肪分解酵素的特殊立體結構,主要由稱為蓋子(lid)的 α 螺旋

(α-helix)和平行的 β 摺板(β-sheet)所構成,此 α 螺旋的結構一面為 親水端;另一面則為疏水端,而脂肪分解酵素之活性位置(activity site)

存在 β 摺板上,可經由 X-ray 分析的方式獲得上述資訊如圖 2-6 所示。

脂肪分解酵素為水溶性酵素,但主要與油溶性基質作用,因此酵素 催化反應在油水界面上,如圖 2-7 所示。若無油水界面存在時,α 螺旋 之疏水端會朝向活性位置,使基質難以與活性位置接觸;若油水界面存 在時,此界面之存在可改變 α 螺旋構形,進而讓活性位置曝露與基質進 行反應,此種油水界面接觸而造成的影響,稱為界面活化現象(interfacial activation)。脂肪分解酵素這種特殊結構不但有保護活性位置的功能,

且 有 利 於 酵 素 反 應 於 油 水 界 面 上 , 使 活 性 位 置 更 易 與 受 質 接 觸

(Brozozowski et al., 1991)。

(30)

圖2-6 脂肪分解酵素之結構圖(Eggert et al., 2002)

lid

(31)

oil phase water phase

圖2-7 脂肪分解酵素在界面上催化之示意圖(Paiva et al., 2000)。S:基質;

E:酵素;P:產物;A:球表面積;V:球體積。

(32)

2.2.2 脂肪分解酵素之現況

脂 肪 分 解 酵 素 可 催 化 水 解 反 應 ( Hydrolysis )、 酯 化 反 應

(Esterification)、轉酯化反應(Transesterification)、酸解反應(Acidolysis)

及醇解反應(Alcoholysis),因此其應用相當廣泛,是目前工業上所使用 的重要酵素之一,如表 2-5 所示。

脂肪分解酵素本身屬於生物觸媒,需經由生物培養和蛋白質純化程 序而獲得,因此生產成本相較於化學觸媒高出許多,以致於發展應用上 受到成本的限制。近年來研究指出,將脂肪分解酵素固定於載體上使 用,可提高酵素的安定性並可重複利用,具有降低成本的優勢。有研究 指出將 Candida Antarctica 脂肪分解酵素共價結合在礬土與矽土上後,

可提高酵素的熱安定性(Arroyo et al., 1999)。所以透過酵素固定化的程 序,不僅增加酵素的應用價值,也減少了成本上的不利因素。

(33)

表2-5 微生物來源的脂肪分解酵素於工業上之應用(Vulfson, 1994)

應用類別 功能作用 應用與產品

清潔劑 脂肪水解 移除紡織物中油漬

乳製品 脂肪水解 提升乳製品品質

麵包食品 增加風味 延長保存期限

飲料 增加氣味 飲料

食品添加物 改善品質 美奶滋與添加物

健康食品 轉酯化反應 健康食品

魚肉製品 增加風味 移除肉品脂肪

脂肪與油品 轉酯化與水解反應 人造奶油與脂肪酸

化學用品 特異選擇性與合成反應 化學藥品

藥品 轉酯化與水解反應 特異脂質與消化劑

化妝品 合成反應 乳化劑與潤膚膏

皮革製品 水解反應 皮革產品

紙類製品 水解反應 提升紙類品質

清潔用品 水解反應 去除脂肪

(34)

2.3 固定化技術

固定化的概念始於 1916 年,Nelson 和 Griffin 發現到一種萃取自酵 母的酵素,可被骨碳粉所吸附並仍保持其原有活性;此種現象引起了學 者們注意,並開始著手於固定化方法之研究。1960 年代以後,各國皆積 極 地 進 行 酵 素 固 定 化 的 研 究 , 但 當 時 固 定 化 產 物 稱 為 不 溶 性 酵 素

(insoluble enzyme),直到 1971 年在美國舉行第一次酵素工程會議,才 正式將名稱統一為固定化酵素(immobilized enzyme)。

所 謂 固 定 化 技 術 就 是 利 用 物 理 或 化 學 方 法 將 酵 素 固 定 於 載 體

(carrier)或是擔體(support)之上;或是把酵素分子相互鍵結在一起 卻仍保有酵素活性的方法。透過此項技術製備出的固定化酵素,具以下 特點:

(1) 有效地提升酵素之安定性。

(2) 固定化酵素回收容易,並且可重複使用。

(3) 可連續式操作。

酵素固定化經化學方法的程序,可能會造成酵素部份活性損失,原 因為化學法之操作條件較為極端,當酵素固定於載體上,載體會產生位 阻現象導致質量傳送問題,為需克服與改進的要點。

(35)

2.3.1 固定化方法

固定化方法可依據固定化原理的不同來區分。圖 2-8 整理了目前已 發展的固定化方法,可分為以下三大類型:

(1) 擔體鍵結型(carrier-binding method):

A. 物理吸附法(physical adsorption method):

此原理為利用凡得瓦爾力、親疏水作用、氫鍵及偶極矩吸引等作用 力,將酵素吸附於載體之上。其優點為操作簡便且不會影響酵素構形,

但由於吸附鍵結力較弱,酵素容易在操作過程中而脫附。

B. 離子鍵結法(ionic binding method):

離子鍵結法是藉由酵素與載體之間相反電荷所形成的靜電吸引力

(Electrostatic attraction),而達到固定化的作用。此方法程序簡易,且 比物理吸附更為牢固。但必須維持系統之離子強度、pH 值、溫度及適 當的緩衝液,以防止酵素自載體脫落。

