絞股藍皂苷誘發人類肺癌細胞株（A549）的細胞週期停止在G0/G1期與計畫性死亡; Gypenosides induces in vitro G0/G1 phase arrest of cell cycle and apoptosis in human lung A549 cells
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(2) 的量並沒有變化，而 caspase-3 與 caspase-9 的量也是明顯上升，NF-κB 也有些許上升的趨勢。因此我們認為，絞股藍皂苷可以藉由 NF-κB 的路徑，導致 Bax 的上升，而促使 caspase-9 活化，再使下游的 caspase-3 活化而導致計畫性死亡，而這樣的死亡路徑是不經由 p53 這條路徑 的。. 2.
(3) Abstract Recently, Herbal medicines are increasingly becoming a popular project. Gynostemma pentaphyllum MAKINO is noted for its functions of treating hepatitis and cardiovascular diseases in Asia. Gypenosides are the. major. pentaphyllum. components. that. MAKINO.. are. However,. extracted the. from. molecular. Gynostemma mechanism. underlying the gypenosides-induced cell cycle arrest and apoptotic process is unclear.. In this study, we have evaluated the. chemopreventive role of gypenosides in human lung cancer (A549) cells in vitro by studying the regulation of proliferation, cell cycle and apoptosis. Gypenosides inhibited cell proliferation, induced G0/G1 arrest and apoptosis in A549 cells. Investigation on the levels of CDKIs (p21 and p27) by Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and Western Blotting showed that p21 and p27 were increased with the increasing doses of gypenosides in A549 cells. The levels of p21 and p27 increased after A549 cells were cotreated with various concentrations of gypenosides.. The increase of the levels of. p21 and p27 may be the major factor for gypenosides to cause G0/G1 arrest in the examined cells.. Flow cytometric assay and gel. electrophoresis of DNA fragmentation also confirmed that gypenosides induced apoptosis in A549 cells. Our data demonstrated that gypenosides-induced apoptotic cell death was accompanied by up-regulation of Bax, NF-κB, caspase-3 and caspase-9, while it had no effect on the levels of Bcl-2 and p53. Taken together, gypenosides therefore appears to exert its anticarcinogenic properties by inhibiting proliferation, inducing G0/G1 phase arrest and apoptosis underwent. 3.
(4) activation of NF-κB, Bax and caspase-3 in human lung A549 cancer cell line.. 4.
(5) 致謝 時光荏苒，一下子兩年的時間過去了，由衷的感謝吾師鍾景光教 授與吳禮字副教授在生活上與學識上的教導，使本論文得以順利完 成。文稿撰寫之初，承蒙各口試委員的撥冗審閱與大力釜正，提供諸 多的寶貴意見，使論文內容更加完善，在此謹至上我最由衷的感謝。 回顧兩年期間，承蒙微生物科劉昭君副教授、方世華副教授、陳 師慶副教授、項千芸副教授、寄生蟲科郭秀滿副教授、醫學系所系辦 麗如姐在生活與研究的指導與關心。此外感謝學長姐楊家欣、陳俊 仁、徐美華、林孟葳、王孟珠、林珮如、馬嘉軉、李佳陽、邱華浩、 陳宣嘉；同學瓊瑢、豐仁、志宏、信賢、述綺、詩晴、孟芹；助理碧 玲等在實驗上與課業上的協助與砥礪；學弟妹寶文、欣如、宣榜、孔 文、宜蒼等在生活上的鼓勵與幫助。 由衷的感謝我親愛的父母與弟妹，在這兩年來於精神與生活上的 鼓勵和支持，讓我得以順利完成這兩年來的學業，最後將此論文獻給 所有關心我的家人、師長、同學與學弟妹。. 陳宜珊 中國醫藥大學. 謹致於. 醫學研究所. 中華民國九十三年六月 5.
(6) 總目錄 頁次 中文摘要………………………………………………….…..1 英文摘要……………………………………………………...3 總目錄………………………………………………………...6 圖表目錄……………………………………………………...9 符號與縮寫…………………………………………………..13 第一章 前言 第一節. 研究緣起……………………………………………...14. 第二節. 研究目的……………………………………………...15. 第二章 文獻探討 第一節. 絞股藍與絞股藍皂苷……………………………...…16. 第二節. 細胞週期的調控……………………………………...21. 第三節. 細胞凋亡…………………………………………...…26. 第四節. 多重抗藥性基因……………………………………...37. 第三章 研究設計與假說 第一節. 研究設計…………………………………………...….38. 第二節. 研究假說………………………………………………38. 第四章 材料與方法 6.
(7) 第一節. 實驗材料…………………………………………...….39. 第二節. 實驗方法……………………………………………….44. 第三節. 分析方法……………………………………………….60. 第五章 研究結果 第一節. 絞股藍皂苷對人類肺癌細胞株細胞增生的影響…….62. 第二節. 絞股藍皂苷對人類肺癌細胞在細胞週期的影響….....66. 第三節. 絞股藍皂苷對人類肺癌細胞株在計畫性死亡上的改變 情形…………………………………………………….71. 第四節. 絞股藍皂苷對人類肺癌細胞在 DNA 電泳膠片的表現 情形………………………………………………….....75. 第五節. 使用 RT-PCR 技術對絞股藍皂苷在人類肺癌細胞中細 胞週期素的 mRNA 表現量的改變……………………77. 第六節. 使用 RT-PCR 技術對絞股藍皂苷在人類肺癌細胞中 Bcl-2 family 與 caspase 的 mRNA 表現量的改變……..80. 第七節. 使用 RT-PCR 技術對絞股藍皂苷在人類肺癌細胞中 MRP 的 mRNA 表現量的改變………………………...83. 第八節. 使用西方點墨法對絞股藍皂苷在人類肺癌細胞中細胞 週期素蛋白表現量的改變…………………………….85. 第九節. 使用西方點墨法對絞股藍皂苷在人類肺癌細胞中. 7.
(8) casapse 蛋白表現量的改變……………………..…….88 第十節. 使用西方點墨法對絞股藍皂苷在人類肺癌細胞中粒線 體蛋白表現量的改變………………………………...90. 第十一節 使用西方點墨法對絞股藍皂苷在人類肺癌細胞中 Death Receptor 蛋白表現量的改變…………………..92. 第六章 討論…………………………………………………94 第七章 結論與建議 第一節. 結論…………………………………………………...101. 第二節. 建議…………………………………………………...103. 參考文獻……………………………………………………..104. 8.
(9) 圖表目錄 圖一 細胞週期……………………………………………………..…..25 圖二. Apoptosis 與 necrosis 的不同………………………………...…28. 圖三. 經由 Fas 活化計畫性死亡的路徑………………………………30. 圖四. 經由 TNF 活化計畫性死亡的路徑…………………………….31. 圖五. 經由 DR4/DR5 活化計畫性死亡的路徑………………………32. 圖六. 粒線體在計畫性死亡中扮演的角色…………………………..33. 表一. Bcl-2 family 與其在計畫性死亡中的角色…………………….36. 圖七 進行流式細胞計數儀分析出來的細胞週期標準圖……………47 表二. PCR 技術所使用到的 primer…………………………….……..53. 表三. PCR 技術所使用到的 primer……………………………….…..54. 圖八 聚丙烯醯胺/亞甲基雙丙烯醯胺的結構式……………………...57 圖九 利用流式細胞計數儀使用不同濃度的絞股藍皂苷處理 24 小時 後在人類肺癌細胞株的細胞存活情形…………………...…….63 圖十. 利用流式細胞計數儀評估細胞的增生率………………....…..64. 圖十一 利用流式細胞計數儀評估細胞的增生率…………………....65 圖十二 人類肺癌細胞經過給予不同濃度的絞股藍皂苷處理 24 小時 之流式細胞計數儀所檢測到的情形………………………..67 圖十三 人類肺癌細胞經過加入不同濃度的絞股藍皂苷處理 24 小時. 9.
(10) 之流式細胞計數儀所檢測到的情形………………………..68 圖十四 人類肺癌細胞經過給予或不給予 300 µg/mL 的絞股藍皂苷 處理 6、12、24、48 小時之流式細胞計數儀所檢測到的情 形…………………………………………………………......69 圖十五 人類肺癌細胞經由給予或不給予 300 µg/mL 的絞股藍皂苷 處理 6、12、24、48 小時後以流式細胞計數儀所檢測到的情 形……………………………………………………………..70 圖十六 人類肺癌細胞經過給予或不給予 300 µg/mL 的絞股藍皂苷 處理 6、12、24、48 小時之流式細胞計數儀所檢測到的情 形……………………………………………………………..72 圖十七 利用流式細胞計數儀加入或不加入 300 µg/mL 的絞股藍皂 苷培養 6、12、24、48 小時之後分析計畫性死亡的細胞分布 情形…………………………………………………………..73 圖十八 利用倒立式相位差顯微鏡觀察細胞的型態………………....74 圖十九 利用 DNA 電泳法檢測 DNA 斷裂的情形…………………....76 圖二十 A. 以 RT-PCR 分析人類肺癌細胞經加入不同濃度的絞股藍皂 苷處理 24 小時後細胞中 CDK2、CDK4、p53 的相對表現 量………………………………………………………..…78 圖二十 B. 以 RT-PCR 分析人類肺癌細胞經加入不同濃度的絞股藍皂. 10.
