鹽度和pH值對青鱂魚仔魚排氨機制的影響

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 鹽度和 pH 值對青鱂魚仔魚排氨機制的影對青鱂魚仔魚排氨機制的影響 Effect of salinity and pH on ammonia excretion in medaka larvae (Oryzias latipes). 研究生：宗麟 Lin Tsung. 指導教授：林豊益博士 Li-Yih Lin. 中華民國 100 年二月.

(2) 目錄. 目錄............................................................ ................................................................................................................... .......................................................1 目錄............................................................ .......................................................1 誌謝...................................................................................................................2 誌謝...................................................................................................................2 摘要............................................................................... ................................................................................................................... ....................................3 摘要............................................................................... ....................................3 Abstract............................................................................................................. .............................................................................................................4 .............................................................................................................4 前言................................................................................................. ................................................................................................................... ..................5 前言................................................................................................. ..................5 材料與方法.................................................................................................... 材料與方法....................................................................................................1 ....................................................................................................14 實驗設計........................................................................................................1 實驗設計........................................................................................................19 ........................................................................................................19 結果............... 結果.................................................................................................................2 .................................................................................................................23 ..................................................................................................23 討論.................................................................................................................2 討論.................................................................................................................28 .................................................................................................................28 參考文獻................................. 參考文獻........................................................................................................3 ........................................................................................................37 .......................................................................37 圖表................................................................................................................. 圖表.................................................................................................................4 .................................................................................................................44. 1.

(3) 誌謝在即將畢業的前夕，回想過去兩年半的生活猶如一轉眼間的改變，畢業似乎是一種感覺。從未知的領域帶領我到研究的目標，林豊益老師林豊益老師功勞匪淺，我就林豊益老師像是大海中盲目漂泊中的船隻，而您就像是無形的手指引我正確的研究方向，感激您。感謝黃鵬鵬老師黃鵬鵬老師和洪君琳老師黃鵬鵬老師洪君琳老師在期末百忙之中蒞臨口試指導，針對實驗癥洪君琳老師結提供許多寶貴的意見。系辦漢英助教漢英助教細心叮嚀著口試畢業要繳交的文件，漢英助教 E-mail 的提醒常常警惕著我，辛苦您了。感謝施廷翰學長施廷翰學長提供向上提升硬碟和夜晚的丟球運動，並時常給予實驗的意施廷翰學長見，讓我能順利完成實驗。還有正港人才快去買。感謝吳淑貞學姐吳淑貞學姐指導我學習電吳淑貞學姐生理技術，並在我無力時給予我背後用力的一拍，我都醒了! 感謝是每個人的麻吉咸台學長咸台學長，分子實驗佐證我生理實驗的意義。感謝佩玲學妹佩玲學妹和咸台學長佩玲學妹和婉萍同學，下班婉萍同學後的聚餐常使我一掃心中的不愉快。感謝龐威龐威(學妹龐威學妹?)，忍受我實驗不順的情緒學妹不穩，妳依然在我身邊。感謝柏諺和揚彥學弟柏諺和揚彥學弟，最後半學期裡，感謝有你們幫我柏諺和揚彥學弟準備實驗材料和豐盛的午餐。感謝元誠同學元誠同學，時常提醒我應該繳交的文件。更要元誠同學感謝一直在背後支持我的父母我的父母，讓我在老大不小的年齡裡依舊衣食無缺，繼續讓我的父母我求學，是的，我該踏入工作了。請各位多多包涵本人的記性不好，我誠心感謝曾經默默支持鼓勵過我的大人物。因為有你們的存在，才造就今天的我，我很幸福，我愛大家!. 宗麟 2011 年立春. 2.

(4) 摘要近年文獻發現氨主要以非離子態 NH3 經由 Rh 蛋白排除。目前海水魚的排氨機制尚不清楚，本實驗以青鱂魚仔魚為模式動物，利用掃描式離子選擇電極技術(SIET)進行非侵入性測量，驗證假說(一)海水魚執行與淡水魚類似的排氨機制，(二)魚體誘導酸中毒會增加氨排放促進排酸。結果顯示，海水組排 NH4+和排 H+功能同時存在 MRC 上，且排氨速率顯著高於淡水組，並導致體表的鹼化，意味著在 MRC 上是以非離子態的 NH3 進行運輸後，在體表進行酸捕捉(acid trapping)。使用 NHE 抑制劑(500 µM EIPA)後，顯著降低魚體排酸、排氨，暗指 NHE 在排氨機制上扮演關鍵性的角色。馴養淡水酸性(pH5)環境的仔魚，顯示降低體表 H+的累積，提升 NH4+的排放，並增強細胞 Na+的吸收，意味著酸中毒會增強排氨機制，利用排氨帶動大量酸排放，使 NH3 與 H+結合成 NH4+，促使更多的酸排出。本實驗證明(一)海水魚執行與淡水魚類似的排氨機制，(二)當魚體酸中毒會增強排氨機制，以利排酸。. 關鍵字：排氨機制、青鱂魚仔魚、海水魚、酸中毒. 3.

(5) Abstract Ammonia excretion in seawater (SW) teleost was rarely studied. In this study, an ion-selective microelectrode technique (SIET) was applied to analyze the ionic (H+ or NH4+) activity at the skin cells of SW-acclimated medaka (Oryzias latipes) larvae. Results showed that H+ and NH4+ were mainly excreted by mitochondrion-rich cells (MRCs). The excretion rate of NH4+ was significantly higher in SW than in FW. Elevated ammonia excretion in SW-larvae alkalized the skin surface, suggesting that non-ionic NH3 is excreted by MRCs. Both NH4+ and H+ excretion were inhibited by EIPA, suggesting that Na+/H+ exchanger (NHE) plays a critical role in the ammonia excretion. On the other hand, raising the acidity of water (FW, pH5) enhanced NH4+ excretion and Na+ uptake by MRCs whereas it reduced the H+ accumulation on the skin surface. This study demonstrated that mechanism of ammonia excretion in SW is similar to that in FW. In addition acidic water can enhance the NH4+ excretion and Na+ uptake in larvae.. Keywords：ammonia excretion, medaka larvae, SW-acclimated, acidity of water. 4.

