第三章 研究設計與假說
第二節 研究假說
許多文獻指出絞股藍皂苷有抗腫瘤作用4與抗氧化作用19，於是 本實驗認為絞股藍皂苷應該可以引起人類肺癌細胞的細胞抑制與計 畫性死亡的產生，經由分子技術的方法，我們得以檢測其細胞抑制與 計畫性死亡的訊息傳遞，進而發現絞股藍皂苷在人類肺癌細胞的應 用。
第四章 材料與方法
第一節 實驗材料
1. 細胞株
人類肺癌細胞（Human lung cancer carcinoma cell line：A549）取 自於台灣新竹食品工業發展研究所。
2. 絞股藍皂苷（Gypenosides）的製備
取自於中國醫藥大學中國醫學研究所陳榮洲博士之製備 9。絞股 藍購自於中草藥店，經陳榮洲博士鑑定之後，取莖葉600 公克，用 2 公升的水熬煮1 個小時連續 2 次，將熬汁過濾後以n-butanol抽取，所 得的抽取物以rotary vacuum evaporator（Eyela NH-1, Rikakikai Co., LTD, Tokyo, Japan）在 40 ℃、減壓下濃縮，再以冷凍乾燥機器
（Dura-Top MP, microprocessor control bulk tray dryer, FTS system）在 -50 ℃冷凍乾燥，至於冰箱冷藏備用。
3. 藥品試劑
【1】F-12K Medium（購自 GIBCO）
【2】Fetal Bovine serum（購自 GIBCO）
【3】L-glutamine（購自GIBCO）
【5】Disodium hydrogen phosphate（Na2HPO4；購自Merck）
【6】Sodium chloride（NaCl；購自 Merck）
【7】Potassium dihydrogen phosphate（KH2PO4；購自Merck）
【8】Potassium chloride（KCl；購自 Merck）
【9】Dimethyl Sulfoxide（DMSO；購自 Sigma）
【10】Trypan Blue（購自 Sigma）
【11】Propidium iodide（PI；購自 Sigma）
【12】Triton X-100（購自 Sigma）
【13】RNase A（Ribonuclease A；購自 Sigma）
【14】Ethanol（購自 TEDIA）
【15】Formaldehyde（購自 Merck）
【16】RNA kit （購自 Qiagen）
【17】Bovine serum albumin (BSA ; 購自 Merck)
【18 】 Acrylamide/Bis 40% solution (ACRYL/BISTM29:1; 購 自 Amresco)
【19】GelCode® commassie blue (購自 PIERCE)
【20】Protein assay-Dye reagent concentrate (購自 Bio-Rad)
【21】Glyerol (購自 Scharlau)
【22】SDS (Sodium dodecyl sulfate ; 購自 Amresco)
【24】APS (Ammonium persulfate ; 購自 Amresco)
【25】 TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylenediamine ; 購 自 Amresco)
【26】Tris (Tris(hydroxymethly)-aminomethane ; 購自 Amresco)
【27】Glycine (購自 Amresco)
【28】Methanol (購自 TEDIA)
【29】Protein maker (購自 Femantas)
【30】Tween 20 (購自 Amresco)
【31】脫脂奶粉 (購自雀巢奶粉)
【32】ECL kit (Enhanced chemiluminescent kit；購自 Amersham)
【33】顯影劑 (購自 Kodak)
【34】定影劑 (購自 Kodak)
【35】BioMax Flim (購自 Kodak)
【36】蛋白質萃取試劑 (PRO-PREP protein extraction solution ; 購 自iNtRON Biotechnology)
【37 】 10X SDS-PAGE running buffer (TG-SDS buffer ; 購 自 Amresco)
【38】4X Protein loading dye (購自 Amresco)
【39】核酸純化試劑組 (G-NOME DNA KIT ; 購自 Bio101 Inc)
【40】Agarose I (購自 Amresco)
【41】10X BlueJuice (Gel loading buffer ; 購自 Invitrogen)
【42】5X TBE buffer (購自 Amresco)