(11) 苷處理 24 小時後細胞中 E2F、cyclin A、cyclin B1、cyclin D1、cyclin E、p21、p27 的相對表現量…………………..…79 圖二十一 A. 以 RT-PCR 分析人類肺癌細胞經加入不同濃度的絞股藍 皂苷處理 24 小時後細胞中 Bax、Bad、Bid、Bcl-2、Bcl-XL、 p53 的相對表現量……………..…………………………..81 圖二十一 B. 以 RT-PCR 分析人類肺癌細胞經加入不同濃度的絞股藍 皂苷處理 24 小時後細胞 caspase-3、caspase-9、NF-κB 的 相對表現量……………………………………………......82 圖二十二 以 RT-PCR 分析人類肺癌細胞經有無加入 300 µg/mL 的絞 股藍皂苷處理 6、12、24 小時後細胞中 MRP-1、MRP-2、 MRP-3 的相對表現量………………………………….….84 圖二十三 利用西方點墨法觀察 G0G1 phase 中的 CDK1、CDK2、 CDK4、cyclin A、cyclin B1 的蛋白表現量……………….86 圖二十四 利用西方點墨法觀察 G0G1 phase 中的 CDK1、CDK2、 CDK4、cyclin A、cyclin B1 的蛋白表現量……………..…87 圖二十五 利用西方點墨法觀察有關於計畫性死亡路徑中的 caspase-3、caspase-8、caspase-9 的蛋白表現量……….…..89 圖二十六 利用西方點墨法觀察有關於粒線體內的 Bax、Bcl-2 蛋白 與 p53 的相對表現量………………………………….…..91. 11.
(12) 圖二十七 利用西方點墨法觀察絞股藍皂苷對人類肺癌細胞中 death receptor 中的 Fas、NF-κB（p50）、NF-κB（p65）蛋白質 相對表現量………………………………………………..93 圖二十八 結論總圖…………………………………………………101. 12.
(13) 符號與縮寫 BSA : Bovine serum albumin CDK : Cyclin-dependent kinase CDKI : Cyclin- dependent kinase inhibitor DMSO : Dimethyl sulfoxide ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay FBS : Fetal bovine serum PBS : Phosphate buffered Saline PARP : Poly(ADP-ribose) polymerase PI : Propidium iodide. 13.
(14) 第一章 第一節. 前言. 研究緣起. 據統計，在世界上約有 35個先進國家其肺癌死亡率居所有癌症死 亡率的第一位。世界衛生組織報告，近 20年來，人類的癌病死亡 率增加19%，其中以肺癌增加最多，在男性增加76%而女性增加 135%。肺癌致病因子眾多，吸菸和二手菸與日俱增，其中所含之 多環芳香碳氫類（polycyclic armotic hydrocarbons）及尼古丁衍生 之亞硝胺，油煙、煙塵、高揮發有機化合物、空氣中彌漫的重金屬 化合物、石棉等因子，導致肺癌罹患和死亡率逐年攀升 1。台灣每 年約有五千名病患因肺癌而死亡，於1999年越居癌症死亡率之冠 2. ，其嚴重性不可小覷。現今對於癌症療法研究有兩大方向：一為. 抑制癌細胞間血管生成而達抑制成長之效；二從細胞自身的細胞計 畫性凋亡（Apoptosis）著手，找出使癌細胞自殺卻不影響其他正常 細胞的方法，故找出有效且不傷害正常細胞的方法是刻不容緩的課 題。. 14.
(15) 第二節. 研究目的. 近年來中草藥在醫學抗癌方面掀起一股熱潮，其中絞股藍為民 間傳統的草藥，其製品有皂苷、茶葉等。其味甘、無毒，因具與人參 皂苷結構相同，故有"第二人參"之美譽 3。在其抗腫瘤方面，有報導 指出絞股藍皂苷在低劑量時可以減小腫瘤的體積，延長壽命 4，但在 高劑量時，抑制腫瘤的能力反而減弱 5。在一另方面，也有研究發現 絞股藍皂苷可以使大腸癌細胞DNA合成降低，核分裂數減少，細胞 變性壞死 6。但是絞股藍皂苷誘發人類肺癌細胞（A549）凋亡的機轉 並沒有任何文獻有報導，於是本論文旨在找出絞股藍皂苷對人類肺癌 細胞（A549 cell line）的抑制機轉，以尋出預期效果，進而開發有效 的量產。. 15.
(16) 第二章 第一節. 文獻探討. 絞股藍與絞股藍皂苷. 1.絞股藍的簡介 絞股藍為葫蘆科絞股藍屬植物Gynostemma pentaphyllum. MAKINO. 。. 異名為七葉膽、小苦草、公羅鍋底、遍地生根、五月五、五葉參、金 絲五爪龍等，在日本稱之為《甘蔓茶》. 7-8. 。其為多年生攀援草本植. 物，生長分布廣，大陸陜西南部及長江流域以南各省區，均有其生長 蹤跡，以雲南種類最多。韓國、日本、越南、印尼等地區亦有蹤跡。 台灣在 600~2000 公尺的山谷陰濕處均能生長。其味甘、無毒，因具 與人參皂苷結構相同，故有"第二人參"之美譽3。絞股藍始載於明代救 荒本草，本草綱目中記載，絞股藍具有冰血降火、生津止渴功效，具 涼血之效、降火，然授乳期體寒之婦女不宜飲用3, 9。 2.化學成分 近二十年來，已分離鑑定出80多種皂苷. 10-11. ，發現其中主要藥效. 成分為絞股藍皂苷（Gypenosides；Gps）。其中絞股藍皂苷III、IV、 VIII、XII分別與人參Rb1、Rb3、Rd、F2、Rg3在化學結構上完全相 同，其餘為人參皂苷的異構體，另外絞股藍皂苷還含有醣類、黃酮、 各種胺基酸和微量元素. 12, 13. 。. 16.
(17) 已分析出來的GPs有五類，其中瑪烷型為基本結構式： GPs1-GPs21; GPs22-GPs26；GPs30-GPs35; GPs27-GPs29; GPs36-GPs41; GPs42-GPs52。結構式如下. 17. 14. ：.
(18) 3.藥理作用 （1）抗腫瘤作用 在抗腫瘤實驗中，對S180小鼠每天餵食絞股藍皂苷 50 mg/kg連續 用七天，12 天內可使腫瘤減小 40﹪，以 20-40 mg/kg隔日皮下注射， 能延長患有腹水瘤小鼠的壽命 4。王等學者在 1988 年研究表明，絞 18.
(19) 股藍皂苷對小鼠S180移植性腫瘤的生長有明顯的抑制效果，每日灌服 30 mg/kg、300 mg/kg及 120 mg/kg的絞股藍皂苷腹腔注射連續 10 天， 其腫瘤抑制率均大於 30﹪。其中以 30 mg/kg灌服作用最強，抑制率 約達 87.1﹪，增加劑量反而抑制能力減弱 7。 金和薛學者在 1992 年發現一定劑量範圍（1-20 µg/mL）的絞股 藍提取液作用一定的時間（24、48、72 小時）後，發現可以使大腸 癌細胞DNA合成降低，核分裂數減少，細胞變性壞死。其作用機制 之一可能為抑制腫瘤細胞生長增殖和直接的細胞毒性作用 6。對未使 用化療或化療結束一個月後的患者測定其T淋巴細胞的轉化率（LTT） 與脂酶染色陽性率（ANAE） ，發現絞股藍皂苷具有增強T細胞免疫功 能的作用，用於防範惡性腫瘤有良好的效果 4。 （2）升高白血球的作用 魏和劉等學者在 1993 年使用絞股藍皂苷 150-300 mg/kg灌胃小鼠 連續八天，能使環磷酸胺或60Co照射所導致的低白血球症小鼠的白血 球數明顯升高，而對正常的小鼠卻無明顯的影響. 15. 。. （3）抗心肌缺血缺氧作用 欣和劉等學者在 1993 年利用通過大鼠急性心肌梗塞模型，即離 體培養大鼠心肌細胞缺糖缺氧損害模型，在早期腹腔注射絞股藍皂 苷，結果發現能明顯縮小心肌梗塞範圍，抑制心肌梗塞後血清磷酸肌. 19.
(20) 酸肌酶（CPK）及乳酸脫氫酶（LDH）的升高。早期預防性靜脈注射 絞股藍皂苷，能明顯減輕缺血心肌組織結構的損傷程度。體外實驗還 證明，絞股藍皂苷對培養大鼠、乳鼠心肌細胞缺糖缺氧損傷具有直接 保護的作用. 16. 。. （4）降低血脂、抑制肥胖 孟和朱等學者在 1989 年利用給高脂大鼠每天灌服絞股藍皂苷 200 mg/kg連續 10 天後，取血液測定，顯示絞股藍皂苷能顯著降低血 清總膽固醇（TC） 、低密度脂蛋白（LDL）含量，提高高密度脂蛋白 （HDL）含量，使HDL/LDL的比值增大17。木村善行也證明絞股藍皂 苷對餵食高糖高脂的大鼠所致的高血脂症有效。給藥組大鼠血清總膽 固醇（TC）、中性脂肪（TG）、磷脂質（PL）與過氧化脂質（LPD） 顯著降低，這樣的結果表示高血脂症可被絞股藍皂苷所抑制. 18. 。. （5）抗氧化作用 雷等將絞股藍皂苷提取物依 400 mg/kg灌胃，能使正常小鼠血漿 中cAMP含量降低，cGMP含量升高，cAMP/cGMP的比値降低. 19. 。. （6）保肝作用 高醣、高脂導致的大鼠高脂血時常伴隨著肝損傷，使其中的GPT 上升。使用絞股藍皂苷 100 mg/kg連續七天後能抑制血清中的GPT上 升以及肝過氧化脂質的增加。使用絞股藍皂苷 50 mg/kg能明顯抑制四. 20.
(21) 氯化碳所致的大白鼠急性肝損傷. 第二節. 20. 。. 細胞週期的調控. 2001 年的諾貝爾生理醫學獎頒發給三位研究細胞週期(cell cycle) 的 生 物 學 家 ： 英 國 的 保 羅 ‧ 諾 爾 斯 (Paul Nurse)與 蒂 莫 西 ‧ 漢 德 (Timothy Hunt) 以及美國的利蘭‧哈特韋爾(Leland Hartwell)，以表揚 他們發現細胞週期的調控因子之重大貢獻，解開生命之謎。早在 1665 年虎克(Robert Hooke)便從自製顯微鏡下觀察到生物體的細胞，1838 年 由 馬 薩 斯 ‧ 薩 爾 登 (Matthias Schleiden) 與 陶 德 ‧ 薩 旺 (Theodor Schwann)提出細胞理論(cell theory)，認為生物體是由一或多個細胞所 組成，所有細胞都是由一個細胞所分裂衍生而來，因此細胞分裂是一 個維持細胞永遠不死的唯一途徑，會有新細胞生成以代替死去細胞 21. 。 所謂細胞週期（cell cycle）指的是包含了G0/G1、S、G2、M等. 階段時期. 22. 。. Gap 0（G0） ：細胞處於休眠的狀態，可能是暫時休眠或者是永久 性休眠，需要有適當的訊息才會重新投入細胞週 期。 Gap （ 1 G1） ：細胞維持正常代謝並且繼續生長，在進入 S (synthesis 時期之前會檢查染色體(chromosome) DNA 是否受到 21.