C. 共價鍵結法(covalent binding method):

目前發展共價鍵結合的方式有二種類型,一種為酵素與載體直接以 單一鍵結方式結合的型式;另一種為載體先接一個結合肢(spacer)再 與酵素進行鍵結的型式。共價鍵結法的優點為鍵結力強,酵素不易脫 落,然而固定化條件較為嚴苛且過程複雜,易造成酵素結構改變且損失

(36)

(2) 交聯法(cross-linking method):

交聯法是透過雙或多官能基的反應劑與酵素相互交聯,聚合成不水 溶性之高分子。此方法的優勢為不需載體即可固定,操作簡便;由於交 聯過程會導致大量酵素損耗,且形成孔洞直徑極小導致質傳阻力的問 題,使得交聯法之應用並不廣泛。

(3) 包埋法(entrapping method):

此技術的特點是將酵素包埋於具有網狀結構的膠體顆粒或是微膠 囊內。由於此種方法所形成的基材孔洞大小,通常會使反應基質受到限 制,產生質傳問題造成酵素與基質反應效果不佳。

以上所述之方法各有其特點,因此可根據酵素性質與載體特性,選 擇適合之固定化方法予以應用,比較此五種方法之優缺點如表2-6 所示。

圖2-8 固定化方法之一般分類法(陳國誠,2000)

(37)

表2-6 固定化方法之特性比較表(陳國誠,2000)

性質 物理吸付法 共價鍵結法 離子鍵結法 交聯法 包埋法

製備難度 易 難 易 難 易

失活可能 小 大 小 大 小

結合強度 弱 強 弱 強 強

再生可能 可 不可 可 不可 不可

對象範圍 中等 狹隘 中等 中等 廣

固定成本 低 高 低 低 中

2.3.2 固定化酵素之性質

當酵素經過固定化程序後,所製備出固定化酵素的性質相較於自由 酵素會產生活性可能降低與安定性提升的差異,其主要因素為酵素的構 形改變。由於酵素固定於載體之上,載體為酵素創造一種新的微環境

(microenvironment),但也對酵素產生之位阻現象(steric hindrance),

而影響酵素與基質間的界面作用。此種位阻現象使得基質不能自由的擴 散到所有的酵素分子內(呂鋒洲、林仁混,1991);另一方面,酵素分

(38)

之改變。如果載體是陰電性的話,固定化酵素最適 pH 值可能會往鹼的 方向偏移;若是陽電性的話,則往酸的方面偏移(Goldstein et al., 1973)。

雖然固定化程序對酵素造成部份特性上的變化,固定化酵素安定性 往往優於自由酵素,主要原因在於酵素被固定後,受到蛋白質分解酵素

(protease)或是環境影響機會降低;同時位阻現象亦能保護固定化酵素 之構形,避免酵素失活。

2.3.3 固定化酵素之安定性

酵素經固定化程序後提升了其安定性為固定化酵素優勢之一,安定 性的提升可使固定化酵素操作於更嚴苛且複雜的反應條件,有助於提高 酵素製程的應用價值性。目前造成酵素失活絕大部份是溫度因素,通常 酵素於高溫下容易發生構形改變,即所謂的部份展開現象(partial unfolding);若酵素分子鍵結於固體載體之上,其分子結構與游離酵素 相比較可更加牢固,使得固定化酵素較不易受到環境因素影響,而發生 失 活 現 象 如 圖 2-9 所示。有文獻指出將酵素多點連接(multipoint attachment)於載體之上,能增強酵素穩定性(Martinek et al., 1977);其 中影響固定化之主要變因,有固定化的時間、pH 值、溫度、緩衝液種 類及抗化劑等,選擇最適條件下進行固定化有助於酵素結構之穩定性提 升(Mateo et al., 2007)。

(39)

對於共價鍵結類型的固定化酵素,造成酵素失活的變因除了熱之 外,還包括有機溶劑與嗜水性等。因此可透過固定化酵素的安定性來辨 別,是否適合此類型固定化方法,其中包含熱安定性、pH 安定性、保 存安定性和操作安定性等,這些都是在酵素經固定化程序後所需要被研 究的重要變因(邱少華,2003)。

圖 2-9 酵素熱展開失活之概念圖(Martinek et al., 1977)

(40)

2.4 生質柴油

生質柴油的發展可追溯到十九世紀,當時 Rudolf Diesel 發明設計出 柴油引擎,並於 1900 年巴黎世界博覽會發表以花生油驅動的柴油引擎

(Tickell, 2000),提倡植物油與石油為同等重要燃料的構想,此為生質 柴油之起源。石油危機的發生導致了石油供應不穩定,於是發展替代燃 料的構想愈來愈受到人們的重視,其中植物油就屬於替代燃料之一。

雖然 Diesel 設計的柴油引擎可採用植物油作為燃料,但是植物油分 子較大且黏度高,在引擎運轉噴射時,易造成噴射效果不彰且發生燃燒 不完全現象;此外植物油揮發性比石化柴油低,不但導致油脂易蓄積於 氣缸內而影響運轉效率,也可能累積於噴射頭之上而影響燃燒。若柴油 引擎採用植物油長期使用下,易造成引擎運轉效率低,因此改善油品特 性為此解決方法。植物油之所以不適用於柴油引擎的原因,主要是因為 黏度太高易導致引擎運轉效率的問題,於是如何有效地降低植物油黏度 為重要的關鍵。目前已發展降低黏度的方法有以下四種:

(1) 稀釋(Dilution):