(6) 前言魚類的酸鹼恆定陸生動物為維持血液中酸鹼恆定，是利用呼吸的氣體交換頻率改變，進而調整血液 CO2 分壓，以達到立即性調節血液酸鹼度，並在腎臟泌尿系統上的內皮細胞執行 HCO3–再吸收，以維持血液酸鹼恆定。對於魚類來說，其體表、直腸腺、腎臟、鰓等器官皆可執行酸鹼的運輸，其中鰓負責 90％以上的酸鹼調節，為最主要酸鹼調節場所(Evans et al., 2005)。因鰓具有大量水流通過，以便於作氣體和離子的交換，所以 CO2 容易通過鰓表皮而排除，使得血中 CO2 分壓比利用肺呼吸的動物低(Marshall and Grosell, 2005)，但利用血液中溶解之 CO2 量的改變來調節酸鹼恆定的效果仍有限，所以魚類是藉由鰓上離子細胞調節酸性離子的跨表皮運送，以維持酸鹼平衡。然而鰓的酸調節機制與鹽類吸收機制有關，排酸的同時伴隨著 Na+的吸收。故魚類生存環境的 pH 值和鹽度的組成，對於鰓執行酸調節時具有重大的影響(Perry and Gilmour, 2006)。. 表皮排酸機制魚鰓表皮細胞進行排酸主要是以 H+離子的方式排除，目前普遍認為表皮細胞排 H+機制假設模式有二：其(一)藉由分佈於表皮細胞頂 5.

(7) 膜的氫幫浦蛋白(H+-ATPase)執行主動運輸排除 H+，主動排除 H+的結果造成頂膜內外的電位差異，形成電梯度，進而使 Na+經表皮鈉通道蛋白(epithelial sodium channel, ENaC)流入細胞中，達到 Na+吸收。其 (二)由分佈於表皮細胞頂膜的鈉氫交換蛋白(Na+/H+ exchanger, NHE) 進行頂膜上的 Na+、H+等電性交換，達到排酸並伴隨吸收 Na+的作用 (Evans et al., 2005; Hwang and Lee, 2007; Perry and Gilmour, 2006)。從上述模式中推測，鰓表皮上負責執行排酸的細胞需有較高的能量代謝速率及離子調節機制，以進行主動運輸，而構成鰓表皮的兩種主要細胞類型：pavement cell (PVC)和 mitochondria-rich cell (MRC，氯細胞、離子細胞)中，富含粒線體的 MRC 為主要進行離子調控的細胞。前人利用 Scanning Ion-Selective Electrode Technique (SIET)測量斑馬魚仔魚體表細胞的研究中發現有一型主要執行排酸的離子細胞，因其頂部細胞膜富含 H+-ATPase 的特色，而被稱為富含氫幫浦細胞(proton pump-rich cell, HR-cell)(Lin et al., 2006)，並處理 bafilomycin(H+-ATPae inhibitor)阻斷 H+-ATPase 後，抑制其表現會降低整體排 H+程度(Shih et al., 2008)，證明 HR-cell 對於排酸的重要性。前人利用斑馬魚酸性(pH4) 馴養，使用免疫螢光染色發現體表 HR-cell 的表現增加，進一步利用 SIET 觀察到 HR-cell 的排酸量顯著增加，證明酸性馴養會誘導大量酸的排放(Horng et al., 2009)。但因魚種類、環境鹽度、pH 值的不同，. 6.

(8) 其執行離子運輸蛋白和所分佈的細胞類型皆會有所差異(Evans et al., 2005)，所以類似的排酸細胞在其他魚類是否存在，以及海水魚類是以何種機制執行排酸，仍欠缺細胞生理的檢測。. 海水中的排 H+機制由於海水中 Na+濃度較高，有利於 Na+藉由細胞膜內外的梯度，通過表皮細胞頂膜而進入魚體，海水魚類普遍被認為細胞頂膜上的 NHE 應比在淡水魚類有較強的驅動力，因受環境離子濃度驅動執行調節功能。在其他魚種例如 rainbow trout 和 coho salmon 的研究中發現馴養於海水中的個體，其鰓上有較少耗能的 H+-ATPase 表現，反之增加海水中驅動力較佳 NHE 的表現(Lin and Randall, 1994; Wilson et al., 2002)，並且馴養於半淡海水中的 long horn sculpin 給予處理 NHE 抑制劑後降低了 75％的排酸量(Claiborne et al.,1997)。這些結果暗指出海水魚類鰓上主要是利用 NHE 執行排酸而不是 H+-ATPase。但在廣鹽性吳郭魚胚胎的淡海水馴養實驗中，發現 MRC 頂膜表現 NHE3 的數量淡水組較海水組多(Hiroi et al., 2008)；而在成魚鰓組織的 NHE3 mRNA 表現量兩組間無明顯差異(Inokuchi et al., 2008)。所以目前 NHE 在海水魚排酸機制中扮演什麼樣的角色尚不清楚。. 7.

(9) 鈉氫交換蛋白 NHE Na+/H+ exchanger 是以 1：1 等電性交換 Na+和 H+的膜運輸蛋白，目前在人類基因組中已得知具有 9 型 NHE（SLC9A1–9），其中 NHE2 主要分佈於腎臟皮質亨耳氏套上升支、遠曲小管、集尿管的內皮細胞膜上；NHE3 則主要分佈於近曲小管，而較少表現於亨耳氏套上升支，此二型可能參與體內的 Na+吸收與 H+排放(Choe et al., 2005; Hwang and Lee, 2007)。Catches 等人(2006)利用海水 sculpin，進行免疫螢光染色，發現 NHE2 表現在 MRC 上，而 Choe 等人(2005)也在淡海水馴養 Atlantic stingrays 的研究中，利用免疫螢光染色和原位雜交實驗，證明 NHE3 在一型離子細胞上，所以推測 NHE 蛋白具有調節體內離子與酸鹼平衡的功能。當誘導魚類產生代謝性酸中毒時，NHE2 和 NHE3 兩型皆有顯著增加表現(Edwards et al., 2005; Tresguerres et al., 2005)，而生長於 pH 3.5 酸性湖泊中的 Osorezan dace，也發現 NHE3 mRNA 的表現量比馴養 pH7 水體中的個體高(Hirata et al., 2003)，暗指在遭受到體內大量酸累積或環境不利於排酸時，NHE 在排酸功能上扮演重要的角色。. 魚類含氮廢物代謝魚類主要排除含氮廢物的場所為鰓部，體內產生的含氮廢物有超過 85%是藉由鰓排出(Evans, 2005)。含氮廢物以氨和尿素型式存在， 8.