(22) 破壞以進行修補(repair)的工作，此時期需要花十到十 二小時。細胞也可能由此脫離細胞週期進入不生長的 休止狀態(G0)。 Synthesis（S） ：當細胞進入 S 時期會花六到八小時進行 DNA 的 合成，將原本的二十三對染色體複製另一份，其目 的在複製。 Gap 2（G2）：當細胞進入 G2 (gap2)時期需要花三到四小時，除 了繼續生長並且合成蛋白質之外，細胞也會負責檢 查染色體 DNA 的複製是否完整以準備進行有絲分 裂(mitosis)。 M (mitosis) ：細胞會由一個母細胞變成兩個子細胞，已複製完 整的染色體會各自分配到子細胞內，使得子細胞內 的染色體與母細胞完全一樣，此時期只有一小時， 之後子細胞再開始進入下一個細胞週期。 在細胞週期中，每個階段或是時期交界都有所謂的『檢查點』 （ checkpiont） ，其意義類似於工廠製造過程中的品管控制。G1 階段 所監測的為細胞個體的大小，在細胞成長過程中，細胞核遺傳物質若 有受外界高能輻射線或化學物質的影響而突變，則啟動修復系統。S 階段則是在進行DNA複製，而G2 階段主要在檢查所有染色體DNA是. 22.
(23) 否都被複製且限於一次，若一切都正常才能進入最後細胞分裂M期。 若是當DNA受損時，細胞週期便無法通過檢查哨而造成停滯，這就 是所謂的cell cycle arrest。此時DNA會進行修復（DNA repair），若是 遇到無法彌補的錯誤時，細胞則會走向計畫性凋亡（apoptosis）23。 而 細 胞 週 期 中 最 重 要 的 調 控 因 子 就 是 Cyclins 與 CDKs （ cyclin dependent kinases） ，其可以正向調控細胞週期. 24. 。Cyclins家族主要是. 在細胞週期中被合成，其成員已知有 8 種，分別為：Cyclin A、B1,2,3、 C、D1,2,3、E、F、G、H 25-28。 Cyclins A and B主要存在於S-G2 phase，為mitosis cyclins，在 mitosis時會迅速的被分解. 28. 並在G1-S phase時會被分解. 。Cyclins C、D and E主要存在G1 phase， 27. 。而Cyclin H與CDK7 會形成一個具有. 酵素活性的複合物，可以活化CDK1（cdc2）與CDK2。 CDKs（cyclin dependent kinases）是一群蛋白激酶，其成員目前 已知有 7 種，分別為：CDK1（cdc2） 、CDK2、3、4、5、6、7，其會 與特定的Cyclin結合而活化他們。CDK1（cdc2）主要存在S、G2 以 及M時期，並與Cyclins A及B結合. 29. 。細胞在G0/G1 phase，CDK4、5. 及 6 會和Cyclin D家族結合；而CDK2 也會與Cyclin D家族結合，但主 要還是在G1 及G1-S過渡期與Cyclins A及E結合。而CDK7 會與Cyclin H結合，並磷酸化CDK1 與CDK2. 30,31. 23. 。.
(24) 細胞週期中還有另一群重要的調控因子，就是CDKI（cyclin dependent kinase inhibitors）. 32-34. 。基本上分成兩個族群，一為INK4. family，另一為KIP/CIP family 35。在INK4 family中，主要成員有p14、 p15(INK4B)、p16(INK4A)、p18(INK4C)以及p19(INK4D)，其功能為 抑制Cyclin D/CDK4 與Cyclin D/CDK6 而達G1 時期的控制。另一個族 群為KIP/CIP family，包括了p21(CIP1/WAF1/SDI1)、p27(KIP1)以及 p57(KIP2)。KIP/CIP家族所影響的層級較INK4 家族為廣，其所調控 的蛋白包括Cyclin E/CDK2、Cyclin D/CDK1、Cyclin D/ CDK6、Cyclin A/CDK2 及Cyclin B/CDK1 等. 32-34. 。. 癌症與細胞週期的變化息息相關，細胞不受控制的增殖是癌症的 主要特徵。導致此現象的發生是由於負責調節細胞週期或者參與細胞 週期檢查點調控的蛋白質的基因受到改變，使得這些蛋白質產物失去 原有的功能而造成細胞週期不斷地進行。有幾種腫瘤抑制蛋白質 (tumor suppressor gene)的作用之處是位於細胞週期的檢查點上，隨時 掌握細胞週期是否該採煞車，例如 p53 轉錄因子(transcription factor) 的基因突變之情形在很多癌症中可以被發現，p53 蛋白質的含量在 DNA 受損時會增加，受到活化的 p53 會使 p21 開始生產，p21 結合 至 Cyclin 與 CDK 的複合體使細胞週期被停止在 G1 晚期以修補錯誤 的 DNA 序列，所以 p53 的功能喪失將會使得細胞該停止時卻停不下. 24.
(25) 來，因此不斷地增生。視網膜母細胞瘤(retinoblastoma, RB)是在視網 膜(retina)生成的一種癌症，在正常情況下，未受到Cyclin D與CDK4 以及Cyclin E與CDK2 的複合物高度磷酸化的RB會與轉錄因子E2F結 合並停止在G1 晚期，當pRB受到高度磷酸化時，E2F會離開RB而啟 動基因轉錄的進行，而此基因所轉譯的蛋白質會推動細胞週期走向S 時期，所以當RB基因突變時，細胞週期便無法正常停止在G1 晚期， 在細胞尚未檢查DNA序列正確與否之前就直接走入S時期，結果會使 得細胞無法停止地增生. 36-37. 。. 圖一 細胞週期 Adrian M. Senderowicz, Edward A. Sausville Preclinical and Clinical Development of Cyclin-Dependent Kinase Modulators Journal of the National Cancer Institute, 2000; 92: 376-387.. 25.
(26) 第三節 細胞凋亡（Apoptosis）. 1. 細胞凋亡的意義 早在 1972 年，Kerr與Wyllie等學者將Apoptosis的命名取自於希臘 文，希臘文中的”apo”代表離去、消失的意思，而”ptosis”在希臘文中 代表凋落、落下的意思。原本字面的意思是指樹葉凋落或掉落. 38. 。而. 在拉丁文中”apopto-”在拉丁文中是”枯萎．凋零”的意思，用來表示細 胞進行apoptosis 時的外觀，並指”死亡”之意。 Apoptosis或為計畫性死亡，在真核細胞的發展、生長與分化當 中以排除大量與不需要的細胞的方式，為一種細胞自我毀滅的過程 39. 。所以apoptosis為一種發生在正常的物理狀態之下死亡的過程而不. 是細胞有損傷或是遭受攻擊的時候 39 。在多細胞有機生物體中， apoptosis是一種控制與維持細胞數非常重要的程序。而生物體的恆定 也依靠著apoptosis與細胞增生的之間平衡來控制。如果apoptosis程序 被抑制或是其中調控的基因有損害，則會造成細胞無法走向計畫性死 亡，而導致細胞循著錯誤的訊息繁衍下去，造成細胞增生，癌化的表 現。 Apoptosis與necrosis的不同在於apoptosis的死亡是經由分裂成 DNA片段、細胞膜皺縮、染色質變濃染而後形成凋亡小體（apoptotic. 26.
(27) 39-42. bodies） ，由monocyte或macrophage吞噬處理掉. ，如圖二。這樣的. 死亡不會波及其他周圍的細胞，且不會發生發炎現象。而necrosis的 死亡方式會造成細胞發炎破裂，釋出發炎因子而造成周圍細胞一併被 波及，出現壞死現象。許多的因子都會促使apoptosis的產生，例如： 外加的stress（ionizing and ultraviolet radiation, heat shock）與經由一些 receptor像是：tumor necrosis factor α（TNF-α）等的receptor因子所造 成。這些促使apoptosis的刺激因子會被caspase-specific inhibitors所抑 制，由此可知caspase在apoptosis當中也是扮演著很重要的角色。當 apoptosis啟動時，caspase會經由瀑布式活化apoptosis路徑，利用本身 的酵素活性去切割下游的caspase而使之活化。Caspase還可以去活化 DNAase，於是DNAase就可以去切割DNA，使在apoptosis當中造成 DNA fragmentation 43。. 2. 形態學上的表現 接受到細胞進行apoptosis的指令之後，細胞核內的染色質開始濃 染且細胞變圓，接著DNA fragment開始形成，產生 180-200 bp或其倍 數的DNA片段，因此藉由電泳膠片法來觀察的時候，可以看見像樓 梯狀的電泳帶44。其他的形態包括cytoplasm開始皺縮，然後lamins與 actin filaments被切割而使細胞形成凋亡小體，最後經由monocyte與 macrophage進行吞噬作用將細胞碎片處理掉 27. 39. 。.
(28) 圖二. Apoptosis與necrosis的不同. 39. 。. 28.
(29) 3. 內在與外在的apoptosis pathway 39. （1）. 外在路徑. 外在路徑由death receptor與細胞膜上的surface receptor結合釋放 計 畫 性 死 亡 訊 號 後 所 開 啟 。 Apoptosis 開 啟 之 後 會 去 活 化 caspase cascade，而這樣經由capsase路徑所的啟動apoptosis是非常迅速的. 39. 。. 最代表性的例子就是CD95（Fas）、TNFR1、TRAIL（TNF-related apoptosis inducing ligand）。. 29.