直接與石化柴油或其他有機溶劑混合稀釋使用。此種方法並不能大 幅度降低植物油黏度,且引擎運作時易產生氧化作用與聚合作用而影響 燃燒。

(41)

(2) 熱裂解(Pyrolysis):

原理為利用高溫加熱的方法,將植物油裂解為較小的分子,達到降 低黏度目的以利於引擎燃燒。由於反應過程需提供高溫環境,亦為高成 本與高能量輸出,因此是否符合經濟效益需進一步評估。

(3) 微乳化(Microemulsion):

利用乳化劑的特性,使植物油能有效分散形成微細的液體粒子,以 達到降低黏度的效果。雖然其燃燒效果良好,但是乳化劑成本過高,因 此降低成本為改善的方向。

(4) 轉酯化(Transesterification):

油脂與甲醇於觸媒下進行反應,生成脂肪酸甲酯(生質柴油),由 於其分子量約為植物油的 1/3,達到黏度下降之目的。由於生質柴油可 直接與石化柴油混合使用,且不需修改目前市面上的柴油引擎,為相當 受到矚目的特點。

綜合以上四種方法所述,可知轉酯化反應較具有發展優勢,為目前 工業上普遍使用的方法。如前所述,利用轉酯化方法生成的產物脂肪酸 甲酯,即為生質柴油(Biodiesel),其特性與石化柴油類似,可直接添加 或混合使用,且不需修改目前市面上的柴油引擎,為生質柴油之一大優 勢,整理出石化柴油與生質柴油之品質規範如表 2-7 所示。由於生質柴

(42)

同,在使用方面具有下列五項優點(Connemann et al., 1999):

(1) 再生性能源:原料為天然物質,因此其毒性低和具生物降解性,且 可永續使用。

(2) 低廢氣排放:生質柴油所含之物質較石化柴油為單純,因此其廢氣 排放量百分比大幅度下降。例如:生質柴油中不含有致癌性芳香烴物 質,圖2-10 顯示了不同比例生質柴油之氣體生成,可發現微粒子(PM)、 一氧化碳(CO)與碳氫化合物(HC)的排放量有明顯的減少趨勢。

(3) 使用安全性高:其閃火點(Flash point)較高,為 118°C(石化柴油 為 52°C),不易造成意外或失火。

(4) 混合性良好:目前已有國家將生質柴油添加於石化柴油中混合使 用,例如:美國將 20%生質柴油和 80%石化柴油混合為 B20 混合油供應 公車或卡車使用,在台灣目前採用 B1 混合油供給圾垃車或公車使用。

(5) 燃燒效率高:其十六烷值(Cetane Number)較高,約為 50~85(石 化柴油為 42),且含氧量為 11%,燃燒效果較佳。

根據生質柴油的特性與優勢,目前足以被當作為替代燃料且取代部 份石化柴油,進而減緩環境污染與能源耗竭之問題。

(43)

表2-7 石化柴油與生質柴油之 ASTM 品質規範(Demirbas, 2007)

性質 測試方法 石化柴油

(ASTM D975)

生質柴油

(ASTM D6751)

閃火點 D 93 325K 403K

水分與沉澱物 D 2709 低於0.05 vol% 低於 0.05 vol%

動黏度 D 445 1.3-4.1 mm2/s 1.9-6.0 mm2/s

灰份 D 874 — 低於 0.02 wt%

灰份 D 482 低於0.01 wt% — 硫含量 D 5453 低於0.05 wt% —

硫含量 D 2622/129 — 低於0.05 wt%

銅片腐蝕 D 130 低於No. 3 低於No. 3 十六烷值 D 613 高於40 高於47 芳香族含量 D 1319 低於35 vol% —

碳含量 D 4530 — 低於0.05 mass%

碳含量 D 524 低於0.35 mass% — 蒸餾溫度 D 1160 555K-611K —

(44)

圖 2-10 不同比例生質柴油之氣體生成百分比。0%:純石化柴油。

(Demirbas, 2007)

2.4.1 生質柴油之製備方法

轉酯化反應是目前轉化植物油反應生成生質柴油最常用的方法,其 反應方程式如圖 2-11 所示。依照其不同類型的觸媒,可將轉酯化方法區 分為以下三種製程:

(1) 鹼製程(Alkali-catalyzed process):

反應物主要為三酸甘油酯與甲醇,於鹼觸媒條件下催化反應生成生 質柴油和甘油,由於其反應時間短且觸媒成本低廉,為目前工業上採用 的製程。不過此製程對原料品質需求純度較高,若系統中含水量高於

(45)

0.06 wt%易使催化反應轉為皂化反應(Wright et al., 1944),形成副產物 脂肪酸鈉(肥皂),並造成生質柴油產率下降;此外油脂中游離脂肪酸 含量高於 0.5%,易使脂肪酸與強鹼反應生成肥皂,導致觸媒量不足且使 得反應速率變慢(Ma, 1999)。然而在純化生質柴油的水洗過程,產生了 大量廢液造成環境污染問題,為此程序迄需改善的重點。

(2) 酸製程(Acid-catalyzed process):

目前應用於生產生質柴油之酸觸媒都以硫酸或鹽酸為主(Ma, 1999)。由於此製程的特性與反應機制,可催化反應含水量高與游離脂 肪酸含量高的油品,對不同純度油品皆可催化的特點(Bala, 2005)。但 是其反應速率緩慢且會產生廢液等問題,導致應用價值與經濟效益相對 低落。因此目前已發展出先進行酸催化再接鹼催化二階段生產生質柴油 的製程,不但可接受粗原料的油脂並且有反應快速等性質,此類型製程 結合了酸鹼催化的優點,使得其應用性更為廣泛(Wang et al., 2006),