(10) 且魚類傾向以氨的形式排放。氨在體內存在為兩種形式，氣態的 NH3 與離子態的 NH4+，且在體內主要以離子態存在。少量的氣態 NH3 可藉由梯度以擴散的方式通透細胞膜，然而離子狀態的 NH4+則難以直接通透細胞膜(Knepper et al., 1989)，因此必須藉由離子運輸蛋白參與作用，將之排出體外。. 魚類的排氨機制過去研究認為主要為兩種方式：(一)魚體藉由濃度梯度進行簡單擴散，將 NH3 由鰓表皮排出體外；(二)魚體藉由鰓表皮細胞所表現的離子運輸通道蛋白將 NH4+送出體外(Wilkie, 2002; Evans et al., 2005)。氨幾乎不存在於一般正常水體中，而硬骨魚類血液中氨濃度約為 0.2~0.5 mM (Evans et al., 2005)，於是 NH3 能夠藉由濃度梯度進行簡單擴散，通過細胞膜排出體外。Wright 等人(1995)認為魚鰓在進行排 H+的過程中有利於 NH3 的排除，擴散出鰓表皮的 NH3 會與外在水體中的 H+結合形成 NH4+ 以降低鰓表皮上的 NH3 濃度，進而維持鰓表皮內外較大的 NH3 濃度梯度差異，以利 NH3 進行簡單擴散。而這些鰓表皮所排出的酸，被認為主要是藉由鰓表皮氣體交換所排放的二氧化碳溶於水中所解離出的 H+。因此，這種排 NH3 機制稱為酸捕捉(acid traping)。前人的研究指出，降低馴養水體 pH 值會導致 H+排放增加，. 9.

(11) 且氨排放也會伴隨增加，顯示 NH3 與 H+結合形成 NH4+，增加氨的排除(Avella, 1989; Wilson, 1994)。此外，給予 amiloride(NHE 抑制劑)後，氨的排放也會被抑制，所以 NHE 也可能藉由排酸以增加 NH3 的擴散作用(酸捕捉機制)，而非直接參與運送 NH4+ (Willkie 2002; Hung et al. 2007)。. Rh 醣蛋白參與排氨機制前人的研究中，在魚類鰓上發現有四型 Rh 醣蛋白異構型(Rhag, Rhbg, Rhcg1, Rhcg2)，被認為具有運輸氨的功能(Braun et al., 2009; Hung et al., 2007; Nakada et al., 2007a; Nakada et al., 2007b; Nawata et al., 2007)，Nakada 等人(2007a)進一步將這四型基因表現於非洲爪蟾 (Xenopus laevis)的蛙卵上進行功能的分析，證明這四型 Rh 醣蛋白都能夠參與氨的運送。Khademi 等人(2004)經由蛋白質結構分析，認為 Rh 蛋白較偏向為通道蛋白(channel)，並推論此通道可通透氣態氨的形式(NH3)而非離子態銨(NH4+)，模式為先將 NH4+解離形成 H+和 NH3，通過通道後再與 H+結合成離子態的 NH4+。 Nakada 等人(2007b)利用斑馬魚證實 Rh 相關基因的表現，發現 Rhcg1 mRNA 在成魚鰓上表現量最高，並利用免疫染色法證明 Rhcg1 主要表現於負責排酸功能的富含氫幫浦細胞上(H+-pump rich cell, HRC)，接著 Shih 等人(2008)利用 SIET 證明其 HRC 上排放氨的生理 10.

(12) 功能，顯示 HRC 可能與排氨功能相關，暗指著排酸與排氨功能的酸捕捉機制存在。. 淡水青鱂魚的排氨機制 Wu 等人(2010)利用 SIET 測量發現排 NH4+與 Na+吸收主要發生在 MRC，並發現體表有排酸(MRC+)和排鹼(MRC-)兩型，而高氨馴養會增加(MRC-)的比例。在測量環境中給予短時間的高氨處理，MRC-會轉變為 MRC+(排酸型)，顯示 MRC-可能排除 NH3 造成細胞外 H+被結合成 NH4+而形成體表鹼性的結果。接著利用原位雜交和免疫螢光染色證明 NHE3 和 Rhcg1 共同表現在離子細胞上，而 Rhcg1 位於頂膜，被認為主要為提供 NH3 排放的通道，並驅動 NHE3 將 H+排除，在體表酸累積的微環境(acid layer)進行酸捕捉，以達到排 NH4+之目的。這些證據顯示 NHE 可能經由排酸在體表累積，以增加 NH3 的擴散作用，而非直接參與運送 NH4+。然而至今海水魚的排氨機制還尚不清楚。. 海水的海水的排氨機制 Willkie 等人(2002)認為海水魚排氨可以利用幾個可能的途徑，(一) 氣態氨的型式直接通透細胞膜，(二)經由較不緊密的細胞間隙排除， (三)利用 NHE 進行 Na+/NH4+交換排除。Hung 等人(2007)利用海水馴 11.