(30) （A）由 CD95/Fas 所傳遞的路徑 Fas屬於tumor necrosis factor receptor superfamily當中的一員。當 Fas與Fas ligand結合後會導致death domains（DD）的聚集，接著會吸 引細胞內的Fas-associated death domain（FADD）過來與DD結合，結 合之後會活化caspase-8. 45. ，經由一連串切割的過程再去活化下游的. caspase，例如capsase-3 與capsase-7 等。. 圖三. 經由Fas活化apoptosis的路徑. 30. 39. 。.
(31) （B）由 Tumor Necrosis Factor Receptor-1（TNFR1）所傳遞的路徑 TNF 是由遭受到感染所反映出來的 T cell 與活化的 macrophage 所製造出來的，其 ligand 則為 TNFR1。在一些細胞當中，TNF 可以 藉由啟動免疫反應而活化 NF-κB。當 TNF 結合上 TNFR1 時，會吸 引 TRADD（TNFR-associated death domain）的靠近，這樣的機制會 啟動更多蛋白的靠近。而其中吸引來的蛋白：RIP（receptor interacting protein）與 TRAF2（TNF-associated factor 2）可以活化 NF-κB 的路 徑，促使細胞生存或死亡，另一方面也活化 caspase-8，導向 apoptosis。. 圖四. 經由TNF活化apoptosis的路徑39。. 31.
(32) （C）由 TRAIL（TNF-related apoptosis inducing ligand）所傳遞的 路徑 其實 TRAIL 所造成的 apoptosis 路徑與 Fas L 很相似，TRAIL 的 receptor 是 DR4 或 DR5，當 TRAIL 與 DR4 或 DR5 結合之後，則會 啟動 apoptosis 的機制。唯一跟 Fas L 機制不太一樣的是 Fas L 的表現 需要 T cell 與 NK cell 的活化，而 TRAIL 的活化可以由許多組織刺激 來表現。在細胞表面上仍有兩種 receptor 來與 DR4 或 DR5 競爭與 TRAIL 所結合的位置，這兩種 receptor 就是 DcR1 與 DcR2。於是當 TRAIL 與 DcR1 或 DcR2 結合上，則不會啟動 apoptosis；而 TRAIL 與 DR4 或 DR5 結合上之後則會啟動 apoptosis。. 圖五. 經由DR4/DR5 活化apoptosis的路徑39。. 32.
(33) （2）內在路徑 內在路徑最代表性的是由粒線體所誘發的. 46. 。第一個被發現的就. 是Bcl-2，Bcl-2 位於粒線體膜的外層，調控細胞的存活。第二個被發 現的是cytochrome c. 46. 。當細胞受到傷害，有個訊號將引起計畫性死. 亡的時候，就促使cytochrome c由粒線體的intermembrane space釋放到 細 胞 質 中 ， 刺 激 形 成 apoptosome 與 活 化 caspase 的 複 合 物. 47. ，. apoptosome包括了cytochrome c、ATP、Apaf-1 與caspase-9 原生酶。 經由切割pro-caspase 9 使之變成活化態之後，即可活化下游的caspase 而啟動apoptosis。. 圖六. 粒線體在apoptosis中扮演的角色39。. 33.
(34) （A）Caspase Caspase的全名為Cystein aspartase，為一種有著Cystein活化態殘 基的蛋白酶。Caspase可以在目標蛋白N端的aspartate殘基與C端的 small hydrophobic residue間做切割的動作而導致變成活化態 48-49 。 Caspase 的 原 生 酶 包 括 了 三 個 部 分 ， 他 們 可以 經 由 切 割 而 活 化： amino-terminal prodomain、a large subunit（17-20 kD）與a small subunit （10-12 kD） 。在caspase-3 與caspase-7 中，他們的prodomain通常都比 較短，而在caspases-1、-2、-4、-8、-9、-10 中，他們的prodomain通 常都比較長。 這些caspase皆有幾個共通點 1.. 50. ：. 可藉由切割形成大小不同的次單位而活化，其切割位置為 Asp 的 C 端肽鍵上。. 2.. 具有本身催化或互相激活的能力. 3.. 具有相似的催化部位，包括 active site cystein residue 的 QACXG 序列。. 目前已發現的caspase至少有 14 種，根據他們的同源性，約可以分成 三大類. 49, 51. ：. （a） The ICE subfamily of cytokine processors： 此類的 capsase 有 casapses-1、-4、-5、-11、-12、-13、-17，大部. 34.
(35) 分都跟發炎反應有關 （b） The Ced-3/CPP subfamily of apoptotic executioners 此類的 caspase 有 caspases-3、-6、-7。其功能為負責執行細胞凋 亡，裂解下游的蛋白，例如：poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）。 PARP 原本的作用為修復已受損的 DNA，但如果當 PRAP 受到 caspase 3 的活化裂解，則會由 116 kD 裂解成 85 kD，失去原本的功能，而使 得朝 apoptosis 的方向進行。 （c） The ICH-1/Nedd-2 subfamily of apoptotic initiators 此類的 caspase 包括了 caspases-2、-8、-9、-10。這類 caspase 的 功能在於活化 apoptotic executioners，使其能執行 apoptosis。. （B）Bcl-2 family. Bcl-2 family包括了Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-Xs、Bax、Bad、Bag、 Bak、Bid。其各有促進以及抵抗apoptosis的功能. 52-56. 。當過度表現Bax. 基因會打亂Bcl-2 或Bcl-XL抑制apoptosis的作用而啟動計畫性死亡 57. 。Bcl-2、Bcl-XL、Bax與Bad可以扮演著channel protein的角色在粒. 線體膜上穿梭. 57-59. 。. Bax與Bak可以控制粒線體膜的通透性而調控apoptosis機制。因此. 35.
(36) Bax與Bak則可以運輸像是cytochrome c與apoptosis inducing factor，而 啟動下游的caspase活化與apoptosis。也有報導指出這些pro-apoptotic 與anti-apoptotic protein的比例可以控制apoptosis是否要進行57, Bcl-2 family各成員功能列在下表. 39. 。. 36. 60-61. 。.
(37) 第四節 多重抗藥性基因（Multiple Drug Resistance；MDR）. 在 1970 年，Bieder等學者發現在p388 白血病細胞株及中國地 鼠肺細胞在對放線菌素D產生抗藥性的同時，對化學結構與作用機制 完 全 不 同 的 抗 腫 瘤 藥 物 如 絲 裂 霉 素 C （ Mitomycin ） 、 柔 紅 霉 素 （Daunorubicin）等也產生抗藥性，這種現象稱為MDR（Multiple Drug Resistance）62。 典型的抗藥性產生就是過度表現P-glycoprotein這個蛋白63-66。 P-glycoprotein為一種可以與膜結合且須能量的幫浦蛋白，可以將藥物 彈出細胞而造成抗藥性67-68。這個大型的P-glycoprotein位於細胞膜上 且有著可以藉由濃度梯度而抵抗一系列斥水性藥物的作用63-66,69。但 是造成抗藥性的機制不單單只有這一種，近來發現在一些不具有p-gp MDR的細胞株，例如H69AR small-cell lung carcinoma（SCLC）cell 會過度表現MRP（Multdrug-resistance associated protein）70。而MRP 為 180-195 kD的抗藥性蛋白。文獻指出，MRP屬於ABC（ATP-binding casstte） superfamily中的傳輸蛋白70-71，其作用有點類似p-gp一樣， 是一種可以將藥物彈出的幫浦蛋白。但MRP出現的位置似乎與p-gp 不是非常類似。有些學者認為MRP主要位在內質網上的膜，而不是細 胞膜. 72-73. 。. 37.
(38) 第三章 第一節. 研究設計與假說. 研究設計. 本實驗利用流式細胞計數儀來分析絞股藍皂苷對人類肺癌細 胞的存活率、細胞週期分布與計畫性死亡細胞的比例情形。再利用倒 立式位像差顯微鏡觀察加入不同濃度的絞股藍皂苷後觀察細胞型態 改變的情形，而後使用 DNA 電泳膠片檢測絞股藍皂苷乾對人類肺癌 細 胞 DNA 斷 裂 的 情 形 。 更 細 微 的 部 分 利 用 分 子 生 物 技 術 ： Reverse-Transcriptase Polymerase chain reacton（RT-PCR）與西方點墨 法（Western blotting）檢測細胞週期素與計畫性死亡相關的分子，找 出絞股藍皂苷在人類肺癌細胞株中如何引起抑制效果與計畫性死亡 的訊息傳遞，進而開發治癌新藥。. 第二節. 研究假說. 許多文獻指出絞股藍皂苷有抗腫瘤作用4與抗氧化作用19，於是 本實驗認為絞股藍皂苷應該可以引起人類肺癌細胞的細胞抑制與計 畫性死亡的產生，經由分子技術的方法，我們得以檢測其細胞抑制與 計畫性死亡的訊息傳遞，進而發現絞股藍皂苷在人類肺癌細胞的應 用。. 38.
(39) 第四章 第一節. 材料與方法. 實驗材料. 1. 細胞株 人類肺癌細胞（Human lung cancer carcinoma cell line：A549）取 自於台灣新竹食品工業發展研究所。. 2. 絞股藍皂苷（Gypenosides）的製備 取自於中國醫藥大學中國醫學研究所陳榮洲博士之製備 9。絞股 藍購自於中草藥店，經陳榮洲博士鑑定之後，取莖葉 600 公克，用 2 公升的水熬煮 1 個小時連續 2 次，將熬汁過濾後以n-butanol抽取，所 得的抽取物以rotary vacuum evaporator（Eyela NH-1, Rikakikai Co., LTD, Tokyo, Japan）在 40 ℃、減壓下濃縮，再以冷凍乾燥機器 （Dura-Top MP, microprocessor control bulk tray dryer, FTS system）在 -50 ℃冷凍乾燥，至於冰箱冷藏備用。. 3. 藥品試劑 【1】F-12K Medium（購自 GIBCO） 【2】Fetal Bovine serum（購自 GIBCO） 【3】L-glutamine（購自GIBCO） 【4】Penicillin-Streptomycin（購自 GIBCO） 39.