然而此製程也存在著酸鹼廢液等缺失,為需改善之要點。

(3) 酵素製程(Enzyme-catalyzed process):

在1996年,Nelson等人提出了應用脂肪分解酵素於生產生質柴油,初 步發現酵素製程可將劣質油脂轉化為生質柴油;而且使用的酵素屬於生 物觸媒,不但擁有反應專一性與生物降解性,以利於生質柴油純化分離

(46)

al., 2007),以上優勢使得其發展性受到注目。之後各國也陸續投入相關 於生質柴油的研究,以尋找生產替代能源的方法。目前酵素製程生產生 質柴油有反應速率慢與酵素成本高等問題需要改善,文獻指出利用固定 化技術將酵素固定於載體之上,擁有重複使用的性質(Martinek et al., 1977),若固定化酵素重複使用次數增加,酵素製程高成本問題將可獲得 改善。因此透過應用固定化技術改善了酵素製程的缺陷,使得酵素製程 的應用具有前景。

由以上簡介可得知三種程序各有其優勢,表 2-8 列出三種製程條件 之比較,顯示了酵素製程擁有低耗能與易純化等特點,因此改善其高成 本問題,將是重要的課題。

圖 2-11 三酸甘油酯與醇類之轉酯化反應方程式

(47)

表2-8 不同觸媒類型之反應比較表(Fukuda et al., 2001)

參數 鹼製程 酸製程 酵素製程

反應溫度 中 高 低

能量消耗 中 高 低

脂肪酸含量 低於0.5% 高 中

含水量 低於 0.06% 低 低

分離純化 因難 因難 容易

廢液問題 有 有 無

生產成本 低 低 高

2.4.2 生質柴油之發展現況

圖 2-12 整理了 1991-2003 年全球生質柴油年產量,其中歐盟國家為 生質柴油主要生產國,而且 1998 年後生質柴油需求量逐漸增加,顯示 使用生質柴油當作替代燃料比例提升,因此生質柴油具有應用價值性的 前景。

由於波灣戰爭導致原油供需失衡導致石油價格上升,法國與德國首 先發展大量生產生質柴油因應此現象,在使用生質柴油作為替代燃料沒

(48)

德國為目前世界上發展生質柴油最有規模的國家,已超過 20 家以上公 司從事生產生質柴油,總生產量每年可達到110 萬公噸以上,供應給全 國加油站來販售;美國發展生質柴油的領域,主要以公務車輛、軍事車 輛、市區公車、校車及國家公國內的特殊車輛先行示範;日本發展以廢 食用油為生質柴油的原料,此方式將廢油價值提升再利用為相當具有應 用價值。

目前國內從事生質柴油的公司,已有台灣新日化、積勝企業、承德 油脂,及玉弘四家,供應全台生質柴油市埸並輔助台灣在生質柴油上的 推動。現階段政府推行生質柴油普及的策略主要分為四個階段進行;第 一階段:鼓勵公營公車使用添加生質柴油的「綠色公車」計畫,目前已 有高雄市與嘉義縣之公車申請使用;第二階段:於96 年 7 月推行「Green County綠色城鄉」計畫,將在市售柴油中添加 1%之生質柴油,建構區 域性生質柴油產製銷供應用體系;第三階段:在 97 年全面實施在市售 柴油內添加 1%的生質柴油;第四階段:將在 2010 年將生質柴油添加比 例提高至 2%,以達成生質柴油利用達 10 萬公秉的發展目標(經濟部能 源局,2008)。

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圖 2-12 全球生質柴油 1991-2003 年產量圖(Lichts, 2003)

(50)

第三章 實驗藥品與方法

3.1 實驗藥品與設備

3.1.1 實驗藥品

1. 脂肪分解酵素(Lipase PS Amano ; EC 3.1.1.3):Pseudomonas cepecia 菌株生產,購自日本 Amano 公司。

2. 三油酸甘油酯(Triolein ; C18:1):分子量 885.43 Da,購自於美國 Sigma 公司,作為反應物使用。

3. 亞麻油酸甲基酯(Methyl linoleate):分子量294.47 Da,購自於美國 Sigma 公司,測定三油酸甲基酯含量。

4. 十五烷酸甲基酯(Methyl pentadecanoate):分子量 256.42 Da,購自 於美國Sigma 公司,測定生質柴油含量使用。

5. 牛血清蛋白(Albumin bovine ; BSA):購自美國 Sigma 公司,建立 蛋白質分析檢量線使用。

6. 蛋白質分析試劑(Bradford reagent):購自美國 Sigma 公司,測定蛋 白質含量使用。

7. 聚丙烯腈(Polyacrylonitrile ; PAN):購自 Scientific polymer 公司,

配製高分子溶液用。

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8. 二甲基甲醯胺(N,N-Dimethyl formamide ; DMF):HCON(CH3)2,購 自TEDIA 公司,配製高分子溶液用。

9. 無水酒精(Ethanol):購自景明化工公司,活化聚丙烯腈奈米纖維膜 用。

10. 濃硫酸(Sulfuric acid):H2SO4,購自Scharlau 公司,活化聚丙烯腈 奈米纖維膜用。

11. 氯化鈉(Sodium chloride):NaCl,購自 TEDIA 公司,活化聚丙烯 腈奈米纖維膜用。

12. 磷酸氫二鉀(Potassium phosphate Dibasic powder):K2HPO4,購自 J.T.Baker 公司,配製 PBS 緩衝溶液用。