(13) 養的 killifish 進行 RT-PCR 數種 Rh 異構型的表現，發現在鰓組織上主要表現 Rhcg2，被認為與排氨有關，但仍然不知表現於何種細胞上。而 Nawata 等人(2010)進一步利用海水 pufferfish 進行免疫螢光染色，證明 Rhcg1 表現在 MRC 頂膜上，被認為執行排氨功能。前人的分生證據指出海水魚有著與淡水類似的排氨相關蛋白，但仍欠缺更直接的生理證據. 論文研究目標綜合前言之論點，在細胞內脫 H+後，經由 Rh 蛋白運送 NH3，伴隨 NHE 進行 Na+吸收、H+排出，在體表酸累積的微環境進行酸捕捉，進而將 NH4+排除體外。我們提出假說：(一)海水魚執行與淡水魚類似的排氨機制進行氨的排除。當魚體遭受到代謝性酸中毒，會大量表現排酸蛋白(H+ pump 和 NHE)，提升酸的排放量以維持體內恆定。提出假說：(二)當魚體面臨酸中毒，欲將大量 H+排放，會誘導大量氨的排放促進排酸(增強排氨機制)。利用非侵入性的 SIET，進行研究目標如下： (1) 試檢測海水魚排氨機制是以氣態氨(NH3)型式排除，並進行酸捕捉，以達到排氨之目的。並驗證 NHE 對於海水魚排氨機制的重要性。. 12.

(14) (2) 試檢測魚體遭受到代謝性酸中毒，其排氨與排酸之間的關係。. 13.

(15) 材料與方法一、實驗動物(青鱂魚仔魚) 本次實驗使用的廣鹽性物種為日本青鱂魚(Japanese medaka, Oryzias latipes)，是一種經常使用於遺傳、胚胎發育等方面研究的模式動物，其基因體小所以適用於基因功能之研究，並可耐受高達 35 ppt 的鹽度環境(Inoue and Takei, 2002)。給予光週期 14 小時、暗週期 10 小時的刺激下，可每日進行交配產卵。取下受精卵先以人工淡水(pH7) 馴養 2 天後，轉移至不同的馴養水體組別，直到孵化後進行實驗。淡水馴養的仔魚，孵化常在受精後 7 天(7-dpf)，海水馴養則較慢孵化，取其仔魚進行實驗。. 二、馴養水體使用超純水，加入各種鹽類配製。人工淡水(FW)的配製，超純水中加入 0.5 mM NaCl、0.2 mM CaSO4、0.2 mM MgSO4、0.16 mM KH2PO4、0.16 mM K2HPO4，使用 1N NaOH 和 1N HCl 滴定至 pH5、 pH7、pH8。海水(30‰)的配製，使用超純水加入人工合成的海鹽(Instant Ocean, Aquarium Systems, and Mentor, OH)而成，使用 HCl 滴定至 pH8。高氨海水(HA-SW)分別添加 2.5、5 mM (NH4)2SO4 配製，並滴定至 pH8。 14.

(16) 三、掃描式離子選擇電極技術(Scanning Ion-Selective Electrode Technique, SIET) 利用SIET專一性單一離子種類的電極進行離子濃度差(ionic gradient)或細胞流量(flux)的檢測。利用拉針器將直徑1.5 mm的毛細玻璃管加熱拉製成前端口徑約3-4 µm的微電極，置於120℃烘箱中去除水氣。微玻璃電極裡面填充能專一通透離子的選擇性離子交換膜 (liquid ion exchanger cocktail；LIX)以及欲測離子的電解液(H+:40 mM KH2PO4和15 mM K2HPO4，NH4+:100 mM NH4Cl，Na+:100 mM NaCl)，即成為能專一通透特定離子的選擇性離子微電極，本研究選用H+、 NH4+、Na+ LIX來製作離子電極，作為各離子的檢測。使用步進馬達做三度空間移動時，可測量到固定距離間單一種類的離子濃度差，進而計算出所測量該離子在細胞表面的流量與方向(吸收或排放)。利用標準溶液(H+:pH7、8、9，NH4+:1、10、100 mM NH4Cl，Na+:1、10、 100 mM NaCl)，透過log [H+]、[NH4+]、[Na+]所得到的電壓輸出值，經由線性迴歸產生該離子的涅斯特斜率(Nernstian slope)(H+:54.3±0.9(n=7)、NH4+:57.3±0.5(n=7)、Na+:56.9±0.8(n=7))，即可將其測量樣本的電壓值換算成該離子所相對應的濃度。SIET具有即時、高空間解析度與非侵入性的特性，已被應用於多種領域之研究測量(McLamore et al., 2009; Smith et al., 1999)。. 15.

(17) 四、體表整體值離子濃度測定測量環境溫度維持室溫(26~28度)。測量仔魚前，必須先將其麻醉，2ml的測量麻醉劑配製為海(淡)水中加入300 µM tricine緩衝溶液 (Sigma-Aldrich)和0.3 mg/l ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222, Sigma- Aldrich)，再利用1N NaOH和1N HCl滴定至實驗設計的pH值。由於NH4+ LIX對於K+也具有較高的選擇度，因此使用無K+ 淡水(0.5mM NaCl, 0.05mM (NH4)2SO4, 0.2 mM CaSO4, 0.2 mM MgSO4, 0.16 mM NaH2PO4, 0.16 mM Na2HPO4)作為測量水體，以排除K+的干擾。麻醉後置於載臺中央，並使其平躺於載台上3分鐘，將微電極移動至靠近體表10~20 um測量離子累積的電位值，之後再遠離體表約1 cm處測量為背景值。. 五、細胞離子濃度測定利用DIC光學顯微鏡載搭配數位相機的即時影像(LiveView)，功能將觀察畫面傳送至電腦螢幕，以操控離子微電極的移動和辨別表皮細胞。細胞流量的測量，操作步進馬達使離子電極移動至距離欲測量的離子細胞頂端細胞膜上2 µm的位置，進行10 µm的電極擺動測量，以得兩點之間的電位差值。在MRC與KC表面各重複十次擺動測量，取中位數計算後，即可記錄體表細胞所排放或吸收的濃度或離子流。. 16.