(40) 【5】Disodium hydrogen phosphate（Na2HPO4；購自Merck） 【6】Sodium chloride（NaCl；購自 Merck） 【7】Potassium dihydrogen phosphate（KH2PO4；購自Merck） 【8】Potassium chloride（KCl；購自 Merck） 【9】Dimethyl Sulfoxide（DMSO；購自 Sigma） 【10】Trypan Blue（購自 Sigma） 【11】Propidium iodide（PI；購自 Sigma） 【12】Triton X-100（購自 Sigma） 【13】RNase A（Ribonuclease A；購自 Sigma） 【14】Ethanol（購自 TEDIA） 【15】Formaldehyde（購自 Merck） 【16】RNA kit （購自 Qiagen） 【17】Bovine serum albumin (BSA ; 購自 Merck) 【 18 】 Acrylamide/Bis 40% solution (ACRYL/BISTM29:1; 購 自 Amresco) 【19】GelCode® commassie blue (購自 PIERCE) 【20】Protein assay-Dye reagent concentrate (購自 Bio-Rad) 【21】Glyerol (購自 Scharlau) 【22】SDS (Sodium dodecyl sulfate ; 購自 Amresco) 【23】Hydrochloric acid (購自 Merck) 40.
(41) 【24】APS (Ammonium persulfate ; 購自 Amresco) 【 25 】 TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylenediamine ; 購 自 Amresco) 【26】Tris (Tris(hydroxymethly)-aminomethane ; 購自 Amresco) 【27】Glycine (購自 Amresco) 【28】Methanol (購自 TEDIA) 【29】Protein maker (購自 Femantas) 【30】Tween 20 (購自 Amresco) 【31】脫脂奶粉 (購自雀巢奶粉) 【32】ECL kit (Enhanced chemiluminescent kit；購自 Amersham) 【33】顯影劑 (購自 Kodak) 【34】定影劑 (購自 Kodak) 【35】BioMax Flim (購自 Kodak) 【36】蛋白質萃取試劑 (PRO-PREP protein extraction solution ; 購 自 iNtRON Biotechnology) 【 37 】 10X SDS-PAGE running buffer (TG-SDS buffer ; 購 自 Amresco) 【38】4X Protein loading dye (購自 Amresco) 【39】核酸純化試劑組 (G-NOME DNA KIT ; 購自 Bio101 Inc) 【40】Agarose I (購自 Amresco). 41.
(42) 【41】10X BlueJuice (Gel loading buffer ; 購自 Invitrogen) 【42】5X TBE buffer (購自 Amresco) 【43】一級抗體： (a) anti-actin (MAB1501; 購自 Chemicon) 比例：1：500 (b) anti-cdk1/cdc2 (#06-923 ; 購自 Upstate) 比例：1：500 (c) anti-cdk2 (#05-596 ; 購自 Upstate) 比例：1：150 (d) anti-cdk4 (購自 Upstate) 比例：1：500 (e) anti-Cyclin A (#05-374 ; 購自 Upstate) 比例：1：500 (f) anti-Cyclin B1 (#05-373 ; 購自 Upstate) 比例：1：500 (g) anti-Cyclin D1/2 (購自 Upstate) 比例：1：500 (h) anti-Cyclin E (購自 Upstate) 比例：1：500 (i) anti-p21WAF1 (MS-891-P0 ; 購自NeoMarkers) 比例：1：500 (j) anti-p27Kip1 (MS-256-P0 ; 購自NeoMarkers) 比例：1：500 (k) anti-p53p1 (MS-256-P0 ; 購自NeoMarkers) 比例：1：500 (l) anti-caspase 3（RB-1197-P0 ; 購自 NeoMarkers）比例：1： 500 (m) anti-caspase 8（RB-1200-P0 ; 購自 NeoMarkers）比例：1： 1000 (n) anti-caspase 9（RB-1205-P0 ; 購自 NeoMarkers）比例：1： 500 (o) anti-Bcl-2（N-19-sc-492；購自 Santa Cruz Biotechnology,Inc.） 42.
(43) 比例：1：1000 (p) anti-Bax（N-19-sc-492；購自 Santa Cruz Biotechnology,Inc.） 比例：1：1000 (q) anti-Fas（購自 upstate）比例：1：250 (r) anti-NF-κB（p50） （購自 Ztmed. Laboratories. Inc.）比例： 1：250 (s) anti-NF-κB（p65） （購自 Ztmed. Laboratories. Inc.）比例： 1：500 【44】二級抗體 (a). goat anti-mouse IgG (HRP) horseradish peroxidase conjugated antibody (AP124P; 購自 Chemicon) (b). goat anti-rabbit IgG (HRP) horseradish peroxidase conjugated antibody (購自 Chemicon) (c). goat anti-mouse IgG (FITC) fluorescein 5-isothiocyanate conjugated antibody (購自 Chemicon). 4. 設備與器材 【1】細胞培養箱 (購自 Nuaire) 【2】細胞培養盤 (購自 FALCON) 【3】無菌操作台 (購自 Lian Shen) 【4】倒立式位像差顯微鏡 (phase-contrast microscope; 購自 43.
(44) Olympus) 【5】細胞計數器 (Haemocytometer; 購自 Boeco) 【6】離心機 (購自 Beckman) 【7】微量天平 (GR-200; 購自 A&D) 【8】去離子水製造機 (購自 Millipore) 【9】流式細胞儀 (Flow cytometry; 購自 Becton Dickinson) 【10】DNA 電泳槽 (購自 Mupid-2) 【11】酸鹼值測定計 (C831; 購自 Consort) 【12】PVDF membrane (購自 Millipore) 【13】SDS-PAGE 電泳槽套組 (購自 Bio-Rad) 【14】Mini-3D Shaker (購自 Boeco) 【15】Transfer Cell Blot 套組 (購自 Bio-Rad) 【16】Polymerase chain reaction 加熱器. 第二節. 實驗方法. 1. 活化冷凍細胞 首先將新鮮的細胞培養基放入 37 ℃水浴鍋中，等待培養基回溫 至 37 ℃，接著取回溫好的培養基 10 mL至滅菌的 15 mL離心管中， 再從液態氮中取出冷凍管，迅速的將冷凍管移至 37 ℃水浴鍋中，使 冷凍管裡的細胞液急速解凍，盡量使其在 1-2 分鐘內融化，融化之後. 44.
(45) 將冷凍管裡的細胞液取至以含有回溫好的新鮮培養基中。使其混和均 勻後，以 1500 rpm的速度離心 5 分鐘，後去除上清液，再加入新鮮的 培養基 10 mL，接著移入 37 ℃、5﹪CO2的培養箱中培養，隔日及馬 上更換新鮮的培養基，等其長至log phase再拿來當做實驗的樣品。 2. 人類肺癌細胞（A549 cell）的培養 首先將新鮮的培養基回溫至 37 ℃，使用 70﹪的酒精擦拭檯面。 所有放入無菌操作檯的物品都要以 70﹪的酒精擦拭，並帶無菌手套 進行以下的實驗。 人類肺癌細胞(A549 cells)培養在F-12K培養基中，其中含有 10﹪ fetal bovine serum、100 units/mL penicillin、100 µg/mL streptomycin與 2 mM L-glutamine，至於 37 ℃、5﹪ CO2的培養箱中培養。定期更換 新鮮的培養基，當其長到七八分滿時即繼代下來做實驗。 3. 利用流式細胞計數儀檢測絞股藍皂苷對人類肺癌細胞增生的 影響 流式細胞計數儀評估細胞存活率原理如下：當細胞死亡的時候， 其細胞膜會呈現不完整狀態. 74. ，因此利用加入Propidium Iodine（PI）. 染劑，此染劑是可以染細胞核內的核酸，於是細胞膜不完整的細胞就 會被PI染上，而細胞膜完整的細胞則不會被PI染上，再藉由流式細胞 計數儀可以在 488 nm的位置激發出螢光，而死亡的細胞會有較高的. 45.
(46) 紅色螢光，存活的細胞則有較弱的紅色螢光. 75. 。再用Cell Quest軟體. 分析細胞增殖率。 將細胞繼代下來之後，等待到隔天將其更換新鮮的培養基，利用 12 well的培養盤以 2×105 cells/2 mL的密度培養實驗需要的時數，以 DMSO為溶媒，最後加入絞股藍皂苷的最終濃度是 1﹪。等待培養時 間到之後，利用trypsin使細胞游離培養瓶的表面，以PBS 清洗兩次， 將細胞徹底打散，加入 350 µL的 400 µg/mL PI solution，接著以固定 計數秒數（20 秒）及流速（35 µL/min）的速度進行流式細胞計數儀 檢測。每個實驗組皆以三重複增加實驗的準確度。 4. 利用流式細胞計數儀檢測絞股藍皂苷對人類肺癌細胞週期的 影響 細胞使用 12 well的培養盤，給予不同濃度的絞股藍皂苷（c、 100 、150、200、300、400 µg/mL），以 2×105 cells/2 mL的密度培養 實驗需要的時數，以DMSO為溶媒，最後加入絞股藍皂苷的最終濃度 是 1﹪。等培養時間到之後，利用trypsin使細胞游離培養瓶的表面， 以PBS 清洗兩次之後，以 4 ℃、70﹪的酒精固定細胞形態，-20 ℃ 冰箱隔夜存放。隔天，將細胞懸浮液以 1500 rpm、5 分鐘離心去除酒 精上清液，再以PBS 清洗兩次之後，將細胞徹底打散，加入 350 µL 的PI stain染劑，避光 30 分鐘之後轉移到FACS專用小管，進行流式細. 46.
(47) 胞計數儀檢測，以一秒細胞數不超過 300 顆細胞，每個數據收集 10000 顆細胞，數據以Modfit LT®軟體進行處理分析76。每個實驗組皆以三 重複增加實驗的準確度。 PI stain 染劑的配製： 組 成 體積（mL） Propidium iodide (PI) 5 Triton 5 RNase A 1.25 1X PBS 總體積. 13.75. 最終濃度 0.4 mg/dL 1% 0.1mg/mL. 最初濃度 2 mg/dL 5 2 mg/mL. -. -. 25 mL. PS：RNase A 須以 70 ℃、加熱 20 min 處理過後才可使用。 由流式細胞計數儀分析出來標準cell cycle的圖74：. 圖七 進行流式細胞計數儀分析出來的細胞週期標準圖. 47. 74. 。.