13. 磷酸二氫鉀(Potassium phosphate Monobasic crystal):K2HPO4,購 自J.T.Baker 公司,配製 PBS 緩衝溶液用。

14. 大豆油(Soybean oil):購自統一企業公司,生質柴油之反應物。

15. 正己烷(Hexane):購自景明化工公司,稀釋樣品使用。

16. 甲醇(Methanol):購自景明化工公司,生質柴油之反應物。

16. 氦氣(Helium gas):購自雲海公司,氣相層析儀使用。

17. 氫氣(Hydrogen gas):購自雲海公司,氣相層析儀使用。

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3.1.2 實驗設備

1. ELISA 分析儀(ELISA reader):購自 BioTek 公司。

2. 掃描式電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope,SEM):Jeol 公 司製造,JSM-6700F 型。

3. 鍍金機(Coater):Jeol 公司製造,JFC-1600 型。

4. 氣相層析儀(Gas chromatography):購自義大利 Thermo 公司,

FOCUS-GC 型。

5. 氣相層析儀管柱:購自於義大利 Thermo 公司,THERMO TR-FAME Part NO.260M142P 型號。

6. 空氣壓縮機:購自於台灣,FVA-120 型號。

7. 高效能液相層析儀(High performance liquid chromatography):購自 日本 SHIMADZU 公司,LC-9A 型。

8. 紫外光偵測儀:購自日本 SHIMADZU 公司,SPD-10A 型。

9. 層析管柱烘箱:購自 Enshine 公司,Super Co-150 型。

10. 液相層析儀管柱:購自於德國,MERCK C18 逆相層析管柱。

11. 高壓電源供應器(High voltage power supply):購自 Glassman high voltage 公司,Series EL 型。

12. 微量蠕動幫浦(Syringe pump):購自 KD Scientific,KDS-100 型。

13. 電子天平:Sartorius 公司製造,TE-124S 型。

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14. 桌上型高速微量離心機(Centrifuge):Eppendorf 公司製造,Centrifuge 5415D 型。

15. 恆溫振盪水槽(Thermostatic reciculator): DENG YNG 公司製造,

DKW40 型。

16. 酸鹼度計(pH meter):SUNTEX 公司製造,PC-310 型。

17. 磁石攪拌器:購自於台灣,Fargo MS-90 型。

18. 氣體發生器(Kipp's Apparatus):購自日盛玻璃儀器公司。

3.2 實驗方法

3.2.1 奈米纖維膜之製備

本研究選用聚丙烯腈(polyacrylonitrile ; PAN)高分子作為載體材 料,利用電紡織技術製備出均勻之奈米纖維膜(Li et al., 2007)。首先,

將 0.8 克 PAN 高分子材料與 9.2 克二甲基甲醯胺(N,N-Dimethyl formamide ; DMF)溶劑混合配製為 8%(w/w)高分子溶液,利用磁石 攪拌器攪拌均勻後,放置於60℃之恆溫水槽中至其完全溶解,再將高分 子溶液裝入玻璃針筒內,隨後在金屬噴頭上接上高壓電極,利用微量蠕 動幫浦將高分子溶液以 1.5 mL / h 速率推動使其經過帶電之金屬噴頭,

在 20 kV 電場強度與 20 cm 距離下操作 80 分鐘,便可得到均勻之電紡

(54)

圖3-1 電紡織裝置圖。

3.2.2 脂肪分解酵素種類之選擇

在生質柴油相關的研究中,許多學者選用Pseudomonas屬微生物所生 產的非特定切位脂肪分解酵素,並指出Pseudomonas cepecia脂肪分解酵素 每單位量展現出最高活性能力(Noureddini et al., 2005)。因此本研究選用 由日本Amano公司菌株為Pseudomonas cepecia生產的Lipase PS Amano脂 肪分解酵素產品,作為製備固定化酵素之原料,期望發展出完整且兼具 成本優勢的生質柴油酵素製程。

(55)

3.2.3 固定化酵素之製備

本研究中利用 amidination reaction(Handa et al., 1982)活化聚丙烯 腈奈米纖維膜上的 CN 官能基,藉此可與脂肪分解酵素上 NH2官能基形 成 NC-N 共價鍵結,達到固定脂肪分解酵素在奈米纖維膜上之目的,圖 3-2 為此活化步驟之反應機制。

首先,將製備完成的奈米纖維膜裁剪成適當的面積,然後放置於無 水乙醇之中,再利用氣體產生器所製造的鹽酸氣體拍打奈米纖維膜數分 鐘,以達到活化之目的,活化完成後將奈米纖維膜以蒸餾水清洗數次,

洗除膜上的殘留乙醇,將其置入由 50 mM 的磷酸鹽緩衝溶液配製而成 的脂肪分解酵素溶液之中,然後放入恆溫震盪水槽中,於適當溫度下以 100 rpm 的速度震盪數分鐘,即完成固定化脂肪分解酵素於奈米纖維膜 之步驟。由於固定化酵素活性受活化時間(2.5 min、5 min、7.5 min、

10 min)、固定化時間(15 min、30 min、60 min、120 min、180 min)、

酵素濃度(0.5 wt%、1 wt%、1.5 wt%、2 wt%)、固定化溫度(30°C、

40°C、50°C、60°C)與固定化 pH 值(5、6、7、8、9)等參數影響,

因此為固定化程序之探討變因,詳細反應條件列於第四章節。

(56)