【43】一級抗體：
(a) anti-actin (MAB1501; 購自 Chemicon) 比例：1：500 (b) anti-cdk1/cdc2 (#06-923 ; 購自 Upstate) 比例：1：500 (c) anti-cdk2 (#05-596 ; 購自 Upstate) 比例：1：150 (d) anti-cdk4 (購自 Upstate) 比例：1：500
(e) anti-Cyclin A (#05-374 ; 購自 Upstate) 比例：1：500 (f) anti-Cyclin B1 (#05-373 ; 購自 Upstate) 比例：1：500 (g) anti-Cyclin D1/2 (購自 Upstate) 比例：1：500
(h) anti-Cyclin E (購自 Upstate) 比例：1：500
(i) anti-p21WAF1 (MS-891-P0 ; 購自NeoMarkers) 比例：1：500 (j) anti-p27Kip1 (MS-256-P0 ; 購自NeoMarkers) 比例：1：500 (k) anti-p53p1 (MS-256-P0 ; 購自NeoMarkers) 比例：1：500 (l) anti-caspase 3（RB-1197-P0 ; 購自 NeoMarkers）比例：1：
500
(m) anti-caspase 8（RB-1200-P0 ; 購自 NeoMarkers）比例：1：
1000
(n) anti-caspase 9（RB-1205-P0 ; 購自 NeoMarkers）比例：1：
500
比例：1：1000
(p) anti-Bax（N-19-sc-492；購自 Santa Cruz Biotechnology,Inc.）
比例：1：1000
(q) anti-Fas（購自 upstate）比例：1：250
(r) anti-NF-κB（p50）（購自 Ztmed. Laboratories. Inc.）比例：
1：250
(s) anti-NF-κB（p65）（購自 Ztmed. Laboratories. Inc.）比例：
1：500 【44】二級抗體
(a). goat anti-mouse IgG (HRP) horseradish peroxidase conjugated antibody (AP124P; 購自 Chemicon) (b). goat anti-rabbit IgG (HRP) horseradish peroxidase
conjugated antibody (購自 Chemicon)
(c). goat anti-mouse IgG (FITC) fluorescein 5-isothiocyanate conjugated antibody (購自 Chemicon)
4. 設備與器材
【1】細胞培養箱 (購自 Nuaire)
【2】細胞培養盤 (購自 FALCON)
【3】無菌操作台 (購自 Lian Shen)
Olympus)
【5】細胞計數器 (Haemocytometer; 購自 Boeco) 【6】離心機 (購自 Beckman)
【7】微量天平 (GR-200; 購自 A&D) 【8】去離子水製造機 (購自 Millipore)
【9】流式細胞儀 (Flow cytometry; 購自 Becton Dickinson) 【10】DNA 電泳槽 (購自 Mupid-2)
【11】酸鹼值測定計 (C831; 購自 Consort) 【12】PVDF membrane (購自 Millipore)
【13】SDS-PAGE 電泳槽套組 (購自 Bio-Rad) 【14】Mini-3D Shaker (購自 Boeco)
【15】Transfer Cell Blot 套組 (購自 Bio-Rad) 【16】Polymerase chain reaction 加熱器
第二節 實驗方法
1. 活化冷凍細胞
首先將新鮮的細胞培養基放入 37 ℃水浴鍋中，等待培養基回溫 至37 ℃，接著取回溫好的培養基 10 mL至滅菌的 15 mL離心管中，
再從液態氮中取出冷凍管，迅速的將冷凍管移至37 ℃水浴鍋中，使
將冷凍管裡的細胞液取至以含有回溫好的新鮮培養基中。使其混和均 勻後，以1500 rpm的速度離心 5 分鐘，後去除上清液，再加入新鮮的 培養基10 mL，接著移入 37 ℃、5﹪CO2的培養箱中培養，隔日及馬 上更換新鮮的培養基，等其長至log phase再拿來當做實驗的樣品。
2. 人類肺癌細胞（A549 cell）的培養
首先將新鮮的培養基回溫至 37 ℃，使用 70﹪的酒精擦拭檯面。
所有放入無菌操作檯的物品都要以 70﹪的酒精擦拭，並帶無菌手套 進行以下的實驗。
人類肺癌細胞(A549 cells)培養在F-12K培養基中，其中含有 10﹪