(48) 5. 利用倒立式相位差顯微鏡檢測絞股藍皂苷對人類肺癌細胞型 態的影響 細胞使用 6 well的培養盤，給予不同濃度的絞股藍皂苷（c、100、 150、200、300、400 µg/mL） ，以 2×105 cells/3 mL的密度培養 24 小時， 在倒立式相位差顯微鏡下以 400 X來觀察細胞型態。每個實驗組皆以 三重複增加實驗的準確度並取解析度最好的呈現。 6. 檢測絞股藍皂苷是否會對人類肺癌細胞造成計畫性死亡. A. 利用流式細胞計數儀檢測絞股藍皂苷對人類肺癌細胞 sub G1 phase 的分布情形 細胞使用 12 well的培養盤，給予或不給予 300 µg/mL絞股藍皂 苷，以 2×105 cells/2 mL的密度培養實驗所需要的時數，以DMSO為溶 媒，最後加入藥物的最終濃度是 1﹪。等待培養時間到之後，利用 trypsin使細胞游離培養瓶的表面，以PBS 清洗兩次之後，利用 4 ℃、 70﹪的酒精固定細胞形態，-20 ℃冰箱隔夜存放。隔天，將細胞懸浮 液以 1500 rpm、5 分鐘離心去除酒精上清液，再以PBS 清洗兩次之 後，將細胞徹底打散，加入 350 µL的PI stain染劑，避光 30 min之後 轉移到FACS專用小管，上流式細胞儀以一秒細胞數不超過 300 顆細 胞，每個數據收集 10000 顆細胞。數據以Modfit LT®軟體進行處理分 析，每個實驗組皆以三重複增加實驗的準確度。. 48.
(49) B. 利用 DNA 電泳膠片檢測絞股藍皂苷乾對人類肺癌細胞 DNA 斷 裂的情形 細胞使用 6 well的培養盤，給予不同濃度的絞股藍皂苷（c、100、 150、200、300、400 µg/mL） ，以 1×107 cells的細胞數培養實驗所需要 的時數後，利用DNA抽取KIT（G-NOME BIO101 Inc.）將DNA抽取 出來。 DNA 抽取步驟： 將細胞收取下來之後，放入 15 mL 離心管中，加入 PBS 使其細 胞懸浮液為 200 µL，再加入 20 µL 的 QIGEN Protease 使其混和均勻， 接著加入 200 µL 的 Buffer AL，利用 pipetman 來回混和均勻，再使用 vortex 機器使其 vortex 徹底之後，加熱 56 ℃、10 分鐘（此溫度與時 間必須非常準確，且離心管須蓋蓋子，才不會使水蒸氣跑進去或蒸 發） ，從水浴鍋取出的離心管以 1500 rpm、5 秒的速率將細胞液 spin down，加入 200 µL 無水的 ethanol 並使用 pipetman 來回混和均勻徹 底，此時若細胞很多則會呈現黏稠的現象，接下來持續使用 1500 rpm、5 秒的速率將細胞液 spin down，避免細胞在管壁上殘留。將混 和細胞液轉移至 DNA 專用的 column（QIAamp spin column）中，以 13000 rpm、30 秒的速率離心，將 column 中的液體全都離下來，此時 更換新的 2 mL microtube，再加入 500 µL 的 Buffer AW1，以 1500 rpm、. 49.
(50) 30 秒的速率將細胞離心下來，再更換新的 2 mL microtube，加入 500 µL 的 Buffer AW2，以 13000 rpm，3 分鐘、1 分鐘、1 分鐘的速率離 到乾為止。最後加入 50 µL 的 Buffer AE，放在室溫下等待 10 分鐘， 使膜完全被浸濕後以 13000 rpm、1 分鐘的速率將含有 DNA 的 Buffer AE 離心下來，儲存於-20 ℃冰箱中。 將處理好的 DNA 加入 6X DNA loading dye 混合，loading 入含有 0.5X 的 TBE buffer、2﹪的 agarose gel 中，以 50V 的電壓跑膠並以 Eithidium Bromide 染色，最後在 UV light 下照相。 7. 利用 RT-PCR 技術檢測絞股藍苷乾對人類肺癌細胞中 mRNA 改變量的影響 細胞使用 6 well的培養盤，給予不同濃度的絞股藍皂苷（c、100、 150、200、300、400 µg/mL） ，以 1×107 cells的細胞數培養實驗所需要 的時數後，利用RNA抽取KIT（G-NOME BIO101 Inc.）將RNA抽取出 來。 A. RNA 抽取步驟：（此實驗的器材須完全無菌） 將細胞收取下來之後，放入 15 mL 離心管中，加入 600 µL 的 RLT Buffer（β-Mercaptoethanol：RLT＝1：100；β-Me 有穩定 RNA 的作用） ，使用 vortex 機器使其細胞液變澄清，再加入 600 µL、70﹪ 的 ethanol 並使用 pipetman 來回混和均勻徹底，此時若細胞很多則會. 50.
(51) 呈現黏稠的現象。接下來將混和細胞液轉移至 RNA 專用的 column 中，以 13000 rpm、30 秒的速率離心，將 column 中的液體全都離下 來，此時更換新的 2 mL microtube，再加入 700 µL 的 Buffer RW1， 以 1500 rpm、30 秒的速率將細胞離心下來，再更換新的 2 mL microtube，加入 500 µL 的 RPE Buffer，以 13000 rpm、30 秒的速率 離心並重複兩次。最後以 1500 rpm、3 分鐘、1 分鐘、1 分鐘的速率 離到乾為止。最後加入 35 µL 的 RNAase free buffer，放在室溫下等待 10 分鐘，使膜完全被浸濕後以 13000 rpm、1 分鐘的速率將含有 RNA 的 RNAase free buffer 離心下來，儲存於-20 ℃冰箱中。 B. RNA 的定量： 取 198 µL 的滅菌二次水加上 2 µL 的 RNA 溶液在 260 nm 的波長 下測其吸光値，之後乘上 40（1 OD= 40 µg/µL）×100（稀釋 100 倍） = 4000。其値就是 RNA 的濃度。 本實驗室做 PCR 最低的 RNA 量是 1500 ng。 C. RT-PCR（Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reactoin） 將以定量好的 RNA 加入適量的滅菌二次水與 1 µL 的 oligo-dT 跟 1 µL 的 10 mM dNTP 以 65 ℃、5 分鐘的條件加熱，再加入 4 µL 的 5X first-strand buffer、2 µL 的 0.1 M 的 DTT 與 1 µL 的滅菌二次水混. 51.
(52) 和均勻後，加熱 42 ℃、2 分鐘。最後再加入 1 µL 的反轉錄酶加熱 42 ℃、50 分鐘；70 ℃、15 分鐘。成品即為 cDNA。 D. PCR（Polymerase Chain Reactoin） 依下列表格來製作： 成分. 體積（µL）. 滅菌去離子水. 38.1 5. 10X PCR Buffer MgCl2（10 mM）. 1.5. dNTP Mix（10 mM）. 1. Primer 1（10 µM）. 1. Primer 2（10 µM）. 1 2 0.4. cDNA Taq DNA polymerase 將其成品混和均勻後，以加熱 95 ℃、5 分鐘 95 ℃、1 分鐘 55 ℃、1 分鐘. repeat 35 cycles. 72 ℃、1 分鐘 72 ℃、10 分鐘 4 ℃（保存於 4 ℃中） 52.
(53) Table 2. The PCR primers were used in this study. Primers. Act-b1 Act-b2 Cyclin B1 Cyciln D1 Cylin E CDK2 p16 p21 p27 p53 E2F Fas Bcl-2 Bax Bid Bad NF-κB. Sequence 5’-3’. Size References （bp）. 5’-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3’ 5’-CAAACATGATCTGGGTCACTTCTC-3’ 5’-AAGGCGAAGATCAACATGGGC-3’ 5’-AGTCACCAATTTCTGGAGGG-3’ 5’-GAGACCATCCCCCCTGACGGC-3’ 5’-TCTTCCTCCTCCTCGGCGGGC-3’ 5’-GTTGCACCAGTTTGCGTATGTG-3’ 5’-GGCCCTCCACAGCTTCAAGC-3’ 5’-GCTTTCTGCCATTCTCATCG-3’. 21 25 20 20 18 19 22 20 20. 5’-GTCCCCAGAGTCCGAAAGAT-3’ 5’-AGCATGGAGCCTTCGGCTGACT-3’ 5’-CTGTAGGACCTTCGGTGACTGAT-3’ 5’-AGTGGACAGCGAGCAGCTGA-3’ 5’-TAGAAATCTGTCATGCTGGTCTG-3’ 5’-AAACGTGCGAGTGTCTAACGGGA-3’ 5’-CGCTTCCTTATTCCTGCGCATTG-3’ 5’-CAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTAC-3’ 5’-CTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATC-3’ 5’-ACCAGGGTTTCCAGAGATGC-3’ 5’-CACCACACAGACTCCTTCCC-3’ 5’CAGAACTTGGAAGGCCTGCATC-3’ 5’-TCTGTTCTGCTGTGTCTTGGAC-3’ 5’-CGACTTCGCCGAGATGTCCAGCCAG-3’ 5’-ACTTGTGGCTCAGATAGGCACCCAG-3’ 5’-CATGAAGACAGGGGCCCTT-3’ 5’-CATCTTCTTCCAGATGGT-3’ 5’-GGTCTTACAGCAGGCAGTATCC-3’ 5’-TCAGAATCTCTGTGCCATGTG-3’ 5’-AACATTTGGTAGTGAGCACGG-3’ 5’-TTGTCTCCTTTGGAGGGAGG-3’ 5’-GATGAATATGTGTGTATCCG-3’ 5’-TTTGTTGTGCTTGAGAACC-3’. 20 22 23 20 23 23 23 26 26 189 189 680 680 389 389 517 560 162 162 241 241 658 658. 53. 77 78. 79 79 79 80. 81 81 81. 82.