圖3-2 固定化脂肪分解酵素於奈米纖維膜之反應機制圖

3.2.4 酵素蛋白質定量分析

蛋白質的定量分析方法是採用 Braford 法(1976)。加入Bradford 蛋 白質分析染劑於樣品中,放置於 30°C 下震盪反應五分鐘後,再於 OD595 下測量其吸收值。檢量線則是以不同濃度範圍(0 ~ 1.5 mg/mL)的牛血 清蛋白(BSA)來當作標準品。

(57)

3.2.5 酵素固定化之活性分析

在酵素固定化過程中,固定化條件直接影響著蛋白質固定量與酵素 活性,本研究根據固定化酵素催化三油酸甘油酯反應生成油酸甲基酯的 活性,透過實驗設計的方式,以尋找固定化酵素最佳比活性之固定化條 件。

詳細步驟如下:將 0.1 mL 三油酸甘油酯與 1.9 mL 正己烷溶劑混合 均勻後,再加入15 μL 甲醇量與 0.1 mg 游離酵素(或 4 cm2固定化酵素), 將其放置於恆溫水槽中,並以 100 rpm 的速度在 30°C 下進行反應 1 小 時,反應方程式如圖 3-3 所示。反應結束後,取出 0.2 mL 樣品與 0.3 mL 正己烷溶劑混合稀釋後,再加入 0.5 mL 濃度為 2 g/L 亞麻油酸甲基酯作 為標準品,最後以氣相層析儀進行分析,測定反應後樣品中油酸甲基酯 的含量。以下為氣相層析儀之操作條件:

„ 注射器溫度(injector):250°C。

„ 偵測器溫度(detector):280°C。

„ 烘箱溫度(oven):初溫150°C 以 10°C /min 升溫速率加熱至 180°C,

再以 1.5°C /min 升溫速率加熱至 200°C,最後以 30°C /min 加熱至 230°C,並維持 230°C 溫度 5 分鐘,全程共計 23 分鐘。

„ 管柱(column):THERMO TR-FAME Part NO.260M142P。

(58)

400 mL/min。

本研究酵素活性單位 1 U 定義為:在分析條件下,每分鐘生成 1 μmole 的油酸甲基酯產物所需要的酵素量。酵素比活性定義為:每毫

克蛋白質所表現的脂肪分解酵素活性(U/mg-protein)。相對比活性定義 為:操作參數值中之最大比活性定義為 100%的相對比活性。

圖 3-3 脂肪分解酵素轉酯化之反應方程式

3.2.6 酵素之安定性探討

安定性為評估酵素特性重要指標之一,可幫助了解酵素性質並應用 於適當條件下達成設計酵素製程之目的。以下為探討酵素安定性之參 數:

(1) 熱安定性:將游離酵素和固定化酵素浸於 pH 7 緩衝溶液中,並分 別置於 30°C、40°C、50°C、60°C、70°C 的溫度下保存 2 小時後,

再以活性分析測量其活性。

(2) pH 值安定性:將游離酵素和固定化酵素分別浸於 pH 5、pH 6、pH

(59)

7、pH 8、pH 9 緩衝溶液中,並置於 30°C 下保存 2 小時後,再以活 性分析測量其活性。

(3) 儲存安定性:將游離酵素和固定化酵素分別浸於 pH 7 和 pH 6 緩衝 溶液中,並置於 30°C 下保存 1 天、2 天、3 天、4 天、5 天、7 天、

10 天、15 天、20 天後,再以活性分析測量其活性。

(4) 操作安定性:將製備完成之固定化酵素以活性分析方法測量,反應 結束後以正己烷清洗固定化酵素數次直至無殘留樣品,並重複 10 次以上步驟以測量其活性。

3.2.7 酵素反應動力學之探討

將游離酵素與固定化酵素分別加入於基質濃度 12.8 mM、25.6 mM、51.2 mM、102.4 mM、204.8 mM 三油酸甘油酯溶液中進行反應,

並以測定活性方法測量,再利用 Michaelis-Menten 方程式如 3-1 式,以 Lineweaver-Burk 作圖法求出游離酵素與固定化酵素之 Vmax及 Km

(3-1)

3.2.8 固定化酵素轉酯化大豆油之探討

(60)

大豆油反應生成生質柴油的實驗。本實驗自製膜反應器(Tan et al., 2006)

其構造如圖3-4 所示,內層為多孔性聚甲基丙烯酸甲酯(壓克力;PMMA)

支架;外層為玻璃。首先將 50 cm2 之固定化酵素披覆於壓克力支架之 上,並放置於反應器內,再分別加入 10 克大豆油和適當甲醇量於反應 器中,在固定含水量、固定溫度與固定脂肪酸含量下進行反應如圖 3-5 所示,達到反應時間後取出 0.4 mL 的反應液,利用氣相層析儀進行分 析。由於甲醇量(1 g、2 g、2.5 g、3 g、4 g、5 g)、含水量(0.8 g、1.6 g、2.4 g、2.88 g、3.2 g、3.84 g、4 g、4.8 g)、反應溫度(30°C、40°C、

50°C)與脂肪酸含量(0%、25%、50%、75%)等參數會影響生質柴油 轉化率,因此為固定化酵素催化反應油脂之探討變因,詳細反應條件列 於第四章節。

3.2.9 脂肪酸之定量分析

本研究中有不同脂肪酸含量油脂之探討參數,因此建立脂肪酸之定 量分析,以定量反應物油脂中脂肪酸含量。首先將 100%的脂肪酸油品 與大豆油以不同比例混合配製,配製完成後取 20 μL 油脂與 0.98 mL 正 己烷溶劑混合稀釋後,於 35°C 下以 HPLC 分析油脂中脂肪酸(fatty acid;FA)的含量(Holcapek et al., 1999)。HPLC 分析之移動相分別為 溶劑 A(甲醇)以及溶劑 B(正己烷/異丙醇,以 4:5 的體積比例混合),