(18) 計算離子流量的方法，參考前人已發表的研究(Donini and O'Donnell, 2005; Shih et al., Smith et al., 2009)。經由ASET軟體獲得電位差值，進而利用下列方程式轉換成濃度： ∆C = C b x 10(∆V/S) – C b;. (1). ∆C (µmole l-1 cm-3)為兩點的濃度梯度；C b (µmole l-1)為背景值的濃度；∆V 為電位梯度；S 為涅斯特斜率。經由 Fick's 擴散定律，將已知濃度利用下列方程式換算成離子流量： J = D(∆C) / ∆X;. (2). J (pmole cm-2 s-1)為離子的淨流量；D 為離子的擴散常數(淡水 H+:9.37 x 10. -5. cm2 s-1、海水 H+:8.75 x 10-5 cm2 s-1、NH4+:2.09 x 10-5 cm2 s-1、. Na+:1.55 x 10-5 cm2 s-1)；∆C (pmole cm-3)為離子濃度梯度；∆X (cm)為兩點距離。欲求 ∆C，將公式反推即可得細胞累積濃度： ∆C = J / D x ∆X;. (3). 六、Ammonia Assay Kit (Sigma-Aldrich) 原理為利用酵素與 NH4+進行反應，進而定量其生物樣本中 NH4+ 的濃度。反應方程式如下： KGA + NH4+ + NADPH. GDH. L-Glutamate + NADP+ + H2O. 加入的α-ketoglutaric acid (KGA)、nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)和 L-glutamate dehydrogenase (GDH)會與 NH4+進. 17.

(19) 行反應，由於反應的過程中，NADPH 氧化的產物 NADP+，會與 NH4+ 的濃度成正比，所以使用分光光度計 340 nm 光譜下，可觀察其吸收值。利用標準溶液(0.5、0.25、0.125、0.0625 mM NH4+)，使用分光光度計 340 nm 光譜下，可得各濃度所相對應的吸光值，經由線性迴歸可得校正曲線，再將樣本的吸光值帶入該方程式換算，即可得該樣本相對應的 NH4+濃度。此分析方法可測得的 NH4+濃度範圍為 0.2~15 µg/ml。. 七、5-ethylisopropyl amiloride 處理 5-ethylisopropyl amiloride (EIPA, Sigma-Aldrich)溶解於有機溶劑 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich)，並稀釋於實驗水體中。仔魚浸泡在 100、200、500、1000 µM EIPA (DMSO:水體=1:1000)30 分鐘，並且處理控制組 1/1000 的 DMSO 相同浸泡 30 分鐘。處理完後，立即輕輕沖洗數次，並放置麻藥水體中，進行 SIET 測量。. 18.

(20) 實驗設計一、實驗樣本的準備：. 受精卵. 轉換水體. 孵化馴養(5天). 第0天 FW(pH7). 2. FW(pH8). 實驗. 7. 8. SW(pH8) and HA-SW(pH8) FW(pH5). SIET. FW(pH7). 二、測量各馴養組別的體表、細胞所累積 H+、NH4+、Na+之濃度以測量腹面卵黃囊體表做為整體值(skin)，測量 MRCs 和 KCs 作為細胞(cellular)累積的濃度，並加以區分不同區域(卵黃囊、軀幹)的細胞(圖 2A)。. 實驗一：鹽度馴養的青鱂魚仔魚，對其排放 NH4+濃度之影響利用Ammonia Assay Kit的分析方式，準確的定量FW和SW排放 NH4+的量。將FW馴養的仔魚，取20隻放入裝有500 λ FW的離心管中靜置2.5小時後，取水體300 λ保存，進行Ammonia Assay Kit的實驗分析，並將仔魚秤重量化結果。取水體100 λ，先添加1ml Ammonia Assay 19.

(21) Reagent (即α-ketoglutaric acid, NADPH, buffers混合溶液)作用5分鐘，再加入10 ml L-Glutamate Dehydrogenase solution(GDH)室溫均勻混合後，5分鐘內利用分光光度計於340 nm光譜下觀察吸收值，其吸收值與NH4+濃度成正比；SW組亦同方法。分析組數為4組，共80隻仔魚。此實驗試比較FW和SW馴養的青鱂魚仔魚，其排放NH4+濃度之差異。. 實驗二：鹽度和高氨馴養的青鱂魚仔魚，對其體表和細胞累積的 H+ 濃度之影響利用 SIET 測量馴養 FW、SW、HA-SW (2.5、5 mM NH4+)的仔魚，在體表和細胞所累積 H+的濃度。此實驗利用高氨馴養，試圖了解其 NH4+排放會造成體表和細胞累積 H+濃度未知的影響。. 實驗三：NHE 抑制劑(EIPA)處理 SW 馴養的青鱂魚仔魚，其(一)對體表和細胞累積的 H+濃度之影響；其(二)對排放 NH4+濃度之影響利用 SIET 測量處理不同濃度的 EIPA(100、200、500、1000 µM)，在體表所累積 H+的濃度；使用有效濃度 500 µM 浸泡 1.5 小時後，測量在細胞所累積 H+濃度之影響。利用 Ammonia Assay Kit 的分析方式，測量 SW 組處理 EIPA(100、200 µM)後，其排放 NH4+的濃度。將 SW 馴養的仔魚，取 20.

(22) 20 隻放入裝加有 EIPA 各濃度 500 λ SW 的離心管中靜置 2.5 小時後，取水體 300 λ 進行 Ammonia Assay Kit 的實驗分析，並將仔魚秤重量化結果。分析組數為 4 組，共 80 隻仔魚。此實驗利用 EIPA 抑制 NHE，試圖了解抑制後，對 H+累積與排放 NH4+之間的影響。. 實驗四：利用外在環境鹽度改變的方式，進而降低 NHE 的驅動力，對其體表的 H+和 NH4+濃度之影響利用 SIET 測量 SW 組轉移 FW，0、0.5、1、2 小時後，在各時間點其體表 H+和 NH4+累積的變化情形。將 SW 組仔魚麻醉後，轉移至 FW 測量水體下，進行瞬間轉移(0 小時)的測量，測量完後將仔魚移置正常的 FW 中，等待下個測量時間點，以排除長時間麻醉的影響，0.5、1、2 小時測量方式亦同。 HA-SW 組、SW 組仔魚麻醉後，轉移至 FW 測量水體下，利用 SIET 進行瞬間轉移的細胞測量。相同方式處理後，SIET 進行 20 分鐘的細胞測量。此實驗試圖了解海水魚排氨的細胞類型(MRC 或 PVC)。. 實驗五：馴養 FW 酸性環境(pH5)的青鱂魚仔魚，對其體表和細胞累積的 H+、NH4+和 Na+濃度之影響馴養 FW5 的仔魚，將其麻醉後，置於 FW7 水體下測量，使其促 21.