(54) Table 3. The PCR primers were used in this study. Primers. MRP-1 MRP-2 MRP-3. Sequence 5’-3’. Size References （bp）. 5’-ATCATCCTCCACCCTGGGTT-3’ 5’-CACTCATGGTTCAGCTTGTC-3’ 5’-ATCCTCAGCTGCTGAAGTTG-3’ 5’-CTGATCTTGGATGCCAGAAC-3’ 5’-TCAAAGAGGAGATCGCAGAG-3’ 5’-AGCATGAGGATGGTGGGGGCCAG-3’. 270 270 439 439 439 439. 83 84 83. 8. 利用西方點墨法（Western blotting）技術檢測絞股藍皂苷對人 類肺癌細胞中蛋白質改變量的影響. A. 蛋白質的抽取 細胞使用 6 well的培養盤，給予不同濃度的絞股藍皂苷（c、100、 150、200、300、400 µg/mL） ，以 1×107 cells的細胞數培養實驗所需要 的時數後，將細胞收取下來並以PBS清洗 2 次，將上清液徹底吸除， 打散細胞，一邊vortex一邊加入 200 µL 的RIPA lysis buffer［50 mM Tris-Hcl, pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM ethylenediamine-tetra-acetic acid (EDTA)，1 mM ethylene glycol - bis (aminoethylether) - tetra-acetic acid (EGTA)，0.5 mM dithothreitol，1% NP-40，0.3% deoxycholate，10 µg/mL leupeptin，10 µg/mL aprotinin，10 µg/mL soybean trypsin inhibitor，0.5 mM phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)］ 。之後用pipetman將細胞徹 底混和均勻，轉移至 1.5 mL的微離心小管，以 13000 rpm、20 分鐘的. 54.
(55) 速率離心，取其上清液，則蛋白質就在上清液裡。. B. 蛋白質的定量 a. 檢量線的製作 以胎牛血清白蛋白(Bovine serum albumin; BSA)為蛋白質標準 品，依照下列表格製作蛋白質標準品樣品： 濃度(μg/mL). 組 成 0.1 mg/mL BSA (µL) DDW (µL) Bradford 染劑. 0. 1. 5. 10. 25. 50. 0 800. 10 790. 50 750. 100 700. 250 550. 500 300. 200 µL 總體積 1000 µL. 將配製好的蛋白質標準品樣品以三重複的方式依序放入 96 well 培養盤中，利用酵素免疫分析儀(ELISA reader)在 590 nm測定各蛋白 質標準品吸光值之平均值。以蛋白質標準品吸光值與濃度畫出標準品 檢量線，其蛋白質標準品的濃度為 1.5625 µg-50 µg，並求出趨勢線方 程式及R2值。 b. 樣品蛋白質定量： 取 10 µL 的蛋白質樣品與 790 µL 的二次水混合，再加入 200 µL 的 Bradford 染劑，混勻後以三重複的方式依序放入 96 well 培養盤中， 利用酵素免疫分析儀在 590 nm 測定其吸光值平均值。將樣品吸光值 平均值代入趨勢線方程式，則可算出稀釋後樣品的蛋白質濃度，最後 55.
(56) 再乘上稀釋倍數，則可求得實際蛋白質之樣品濃度。 c. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)變性電. 泳： （1） 原理： 電泳法是利用外加電場，對溶液中的帶電分子造成影響而使這些 分子移動。在聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE ； Polyacrylamide Gel Electrophoresis)中，被分析的蛋白質在水溶液電場移動且在凝膠團塊 中被固定。而凝膠有兩大功能包括穩定電泳系統不受對流作用之影響 與形成小孔。 電泳時電流會產生熱量，熱量消散的速度以邊界最快而在中央散 失最慢，於是形成了溫度梯度（gradient）在溶液中引起對流作用， 但是凝膠中則不會有此現象。形成的小孔可以使大分子的泳動受阻礙 85. ，而小分子受到的影響則比較小。丙烯醯胺（acrylamide）與亞甲基. 雙丙烯醯胺（methylene- bis-acrylamide）是聚丙烯醯胺凝膠的成分。 丙烯醯胺與少量的亞甲基雙丙烯醯胺於緩衝溶液中，在自由基催化劑 的存在下會引發聚合反應. 85. 。形成長鏈的聚丙烯醯胺，有些丙烯醯胺. 的位置被亞甲基雙丙烯醯胺取代，而形成交聯。而沒有交聯的聚丙烯 醯胺鏈具有高度的黏滯性。. 56.
(57) 圖八 聚丙烯醯胺/亞甲基雙丙烯醯胺的結構式85。 （2）變性電泳（SDS-PAGE）的配製：. 組. 成. 下層膠 (10% Separation gel) 四片量. 上層膠 (5% Stacking gel) 四片量. 9.6mL 5.0 mL 5.0 mL － 0.2 mL 0.2 mL 20 µL. 6.29 mL 1.02 mL － 1 mL 80 µL 80 µL 8 µL. DDW 40% Acrylamide/Bis (29:1). 1.5 M Tris (pH8.8) 1 M Tris (pH6.8) 10% SDS 10% Ammonium persulfate (APS). TEMED. 下層膠注入膠台後，緩緩用二次水去除氣泡並壓平下層膠的上 緣，等約 45 分鐘待膠體凝固。隨後，將上層膠注入後小心地插入樣 品槽梳子(comb)到未凝固的膠體中，避免氣泡出現於樣品槽(wells)下 緣。等待約 45 分鐘上層膠凝固後拔出樣品槽梳子，並以二次水小心 沖洗樣品槽內避免雜質殘留。將鑄好的膠體放入電泳槽中，加入 Running buffer。用塑膠滴管以抽吸方式去除膠體下緣殘留的氣泡。做 57.
(58) 好的膠體先以 110 V、400 mA 為條件預跑 30 分鐘。將樣品與樣品緩 衝液(Sample buffer)混合後總體積為 16 µL (蛋白質濃度約為 35 µg/µL)，經 95 ℃加熱 5 分鐘後即可使用。取 5 µL 分子量標準品(maker) 和配製好的樣品由左至右分別 loading 到樣品槽中。跑膠先以 50 V 跑 30 分鐘，再以 80 V 跑 60 分鐘。 d. 西方點墨法（Western Blotting）： 樣品的配置與上下層膠的配製詳見於上兩頁。 轉漬（Transfer）： 先配好 transfer buffer。PVDF 轉漬膜先用 100﹪甲醇浸潤 15 秒、 再放於轉漬緩衝液中浸泡 1 分鐘以上，而海綿墊片、3M 濾紙與 PVDF 轉漬膜浸泡於 transfer buffer 至少 30 分鐘。將轉漬夾打開後黑色面朝 自己方向放，取出已浸泡轉漬緩衝液的海綿墊片放於其上面，並依序 在海綿片上放上 3M 濾紙、SDS-PAGE gel 以及 PVDF 轉漬膜(夾層中 間夾切勿有氣泡)、3M 濾紙，最後再放上一片海棉墊片後夾上轉漬 夾，形成三明治夾層的構造。. 58.
(59) 如下圖：. 電極 白. （＋）. 海棉墊片 3M paper membrane gel 3M paper 海棉墊片. 黑. （－）. 接著將轉漬夾放入電泳槽中後放入冰盒中並一併放入旋轉磁石並加 滿轉漬緩衝液。在電泳槽外圍放入足夠的冰塊，使整個系統保持低溫 狀態。以固定安培（400 mA）、最高伏特、1.5 小時為條件，進行蛋 白質轉漬步驟。轉漬完成後取出轉漬膜裁去多餘部分，以 0.05﹪ Tween 20 in 1X PBS 清洗 10 分鐘後，將轉漬膜以 5﹪胎牛血清(溶於 0.05﹪ Tween 20 in 1X PBS 中)進行 blocking 的動作，以室溫 shaking 30 分鐘。取出轉漬膜後於小盒中以 0.05﹪ Tween 20 in 1X PBS 清洗 5 分鐘共 3 次。放入 5 mL 的一級抗體(溶於 5﹪胎牛血清 in 0.05﹪ Tween 20 in 1X PBS 中)（比例視參考廠商建議） ，以 4 ℃overnight 進 行。隔天取出轉漬膜後置於小盒中以 0.05﹪Tween 20 in 1X PBS 清洗 5 分鐘共 3 次。加入 10 mL 的二級抗體溶於 5﹪胎牛血清 in 0.05﹪ Tween 20 in 1X PBS 中，於室溫下搖盪進行 1 小時，最後取出轉漬膜 59.
(60) 後以 0.05﹪Tween 20 in 1X PBS 於小盒中清洗 5 分鐘共 3 次。 轉漬緩衝液配製如下： 組 成 重 量 (g) Tris 6.6 Glycine 28.8 100% Methanol 400 mL 加 DDW 到總體積 2000 mL. 壓片步驟：(暗房中進行) 將轉漬膜浸泡於 ECL 試劑之混合液(每瓶各取 3 mL 等比例混合) 中 30 秒反應。壓片卡匣(Cassette)內先以投影片剪成兩半，再用膠帶 黏合成卡片形式，轉漬膜正面朝上、marker 放左邊置於壓片卡匣 (Cassette)內。以 Hyperfilm 軟片進行壓片，感光時間依轉漬膜上螢光 亮度決定時間長短，約 5 秒至 30 秒不等。感光完成後放入顯影劑進 行顯影步驟(時間依實際觀察決定)，再以清水沖洗 30 秒後放入定影 劑中，過 30 秒後再以清水沖洗 30 秒，底片吊起來晾乾。. 第三節. 分析方法. 1. 數據分析 數據結果以平均值±標準差(mean±SD)表示，實驗組與對照組間 之數據以 student-t test 進行統計比較。當 p<0.05 表示在統計學上具有. 60.
(61) 差異，以（＊）代表，當 p<0.01 以（＊＊）代表，當 p<0.001 以（＊ ＊＊）代表。. 61.