fetal bovine serum、100 units/mL penicillin、100 µg/mL streptomycin與 2 mM L-glutamine，至於 37 ℃、5﹪ CO2的培養箱中培養。定期更換 新鮮的培養基，當其長到七八分滿時即繼代下來做實驗。
3. 利用流式細胞計數儀檢測絞股藍皂苷對人類肺癌細胞增生的 影響
流式細胞計數儀評估細胞存活率原理如下：當細胞死亡的時候，
其細胞膜會呈現不完整狀態 74，因此利用加入Propidium Iodine（PI）
染劑，此染劑是可以染細胞核內的核酸，於是細胞膜不完整的細胞就 會被PI染上，而細胞膜完整的細胞則不會被PI染上，再藉由流式細胞 計數儀可以在 488 nm的位置激發出螢光，而死亡的細胞會有較高的
紅色螢光，存活的細胞則有較弱的紅色螢光 75。再用Cell Quest軟體 分析細胞增殖率。
將細胞繼代下來之後，等待到隔天將其更換新鮮的培養基，利用 12 well的培養盤以 2×105 cells/2 mL的密度培養實驗需要的時數，以 DMSO為溶媒，最後加入絞股藍皂苷的最終濃度是 1﹪。等待培養時 間到之後，利用trypsin使細胞游離培養瓶的表面，以PBS 清洗兩次，
將細胞徹底打散，加入350 µL的 400 µg/mL PI solution，接著以固定 計數秒數（20 秒）及流速（35 µL/min）的速度進行流式細胞計數儀 檢測。每個實驗組皆以三重複增加實驗的準確度。
4. 利用流式細胞計數儀檢測絞股藍皂苷對人類肺癌細胞週期的 影響
細胞使用 12 well的培養盤，給予不同濃度的絞股藍皂苷（c、
100 、150、200、300、400 µg/mL），以 2×105 cells/2 mL的密度培養 實驗需要的時數，以DMSO為溶媒，最後加入絞股藍皂苷的最終濃度 是 1﹪。等培養時間到之後，利用trypsin使細胞游離培養瓶的表面，
以PBS 清洗兩次之後，以 4 ℃、70﹪的酒精固定細胞形態，-20 ℃ 冰箱隔夜存放。隔天，將細胞懸浮液以1500 rpm、5 分鐘離心去除酒 精上清液，再以PBS 清洗兩次之後，將細胞徹底打散，加入 350 µL
胞計數儀檢測，以一秒細胞數不超過300 顆細胞，每個數據收集 10000 顆細胞，數據以Modfit LT®軟體進行處理分析76。每個實驗組皆以三 重複增加實驗的準確度。
PI stain 染劑的配製：
組 成 體積（mL） 最終濃度 最初濃度 Propidium iodide (PI) 5 0.4 mg/dL 2 mg/dL
Triton 5 1% 5
RNase A 1.25 0.1mg/mL 2 mg/mL
1X PBS 13.75 - -
總體積 25 mL
PS：RNase A 須以 70 ℃、加熱 20 min 處理過後才可使用。
由流式細胞計數儀分析出來標準cell cycle的圖74：
圖七 進行流式細胞計數儀分析出來的細胞週期標準圖 74。
5. 利用倒立式相位差顯微鏡檢測絞股藍皂苷對人類肺癌細胞型 態的影響
細胞使用 6 well的培養盤，給予不同濃度的絞股藍皂苷（c、100、
150、200、300、400 µg/mL），以 2×105 cells/3 mL的密度培養 24 小時，
在倒立式相位差顯微鏡下以400 X來觀察細胞型態。每個實驗組皆以 三重複增加實驗的準確度並取解析度最好的呈現。
6. 檢測絞股藍皂苷是否會對人類肺癌細胞造成計畫性死亡 A. 利用流式細胞計數儀檢測絞股藍皂苷對人類肺癌細胞 sub G1 phase 的分布情形
細胞使用 12 well的培養盤，給予或不給予 300 µg/mL絞股藍皂 苷，以2×105 cells/2 mL的密度培養實驗所需要的時數，以DMSO為溶 媒，最後加入藥物的最終濃度是 1﹪。等待培養時間到之後，利用 trypsin使細胞游離培養瓶的表面，以PBS 清洗兩次之後，利用 4 ℃、
70﹪的酒精固定細胞形態，-20 ℃冰箱隔夜存放。隔天，將細胞懸浮 液以 1500 rpm、5 分鐘離心去除酒精上清液，再以PBS 清洗兩次之 後，將細胞徹底打散，加入350 µL的PI stain染劑，避光 30 min之後 轉移到FACS專用小管，上流式細胞儀以一秒細胞數不超過 300 顆細 胞，每個數據收集10000 顆細胞。數據以Modfit LT®軟體進行處理分
B. 利用 DNA 電泳膠片檢測絞股藍皂苷乾對人類肺癌細胞 DNA 斷 裂的情形
細胞使用 6 well的培養盤，給予不同濃度的絞股藍皂苷（c、100、
150、200、300、400 µg/mL），以1×107 cells的細胞數培養實驗所需要 的時數後，利用DNA抽取KIT（G-NOME BIO101 Inc.）將DNA抽取 出來。
DNA 抽取步驟：