(23) 進酸排放，利用 SIET 測量在體表和細胞所累積 H+、NH4+和 Na+的濃度。細胞(MRCs 和 KCs)主要選擇在卵黃囊和軀幹兩區域，試比較兩區域功能性的差異。此實驗利用酸性處理，預期誘導增加 H+的排放，試圖了解欲大量排酸對於排放 NH4+、Na+吸收之間的影響。. SIET 的測量水體：鹽度影響實驗測量體表和細胞NH4+濃度. 測量體表和細胞H+濃度. 馴養 FW(pH8). FW (pH8). FW (pH8)水體. SW(pH8). K+ free水體. SW (pH8)水體 HA-SW(pH8). 酸中毒影響實驗測量體表和細胞 NH4+濃度. 測量體表和細胞 H+、Na+濃度馴養. FW (pH7) K+ free 水體. FW(pH5) FW (pH7)水體 FW(pH7). 22.

(24) 實驗結果. 實驗一、青鱂魚仔魚馴養 FW 和 SW 環境，其個體每單位體重(g)，每小時(hr)，其 NH4+排放量的差異利用 Ammonia Assay Kit 檢測，馴養 FW、SW 和 HA-SW 的 7-dpf 仔魚，其 NH4+排放量的差異。結果顯示 HA-SW 組的排氨量(14.69 µmol g-1 h-1)顯著高於其他兩組；並且 SW 組的排氨量(8.29 µmol g-1 h-1) 顯著高於 FW 組(0.73 µmol g-1 h-1)11.3 倍(圖 1)。. 實驗二、青鱂魚仔魚馴養 FW、SW 和 HA-SW，其卵黃囊體表和細胞所累積的 H+濃度之差異圖 2A 為測量青鱂魚仔魚體表(skin)和細胞(mitochondria-rich cells，MRCs；keratinocytes，KCs)離子累積濃度的位置。結果顯示 SW 組的 ∆[H+]顯著高於其他三組，∆[H+]比 FW 高 2.5 倍；然而 HA-SW 組的 ∆[H+]皆顯著低於 FW、SW 組，並且 5 mM NH4+處理組，其 H+ 體表累積濃度比背景值低(呈現鹼性)(圖 2B)。利用 SIET 測量 SW 和 HA-SW 組的 MRCs 頂膜開口處和鄰近 KCs 的 H+累積濃度，SW 組 MRCs 的 ∆[H+]顯著高於鄰近 KCs 約 3 倍；HA-SW 組(5 mM NH4+)MRCs 的 ∆[H+]顯著高於鄰近 KCs，且 KCs 呈現負值。兩個馴養組 MRCs 的 H+累積濃度比較，HA-SW 顯著低於 SW；KCs 亦同(圖 23.

(25) 2C)。. 實驗三、EIPA 處理對於 SW 馴養的青鱂魚仔魚，其(一)其卵黃囊體表和細胞所累積 H+濃度之影響；其(二)NH4+排放速率之影響仔魚使用不同濃度的抑制劑 EIPA(100、200、500、1000 µM)浸泡 30 分鐘後，測試 NHE 對於海水魚排 H+的貢獻度。處理 EIPA 濃度 100 和 200 µM 組，∆[H+]與海水控制組並無顯著差異；而處理 500 和 1000 µM 組，與控制組比較，∆[H+]顯著的降低，分別降低 38.1%和 52.8%(圖 3A)。使用 500 µM 的 EIPA 浸泡 1.5 小時處理後，與控制組比較，其 MRCs 的 ∆[H+]顯著的下降約 94.5%；而 KCs 則無顯著差異 (圖 3B)。利用 Ammonia Assay Kit 檢測，處理不同 EIPA 濃度(100 和 200 µM)，其 NH4+排放量的差異。結果顯示 NH4+的排放量 (µmol g-1 h-1)， SW 組顯著高於 EIPA 處理組，並隨著處理 EIPA 濃度增加，而降低 NH4+的排放量(圖 4)。. 實驗四、外在環境鹽度改變對仔魚其(一)卵黃囊體表累積 H+和 NH4+ 濃度之影響；其(二)細胞所累積的 NH4+濃度之影響轉移組(SWFW)與 SW 組比較，海水轉移至淡水 0、0.5、1、2 小時後，在各時間點皆顯著降低 ∆[H+](圖 5A)。在瞬間轉移(0 小時) 24.

(26) 後，∆[H+]顯著比 SW 組低；轉移 0.5 小時，∆[H+]顯著比 FW 組低約 1.3 倍；轉移 1 小時，與淡水組無顯著差異；轉移至 2 小時，∆[H+] 顯著比淡水組高約 1.3 倍(圖 5A)。轉移組的 NH4+排放量在各時間點皆顯著低於 FW 組(圖 5B)。海水轉移至淡水 0.5、1 小時後，與 0 小時比較，NH4+和 H+排放量顯著下降；直到 2 小時後，NH4+和 H+排放量顯著高於轉移瞬間(0 小時) (圖 5B)。 FW、SW 和 HA-SW 組在轉移至 FW 下測量三組的細胞所累積 NH4+濃度，SW 組 MRCs 的 NH4+排放量顯著高於鄰近 KCs 約 6 倍； HA-SW 組 MRCs 的 NH4+排放量顯著高於鄰近 KCs 約 2.2 倍；FW 組 MRCs 的 NH4+排放量顯著高於鄰近 KCs 約 2.2 倍。三個馴養組 MRCs 的 NH4+排放量比較，HA-SW 組和 FW 組無顯著差異，而 SW 組顯著低於其他兩組；KCs 的 NH4+排放量也呈現相同結果(圖 6)。. 實驗五、馴養 FW 酸性環境(pH5)的青鱂魚仔魚，在 pH7 環境下測量對其卵黃囊體表和細胞所累積的 H+、NH4+、Na+濃度之影響，並加以比較不同區域(卵黃囊、軀幹)細胞的累積程度馴養 FW5 後，在 FW7 水體下測量。FW7 組，其 ∆[H+]顯著高於淡水 pH5 組約 1.7 倍(圖 7A)；FW7 組，其 NH4+排放量顯著低於 FW5 組約 1.6 倍(圖 7B)；而 ∆[Na+]，兩組間無顯著差異，皆為排放(圖 7C)。. 25.