(62) 第五章 第一節. 研究結果. 絞股藍皂苷對人類肺癌細胞株細胞增生的影響. 利用流式細胞計數儀(flow cytometry)評估細胞存活率，結果發 現加入不同濃度的絞股藍皂苷之後，細胞的存活率隨著藥物濃度的 上升而下降，在圖九中可以發現細胞原先從非常密集且集中的狀 態，經由藥物濃度的上升，使得細胞群越來越分散且細胞碎裂情形 越來越嚴重的現象。圖十中可觀察到在 150 µg/mL 濃度的時候就可 以看出存活下降的情形，且到達有 50﹪的細胞抑制，而在 400 µg/mL 的時候，細胞存活率近幾乎等於 0。而在圖十一中，可以發現絞股 藍皂苷對人類肺癌細胞的抑制是有時間上依據的（dose dependent） 。. 62.
(63) control. 100 µg/mL. 150 µg/mL. 200 µg/mL. 300 µg/mL. 400 µg/mL. 圖九 利用流式細胞計數儀使用不同濃度的絞股藍皂苷處理 24 小時 後在人類肺癌細胞株的細胞存活情形。. 63.
(64) 100. Percentage of cells (%). 80. ＊＊＊ 60. ＊＊＊. 40. ＊＊＊ 20. ＊＊＊. ＊＊＊. 0. c. 100. 150. 200. 300. 400. Concentrations of Gypenosides (µg/mL). 圖十 利用流式細胞計數儀評估細胞的增生率。使用不同濃度的絞股 藍皂苷處理 24 小時後，在人類肺癌細胞所檢測到的存活率情 形。數據結果以 mean±SD 値表示，n=3。當 p<0.001 以（＊＊ ＊）代表。. 64.
(65) 120. 6h 12h 24h 48h. Relative cell number (%). 100. 80. 60. 40. 20. 0. c. 100. 150. 200. 300. 400. Concentrations of Gypenosides (µg/mL). 圖十一 利用流式細胞計數儀評估細胞的增生率。使用不同濃度的絞 股藍皂苷處理 6、12、24、48 小時後，在人類肺癌細胞所檢測 到的存活率情形。數據結果以 mean±SD 値表示，n=3。. 65.
(66) 第二節. 絞股藍皂苷對人類肺癌細胞在細胞週期的影響. 利用流式細胞計數儀評估不同濃度的絞股藍皂苷處理 24 小時之 後，加入 PI，觀察其細胞週期的表現。發現隨著藥物濃度的增加， G0/G1 phase 的細胞數有越來越多的趨勢，到 400 µg/mL 的時候， G0/G1 phase 的細胞數上升了 23﹪。由此可知，絞股藍皂苷可以使人 類肺癌細胞引起細胞週期在 G0/G1 phase 的停留，造成 G0/G1 arrest。 （如圖十二、十三、十四、十五）. 66.
(67) control. 100 µg/mL. 150 µg/mL. 200 µg/mL. 300 µg/mL. 400 µg/mL. 圖十二 人類肺癌細胞經過給予不同濃度的絞股藍皂苷處理 24 小時 之流式細胞計數儀所檢測到的情形。隨著藥物濃度的上升， 細胞週期中的 G0/G1 phase 細胞數有明顯的上升。. 67.
(68) ＊＊＊. ＊＊＊. ＊＊＊. ＊. 100. Relative of cells (%). 80. G0/G1 S G2/M. 60. 40. 20. 0. c. 100. 150. 200. 300. 400. Concentratins of Gypeonsides(µg/mL). 圖十三 人類肺癌細胞經過加入不同濃度的絞股藍皂苷處理 24 小時之 流式細胞計數儀所檢測到的情形。隨著藥物濃度的上升，細 胞週期中的 G0/G1 phase 細胞數有明顯的上升。數據結果以 mean±SD 値表示，n=3。當 p<0.05 以（＊）代表，當 p<0.001 以（＊＊＊）代表。. 68.
(69) Cell numbers. 6 hours control. 6 hours 300 µg/mL. 12 hours control. 12 hours 300 µg/mL. 24 hours control. 24 hours 300 µg/mL. 48 hours control. 48 hours 300 µg/mL. DNA content 圖十四 人類肺癌細胞經由給予或不給予 300 µg/mL 絞股藍皂苷處 理 6、12、24、48 小時之流式細胞計數儀所檢測到的情形。 69.
(70) 120. Percentage of cells (%). 100. 80. G0/G1 phase. C 300 µg/mL Gypenosides. ＊＊＊. ＊. ＊＊＊. ＊＊. 60. 40. 20. 0. 6. 12. 24. 48. Incubation time (hours). 圖十五 人類肺癌細胞經由給予或不給予 300 µg/mL 的絞股藍皂苷處 理 6、12、24、48 小時以流式細胞計數儀所檢測到的情形。 隨著時間的上升，G0/G1 phase 的細胞數也隨著上升。數據 結果以 mean±SD 値表示，n=3。當 p<0.05 表示在統計學上 具有差異，以（＊）代表，當 p<0.01 以（＊＊）代表，當 p<0.001 以（＊＊＊）代表。. 70.
(71) 第三節. 絞股藍皂苷對人類肺癌細胞株在 Apoptosis 與細 胞型態上的改變情形. 經由加入或不加入 300 µg/mL 的絞股藍皂苷，培養 6、12、24、 48 小時之後，利用流式細胞計數儀觀察其細胞週期在 sub G1 的細胞 數分布情形。發現隨著時間點的上升，sub G1 的細胞數有明顯的上升 （如圖十六、十七）。利用倒立式相位差顯微鏡觀察細胞的型態，加 入不同濃度的絞股藍皂苷處理 24 小時後，發現細胞數目有明顯下降 的情形，且有細胞膜皺縮、細胞型態不完整、與空泡化的現象（如圖 十八），由此可知絞股藍皂苷對於人類肺癌細胞有引起細胞計畫性死 亡作用。. 71.
(72) 6 hours control. 6 hours 300 µg/mL. 12 hours control. 12 hours 300 µg/mL. 24 hours control. 24 hours 300 µg/mL. 48 hours control. 48 hours 300 µg/mL Apo：26.08﹪. 圖十六 人類肺癌細胞經過給予或不給予 300 µg/mL 絞股藍皂苷處理 6、12、24、48 小時之流式細胞計數儀所檢測到的情形。. 72.
(73) 30. ＊＊＊ C 300 µg/mL Gypenosides. Apoptosis cells(%). 25. 20. 15. 10. ＊＊＊. 5. 0. Incubation Time(hours). 圖十七 利用流式細胞計數儀加入或不加入 300 µg/mL 的絞股藍皂苷 培養 6、12、24、48 小時之後分析 apoptosis 的細胞分布情形。 數據結果以 mean±SD 値表示，n=3。當 p<0.001 以（＊＊＊） 代表。. 73.
(74) (A) control. (B) 100 µg/mL. (C) 150 µg/mL. (D) 200 µg/mL. (E) 300 µg/mL. (F) 400 µg/mL. 圖十八 利用倒立式相位差顯微鏡觀察細胞的型態。加入不同濃度的 絞股藍皂苷處理 24 小時後，發現隨著藥物濃度的上升，細 胞數目有明顯下降的情形，且有細胞膜皺縮、細胞型態不完 整、與空泡化的現象。. 74.
(75) 第四節. 絞股藍皂苷對人類肺癌細胞在 DNA 電泳膠片的 表現情形. 為了更進一步的了解及確定絞股藍皂苷在人類肺癌細胞所引起 的計畫性死亡情形，於是利用 DNA 電泳膠片來觀察其斷裂的 DNA fragment。使用 2%的電泳膠片以 50 V 的電壓跑膠片，並以 ethidium bromide 來染色，在 UV light 下觀察其 DNA 斷裂的情形。在圖十九 中，發現在藥物處理後 6 小時並沒有看見有 DNA 片段的情形，而在 藥物處理 12 小時後，發現有明顯的 DNA 片段表現。由此我們更可 以確定絞股藍皂苷可以在人類肺癌細胞(Ａ549 cell)引起計畫性死亡。. 75.
(76) 6 hours M. c. 300. 12 hours c. 300 (µg/mL). 500 bp 200 bp. 圖十九 利用 DNA 電泳法檢測 DNA 斷裂的情形。加入 300 µg/mL 的 絞股藍皂苷處理後，在 180-200 bp 的位置出現斷裂的 DNA 片斷，形成 ladder 的情形。. 76.
(77) 第五節. 使用 RT-PCR 技術對絞股藍皂苷在人類肺癌細胞 中細胞週期的 mRNA 表現量的改變. 利用 RT-PCR(Reverse-Transcriptase Polymerase chain reaction)技 術觀察對人類肺癌細胞中細胞週期的 mRNA 的改變量，使用絞股藍 皂苷處理 24 小時後，發現在細胞週期中的 Cyclins、CDK、E2F 與 p53 部分，例如：CDK2、CDK4、Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E、E2F、p53（圖二十 A）幾乎沒有什麼改變，而在 CDKI 的部份， 例如 p21、p27（圖二十 B）則有些許的改變。p21 有明顯的上升，而 p27 有些許的上升。β-actin 為 internal control。. 77.
(78) Gypenosides. C. 100. 150. 200. 300. 400 ( µg/mL). CDK2. CDK4. P53. β-actin. 圖二十 A. 以 RT-PCR 分析人類肺癌細胞經加入不同濃度的絞股藍皂 苷處理 24 小時後細胞中 CDK2、CDK4、p53 的相對表現 量。β-actin 為 internal control。. 78.
(79) Gypenosides. C. 150. 200. 300. 400 (µg/mL). E2F. cyclin A. cyclin B1. cyclin D1. cyclin E. p21. p27. β-actin 圖二十 B. 以 RT-PCR 分析人類肺癌細胞經加入不同濃度的絞股藍皂 苷處理 24 小時後細胞中 E2F、cyclin A、cyclin B1、cyclin D1、cyclin E、p21、p27 的相對表現量。β-actin 為 internal control。 79.
數據
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