(61)

圖 3-4 實驗室自製批次薄膜反應器裝置圖

(62)

層析管柱為 C18 逆向層析管柱,流速設定為 1 mL/min。溶劑 B 在 30 分 鐘內以等梯度增加到 50%,並於 35 分鐘時再以等梯度降到 0%;紫外光 度計的吸收波長為 205 nm。脂肪酸含量定義為脂肪酸面積佔油脂總面積 之分率,如 3-2 式所示:

(3-2)

3.2.10 生質柴油之定量分析

將轉酯化大豆油實驗中取出 0.4 mL 之油水混合液以 10,000 轉離心 後,從上層油相取出 10 μL 油脂並稱重,再與 0.49 mL 正己烷溶劑混合 稀釋後,最後加入 0.5 mL 濃度為 2 g/L 十五烷酸甲基酯作為標準品,最 後以氣相層析儀進行分析,測定反應後樣品中生質柴油的含量;氣相層 析儀之操作條件如 3.2.5 節所示。轉化率定義為生質柴油重量佔油脂總 重量之分率,如 3-3 式所示:

(3-3)

(63)

第四章 結果與討論

4.1 奈米纖維膜製備

電紡織技術製備奈米纖維有操作電壓,操作流速,金屬噴頭與收集 板間距離及溶液濃度等因素,影響著奈米纖維的直徑、形狀與珠狀物的 形成。因此透過 SEM 圖像,可直接觀察到奈米纖維之結構,以調整電 紡織參數製備出最適奈米纖維之形態。

4.1.1 奈米纖維膜之表面分析

電紡織技術為相當穩定之製程,製備的奈米纖維直徑約為 150 nm 到 300 nm 之間,結構具有高度的一致性,圖 4-1 與圖 4-2 為聚丙烯腈奈 米纖維膜之 SEM 圖。

經活化程序後奈米纖維之表面結構並無任何變化,說明了活化程序 的鹽酸氣體不會破壞奈米纖維膜表面結構,符合材料耐酸的特性,圖4-3 和圖 4-4 為活化後奈米纖維膜之 SEM 圖。經酵素固定化後發現有許多 聚集物(aggregate)附著於奈米纖維膜表面上如圖 4-5 與圖 4-6 所示,

透過蛋白質定量分析測量固定化前後的酵素溶液,可發現酵素量有明顯 的差異,且配合固定化共價鍵結之理論,可合理推論部分酵素已確定固

(64)

圖4-1 聚丙烯腈奈米纖維膜之 SEM 圖(5000 倍)

圖4-2 聚丙烯腈奈米纖維膜之 SEM 圖(50000 倍)

(65)

圖4-3 活化後聚丙烯腈奈米纖維膜之 SEM 圖(5000 倍)

(66)

圖4-5 酵素固定化後聚丙烯腈奈米纖維膜之 SEM 圖(5000 倍)

圖4-6 酵素固定化後聚丙烯腈奈米纖維膜之 SEM 圖(50000 倍)

(67)

4.1.2 奈米纖維膜結構之物理特性

因為聚丙烯腈高分子屬於疏水性的材料,圖 4-7 為聚丙烯腈奈米纖 維膜之水滴接觸角圖形,由圖中可看出水滴與聚丙烯腈奈米纖維膜接觸 角度約為 100 度。經過酵素固定化程序後,奈米纖維膜與水滴的接觸角 度有明顯下降如圖 4-8 所示,由於酵素本身屬於親水的性質,因此根據 其前後接觸角的差異性,間接驗証脂肪分解酵素已固定於奈米纖維膜 上。

100°

圖4-7 聚丙烯腈奈米纖維膜上之水滴接觸角圖形

(68)

圖4-8 酵素固定化後奈米纖維膜上之水滴接觸角圖形 40°

(69)

4.2 酵素固定化之參數探討

由於酵素製程主要礙於酵素高成本及酵素不易回收等缺失可供改 進的方向,若酵素固定於載體之上製備成固定化酵素,將有利於酵素的 回收並可再重複使用,與強化酵素構形可防止酵素失活的優點。因此藉 由固定化技術的應用將可提升酵素的安定性,以下將探討活化時間、固 定化時間、酵素濃度、固定化溫度及固定化 pH 值之參數。

4.2.1 活化時間對酵素固定化的影響

由 4.1.1 節結果得知活化程序不會破壞奈米纖維膜表面結構,於是 每單位奈米纖維膜的表面積為定值,藉由活化時間與蛋白質固定量的關 係如圖 4-9 所示,探討奈米纖維膜活化完成之時間。由圖中可知活化奈 米纖維膜 2.5 分鐘,其蛋白質固定量為最低值,顯示了奈米纖維膜未活 化完全;在活化 5、7.5 及 10 分鐘條件下,蛋白質固定量幾乎沒有差異,

其平均值約為 113 mg-protein/g-material,証實活化時間 5 分鐘已可將奈 米纖維膜活化完全,並使得蛋白質固定量達到最大值。

(70)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0

50 100 150

Pr ote in loa ding (mg prote in / g ma te ri al )

Time of activation (minutes)