將細胞收取下來之後，放入15 mL 離心管中，加入 PBS 使其細 胞懸浮液為200 µL，再加入 20 µL 的 QIGEN Protease 使其混和均勻，
接著加入200 µL 的 Buffer AL，利用 pipetman 來回混和均勻，再使用 vortex 機器使其 vortex 徹底之後，加熱 56 ℃、10 分鐘（此溫度與時 間必須非常準確，且離心管須蓋蓋子，才不會使水蒸氣跑進去或蒸 發），從水浴鍋取出的離心管以 1500 rpm、5 秒的速率將細胞液 spin down，加入 200 µL 無水的 ethanol 並使用 pipetman 來回混和均勻徹 底，此時若細胞很多則會呈現黏稠的現象，接下來持續使用 1500 rpm、5 秒的速率將細胞液 spin down，避免細胞在管壁上殘留。將混 和細胞液轉移至DNA 專用的 column（QIAamp spin column）中，以 13000 rpm、30 秒的速率離心，將 column 中的液體全都離下來，此時 更換新的2 mL microtube，再加入 500 µL 的 Buffer AW1，以 1500 rpm、
30 秒的速率將細胞離心下來，再更換新的 2 mL microtube，加入 500 µL 的 Buffer AW2，以 13000 rpm，3 分鐘、1 分鐘、1 分鐘的速率離 到乾為止。最後加入50 µL 的 Buffer AE，放在室溫下等待 10 分鐘，
使膜完全被浸濕後以13000 rpm、1 分鐘的速率將含有 DNA 的 Buffer AE 離心下來，儲存於-20 ℃冰箱中。
將處理好的DNA 加入 6X DNA loading dye 混合，loading 入含有 0.5X 的 TBE buffer、2﹪的 agarose gel 中，以 50V 的電壓跑膠並以 Eithidium Bromide 染色，最後在 UV light 下照相。
7. 利用 RT-PCR 技術檢測絞股藍苷乾對人類肺癌細胞中 mRNA 改變量的影響
細胞使用 6 well的培養盤，給予不同濃度的絞股藍皂苷（c、100、
150、200、300、400 µg/mL），以1×107 cells的細胞數培養實驗所需要 的時數後，利用RNA抽取KIT（G-NOME BIO101 Inc.）將RNA抽取出 來。
A. RNA 抽取步驟：（此實驗的器材須完全無菌）
將細胞收取下來之後，放入 15 mL 離心管中，加入 600 µL 的 RLT Buffer（β-Mercaptoethanol：RLT＝1：100；β-Me 有穩定 RNA 的作用），使用 vortex 機器使其細胞液變澄清，再加入 600 µL、70﹪
呈現黏稠的現象。接下來將混和細胞液轉移至 RNA 專用的 column 中，以 13000 rpm、30 秒的速率離心，將 column 中的液體全都離下 來，此時更換新的2 mL microtube，再加入 700 µL 的 Buffer RW1，
以 1500 rpm、30 秒的速率將細胞離心下來，再更換新的 2 mL microtube，加入 500 µL 的 RPE Buffer，以 13000 rpm、30 秒的速率 離心並重複兩次。最後以 1500 rpm、3 分鐘、1 分鐘、1 分鐘的速率 離到乾為止。最後加入 35 µL 的 RNAase free buffer，放在室溫下等待 10 分鐘，使膜完全被浸濕後以 13000 rpm、1 分鐘的速率將含有 RNA 的RNAase free buffer 離心下來，儲存於-20 ℃冰箱中。
B. RNA的定量：
取 198 µL 的滅菌二次水加上 2 µL 的 RNA 溶液在 260 nm 的波長 下測其吸光値，之後乘上40（1 OD= 40 µg/µL）×100（稀釋 100 倍）
= 4000。其値就是 RNA 的濃度。
本實驗室做 PCR 最低的 RNA 量是 1500 ng。
C. RT-PCR（Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reactoin）
將以定量好的 RNA 加入適量的滅菌二次水與 1 µL 的 oligo-dT 跟 1 µL 的 10 mM dNTP 以 65 ℃、5 分鐘的條件加熱，再加入 4 µL 的 5X first-strand buffer、2 µL 的 0.1 M 的 DTT 與 1 µL 的滅菌二次水混
和均勻後，加熱42 ℃、2 分鐘。最後再加入 1 µL 的反轉錄酶加熱 42
℃、50 分鐘；70 ℃、15 分鐘。成品即為 cDNA。
D. PCR（Polymerase Chain Reactoin） 依下列表格來製作：
Taq DNA polymerase
0.4將其成品混和均勻後，以加熱
Table 2. The PCR primers were used in this study.