(27) 測量兩組的細胞累積程度，兩組 MRCs 的 ∆[H+]皆顯著高於 KCs；FW5 組 MRCs 的 ∆[H+]與 FW7 組無顯著差異，KCs 亦同(圖 8A)。兩組 MRCs 的 NH4+排放量皆顯著高於 KCs；FW5 組的 MRCs，其 NH4+ 排放量顯著高於 FW7 組的 MRCs 約 2.6 倍，兩組 KCs 無顯著差異(圖 8B)。兩組的 MRCs 皆呈現 Na+吸收(∆[Na+]為負值)，FW5 組的 MRCs，其 Na+吸收量顯著高於 pH7 組的 MRCs 約 3.5 倍；而 KCs 皆為排放 Na+(正值)，其淡水 pH5 組顯著高於 pH7 組約 4 倍(圖 8C)。 FW5 組軀幹的 MRCs，其 ∆[H+]顯著高於軀幹的 KCs；但卵黃囊區的 MRCs 與 KCs 無顯著差異(皆為負值，鹼性)。FW5 組卵黃囊區的 MRCs，其 ∆[H+]顯著低於軀幹的 MRCs，並呈現負值(鹼性)，KCs 亦同(圖 9A)。卵黃囊區和軀幹的 MRCs，其 NH4+排放量顯著高於該區的 KCs；卵黃囊區的 MRCs，其 NH4+排放量顯著高於軀幹的 MRCs 約 1.6 倍，兩區域的 KCs 無顯著差異(圖 9C)。軀幹和卵黃囊區 MRCs 的 Na+檢測皆為負值(Na+吸收)，而 KCs 皆為 Na+排放。卵黃囊區的 MRCs，其 Na+吸收顯著高於軀幹的 MRCs 約 2.8 倍；卵黃囊區的 KCs，其 Na+排放顯著高於軀幹的 KCs 約 1.7 倍(圖 9E)。 FW7 組軀幹和卵黃囊區的 MRCs，其 ∆[H+]顯著高於該區的 KCs；兩區域的 MRCs，其 ∆[H+]無顯著差異(圖 9B)。卵黃囊區和軀幹的 MRCs，其 NH4+排放量顯著高於該區的 KCs；卵黃囊區的 MRCs，. 26.

(28) 其 NH4+排放量顯著高於軀幹的 MRCs 約 1.5 倍，KCs 亦同約 1.9 倍(圖 9D)。軀幹和卵黃囊區的 MRCs 皆為 Na+吸收，而 KCs 皆為 Na+排放。卵黃囊區的 MRCs，其 Na+吸收顯著高於軀幹的 MRCs 約 4.8 倍；兩區域的 KCs 無顯著差異(圖 9F)。. 27.

(29) 討論本實驗利用非侵入性的 SIET 證明以下兩假說：其(一)海水魚有著與淡水魚類似的排氨機制，此機制在淡水青鱂魚實驗被證明，利用 NH4+在細胞內脫 H+後，經由 Rh 蛋白運送 NH3，而 NHE 將 H+排出，在體表酸累積的微環境進行酸捕捉，進而將 NH4+排除體外(Wu et al., 2010)；且海水魚排氨量高於淡水魚。其(二)魚體酸中毒會增強排氨機制，利用排氨促進排酸的方式，誘導 NHE 增加酸的排放，伴隨 Na+ 吸收的回饋作用，促使大量 NH3 排放與 H+結合，以達到大量酸排放之目的。. 一、海水魚和淡水魚的排氨效率：海水魚的排氨量顯著高於淡水魚(圖1)，因海水魚可能必須抵抗外在較高滲透壓的環境，以維持體內離子的平衡，所以其能量代謝較高，以至有較多的含氮廢物(氨、尿素)和代謝酸廢物(CO2)產生需排出。前人研究指出，許多魚種當面臨不同的鹽度適應時，會改變其氧氣的消耗(Sardella et al., 2004; Gracia-Lopez et al., 2006)，可能與碳水化合物代謝作用有關(Morgan and Iwama, 1991; Sardella et al., 2004; Gracia-Lopez et al., 2006)，而能量20~68%的消耗是為了執行滲透壓調節(Boeuf and Payan, 2001)，所以海水環境需要比淡水環境消耗更多的. 28.

(30) 能量來調節鰓上的離子運輸蛋白排除過多的離子，以至於有較高的氨排放量。前人利用廣鹽性大肚魚(Gambusia affinis)成魚，將其馴養淡水和35‰的海水中，發現鹽度馴養造成排氨量增加50%和排尿素量顯著增加(Uliano et al., 2010)，與本篇實驗有類似的結果。. 二、CO2貢獻體表H+濃度的累積然而測量海水魚體表仍然有較高的H+累積，並無法觀察到NH3 排放與H+結合(酸捕捉)後導致H+累積降低的結果(圖2B)，推測其(一) 可能因海水魚排氨較高，進而促進排更多的H+以助於排氨進行酸捕捉，彼此互為因果關係；推測其(二)可能為海水魚能量大量代謝後產生大量的CO2經由體表擴散，水合後導致貢獻體表大量的H+累積。 Wright等人(1995)認為魚鰓表皮所排出的酸，主要是藉由鰓表皮氣體交換所排放的二氧化碳水合後所產生出的。前人研究發現斑馬魚體表上的富含H+幫浦細胞(HRCs)，有CA15 (carbonic anhydrase 15a)表現在細胞頂膜上，被認為具有催化CO2水合產生H+和HCO3-，進而調節酸鹼的能力(Lin et al., 2008)。. 三、海水魚細胞H+累積的檢測海水魚的細胞(MRC與KC)檢測，證明MRC具有顯著的排酸和排氨功能，指出兩種離子調節功能皆在MRC上執行(圖2C, 6)，並發現 29.