圖 4-9 活化時間對蛋白質固定量之影響。固定化時間:1 小時;酵素濃 度:1 wt%;固定化溫度:30°C;固定化 pH 值:7。

4.2.2 固定化時間對酵素固定化的影響

經由固定化時間的探討,獲得酵素鍵結於載體之時間,圖 4-10 表示 固定化時間對蛋白質固定量與比活性的影響。從比活性方面分析,理論 上蛋白質固定量愈多其所展現之活性為愈高,但是從實驗數據之蛋白質 固定量愈高其活性並非以等比例上升,導致比活性於 30 分鐘後有下降 的趨勢;另一方面可發現蛋白質固定量隨著固定化時間增長有些微增加 的趨勢,文獻指出酵素固定化之載體官能基短時間就能與蛋白質鍵結

(71)

0 25 50 75 100 125

(Mateo et al., 2007),因此固定量有些微增加的現象主要是因為蛋白質 推疊所造成的結果,此現象可能會造成酵素活性位置互相阻礙。經圖 4-10 中比活性之趨勢驗証了文獻所述,在固定化時間 60 分鐘後有蛋白 質推疊之現象發生,使得部份酵素無法催化反應基質,造成酵素成本消 耗。

由以上酵素固定化時間的研究發現,最適固定化時間為 30 分鐘,

其 蛋 白 質 固 定 量 與 比 活 性 分 別 為 99 mg-protein/g-material 及 1.69 U/mg-protein。

0 50 100 150 200 250 300

0 30 60 90 120 150 180

Pr ote in loa ding (mg prote in / g ma te ri al )

Immobilization time (minutes)

Relat iv e sp eci fi c act iv ity (%)

圖 4-10 固定化時間對蛋白質固定量與比活性之影響。活化時間:5 分

(72)

4.2.3 酵素濃度對酵素固定化的影響

在酵素製程中酵素成本佔總成本的比重相當高,於是如何有效率地 使用酵素且符合經濟效益為重要之議題。圖4-11 為酵素濃度對蛋白質固 定量與比活性的影響,由圖中可明顯地看出酵素濃度增高時,奈米纖維 膜上之蛋白質固定量隨著增加,主要是因為高酵素濃度使得碰撞頻率較 高酵素易固定於奈米纖維膜上;然而 0.5 wt%酵素濃度的蛋白質固定量 為最低值,但是其催化反應之比活性卻優於其他條件酵素濃度,造成此 現象可能為高酵素濃度易造成蛋白質推疊發生機率,使得部份酵素無法 展現其活性,導致了比活性於 1 wt%酵素濃度時有下降的趨勢。

基於經濟上的考量,選用 0.5 wt%酵素濃度進行固定化研究為最適 當之條件,其蛋白質固定量與比活性分別為 49 mg-protein/g-material 及 3 U/mg-protein。

(73)

0 20 40 60 80 100 120

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

0 50 100 150 200 250

Protein loading (mg pr ote in / g m ate ri al )

Enzyme concentration (wt%)

Relat iv e speci fi c acti vit y (%)

圖 4-11 酵素濃度對蛋白質固定量與比活性之影響。活化時間:5 分鐘;

固定化時間:30 分鐘;固定化溫度:30°C;固定化 pH 值:7。

4.2.4 固定化溫度對酵素固定化的影響

酵素屬於生物觸媒其活性易受到環境因素影響而損失酵素活性,例 如:高溫會造成酵素構形改變導致其反應性變差甚至變性失去反應能 力,因此決定出最適固定化溫度操作,將有助於提升酵素製程之潛力。

固定化溫度對蛋白質固定量與比活性的影響如圖 4-12 所示,由於各溫度 條件之蛋白質固定量幾乎相同,顯示了固定化溫度與蛋白質固定量沒有

(74)

0 20 40 60 80 100

受到破壞前提下,溫度的提升可提供能量給酵素展開至較佳構形,與增 加酵素與載體間之鍵結(Mateo et al., 2007),使得酵素活性位置更容易 與基質接觸,促使其反應催化更有效率。

由以上所述,酵素固定化於 50°C 溫度下可擁有最佳性質,其蛋白 質固定量與比活性分別為 51 mg-protein/g-material 及 4.6 U/mg-protein。

0 25 50 75 100 125

30 40 50 60

P rote in loa ding (m g prote in / g m ater ia l)

Temperature (

o

C)

Rel at iv e sp eci fi c act iv ity (%)

圖 4-12 固定化溫度對蛋白質固定量與比活性之影響。活化時間:5 分 鐘;固定化時間:30 分鐘;酵素濃度:0.5 wt%;固定化 pH 值:7。

(75)

4.2.5 pH 值對酵素固定化的影響

酵素的活性部位含有許多可離子化基團(ionizable groups),其作用 為維持活性部位的構形,以利於基質與活性位置接觸進行催化反應,但 是離子化基團會因 pH 值變化而改變其離子型態,進而影響酵素觸媒機 能,因此了解 pH 值對酵素構形的影響,將可提高酵素展現之活性。pH 值對蛋白質固定量與比活性的影響如圖 4-13 所示,從圖中可得知酸性或 鹼性條件之蛋白質固定量有些微的差異,推測為經活化後奈米纖維膜上 的官能基於鹼性條件下較穩定,有助於酵素鍵結上奈米纖維膜,雖然鹼 性緩衝溶液有助於蛋白質固定量的提升,但是其反應活性卻不理想;反 之酸性條件下,其比活性明顯地大幅度提升,說明了酸性離子會影響酵 素固定於奈米纖維膜上,但是有助於酵素活性部位之離子化基團展開,

使其展現較佳之活性。

經過 pH 值的探討可歸納最適固定化 pH 值為 6,其蛋白質固定量與 比活性分別為 43 mg-protein/g-material 及 6.9 U/mg-protein。

參考文獻

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