Cyclin B1 5’-AAGGCGAAGATCAACATGGGC-3’
5’-AGTCACCAATTTCTGGAGGG-3’
20 20
78
Cyciln D1 5’-GAGACCATCCCCCCTGACGGC-3’
5’-TCTTCCTCCTCCTCGGCGGGC-3’
18 19 Cylin E 5’-GTTGCACCAGTTTGCGTATGTG-3’
5’-GGCCCTCCACAGCTTCAAGC-3’
22 20 CDK2 5’-GCTTTCTGCCATTCTCATCG-3’
5’-GTCCCCAGAGTCCGAAAGAT-3’
20 20 p16 5’-AGCATGGAGCCTTCGGCTGACT-3’
5’-CTGTAGGACCTTCGGTGACTGAT-3’
22 23
79
p21 5’-AGTGGACAGCGAGCAGCTGA-3’
5’-TAGAAATCTGTCATGCTGGTCTG-3’
20 23
79
p27 5’-AAACGTGCGAGTGTCTAACGGGA-3’
5’-CGCTTCCTTATTCCTGCGCATTG-3’
E2F 5’-ACCAGGGTTTCCAGAGATGC-3’
5’-CACCACACAGACTCCTTCCC-3’
189 189
Fas 5’CAGAACTTGGAAGGCCTGCATC-3’
5’-TCTGTTCTGCTGTGTCTTGGAC-3’
680 680
81
Bcl-2 5’-CGACTTCGCCGAGATGTCCAGCCAG-3’
5’-ACTTGTGGCTCAGATAGGCACCCAG-3’
389 389
81
Bax 5’-CATGAAGACAGGGGCCCTT-3’
5’-CATCTTCTTCCAGATGGT-3’
517 560
81
Bid 5’-GGTCTTACAGCAGGCAGTATCC-3’
5’-TCAGAATCTCTGTGCCATGTG-3’
162 162 Bad 5’-AACATTTGGTAGTGAGCACGG-3’
5’-TTGTCTCCTTTGGAGGGAGG-3’
241 241 NF-κB 5’-GATGAATATGTGTGTATCCG-3’
5’-TTTGTTGTGCTTGAGAACC-3’
658 658
82
Table 3. The PCR primers were used in this study.
Primers Sequence 5’-3’ Size References （bp）
MRP-1 5’-ATCATCCTCCACCCTGGGTT-3’
5’-CACTCATGGTTCAGCTTGTC-3’
270 270
83
MRP-2 5’-ATCCTCAGCTGCTGAAGTTG-3’
5’-CTGATCTTGGATGCCAGAAC-3’
439 439
84
MRP-3 5’-TCAAAGAGGAGATCGCAGAG-3’
5’-AGCATGAGGATGGTGGGGGCCAG-3’
150、200、300、400 µg/mL），以1×107 cells的細胞數培養實驗所需要 的時數後，將細胞收取下來並以PBS清洗 2 次，將上清液徹底吸除，
150、200、300、400 µg/mL），以1×107 cells的細胞數培養實驗所需要 的時數後，將細胞收取下來並以PBS清洗 2 次，將上清液徹底吸除，