(31) NHE在MRC上扮演執行排酸功能的角色(圖3B)。前人利用定量PCR，證明海水馴養的青鱂魚具有NHE2和NHE3表現，再利用原位雜交技術證明NHE表現在離子細胞上(未發表的資料)。而前人的斑馬魚仔魚實驗中證明，其富含H+幫浦細胞(HRCs，為一型MRC)上有著大量的排酸和排氨的功能共同存在(Lin et al., 2006; Shih et al., 2008)。在淡水青鱂魚仔魚實驗中，發現體表有排酸(MRC+)和排鹼(MRC-)兩型(Wu et al., 2010)，但在本實驗中海水(或高氨海水)青鱂魚仔魚並無發現具有排鹼型(MRC-)，換言之皆為排酸型(MRC+)，推論可能為海水中Na+ 濃度較高，進而加強NHE驅動力，增加排H+的排放(圖2C)。然而擴散的CO2可能也貢獻部分體表H+的累積。. 四、海水魚的酸捕捉(acid trapping)機制利用高氨海水馴養誘導增加 NH4+的排放(圖 1)，而減少體表和細胞累積 H+的濃度，造成鹼化的結果(圖 2B, C)。高氨海水馴養轉雖移至淡水，但仍然可以觀察排 NH4+的功能存在於 MRC，所以從圖 2C, 6 證明海水魚的酸捕捉機制發生於 MRC 上。在前人斑馬魚實驗中證明，此 NH4+/NH3 的排放是經由酸捕捉機制(Shih et al., 2008)，所以當海水魚大量的排氨，會以 NH3 形式排放，造成體表累積的 H+大量的被結合，導致體表鹼化(圖 2B)。本實驗結果與 50% SW 馴養的海水. 30.

(32) 彈塗魚、淡水 medaka 研究結果一致，使用高氨淡水馴養會大量增加氨的排放，而導致 H+排放量降低或造成體表鹼化的結果(Ip et al., 2003; Randall et al., 1999; Wu et al., 2010)。根據上述，氨的排放與體表和細胞累積 H+的程度息息相關。在前言裡所介紹的排 H+機制中，氫幫浦蛋白(H+-ATPase)和 NHE 扮演重要的角色。前人利用原位雜交技術和定量 PCR 發現海水馴養 madaka 的 H+幫浦蛋白表現量非常低(未發表資料)，其他海水馴養的魚種例如 rainbow trout 和 coho salmon 的研究也有相同的結果(Lin and Randall, 1990; Wilson et al., 2002)，前人認為海水環境提供較大的 Na+離子濃度梯度，給予 NHE 強大的驅動力，所以大量表現 NHE 有利於進行排酸功能，證明 NHE 對於海水魚排酸的重要性(Lin and Randall, 1993; Lin et al., 1994;)。前人利用定量 PCR，證明海水 pufferfish 鰓上有 NHE2、NHE3 和 Rhcg1 的表現，分子證據指出具有 NHE 與 Rh 協同作用的排氨機制存在(Nawata et al., 2010)，而本篇實驗驗證酸捕捉機制存在於海水魚，執行著排氨的生理功能。. 五、利用 EIPA(NHE 抑制劑)處理，檢測 NHE 對於海水魚排氨機制的重要性海水仔魚處理 EIPA 後，會降低其 H+和 NH4+的排放(圖 3, 4)。本實驗處理 500 µM EIPA，造成 MRC 的 H+累積顯著下降(圖 3B)，意味 31.

(33) 著 NHE 位於 MRC 上扮演排酸的角色。Catches 等人(2006)利用海水 sculpin，進行免疫螢光染色，發現 NHE2 表現在 MRC 上執行排酸功能。本實驗與前人利用海水 sculpin 處理 EIPA 的結果一致，處理後導致其魚體降低排 H+(Claiborne et al., 1997)。使用 EIPA 抑制 NHE，伴隨著 NH4+排放降低，意味著 NHE 被抑制無法將 H+排出，導致體表微環境的酸累積降低，進而降低酸捕捉的驅動力，最後使得 NH4+無法排除體外，導致排氨效率降低(圖 4)。. 六、利用鹽度轉移(降低 NHE 驅動力)檢測 NHE 對於海水魚排氨機制的重要性鹽度轉移處理(海水轉移至淡水)抑制 NHE 驅動力，使得 H+和 NH4+的排放降低(圖 5)。前人利用海水 sculpin 進行鹽度轉移，轉移鹽度越低，其 H+排放量也隨之降低(Claiborne et al., 1997)。本實驗轉移 0.5 小時後，其 H+排放顯著下降並伴隨著 NH4+的排放降低，指出 NHE 被抑制後，排 H+降低導致酸捕捉機制降低的結果，之後隨時間的增加，H+和 NH4+也提升排放，兩種離子彼此互為因果關係，而回饋增加排放為魚體短期適應的結果(圖 5)。在之前的 Ammonia Assay Kit 測試的實驗中已經發現其海水組排 NH4+顯著高於淡水組(圖 1)，所以其實在鹽度轉移的瞬間(0 小時)，其 NH4+即立刻抑制排放(排放低於淡水組)(圖 5B)。顯示出降低水體中 Na+濃度，會導致 NHE 的驅動力降 32.

(34) 低，與抑制劑有著相同的結果，意味著 NHE 對於海水魚排 H+和排 NH4+上扮演重要的角色。 Nawata 等人(2010)使用高氨海水 pufferfish，發現鰓上的 Rhcg1、 H+-ATPase、NHE3 mRNA 表現增加；而海水高氨馴養的青鱂魚，進行定量 PCR 實驗發現 Rhcg1、Rhcg2 和 NHE3 mRNA 表現顯著增加(未發表資料)，這些運輸蛋白被認為在排氨機制上扮演重要的角色。本實驗結果認為海水青鱂魚與淡水青鱂魚已確立的排氨機制模式(Wu et al., 2010)類似，NH4+在細胞內先行解離成 NH3 和 H+，H+藉由 NHE 作用排出累積於體表上，並伴隨 Na+吸收，而 NH3 經由 Rh 蛋白運送出細胞外後，會與體表酸累積的微環境(acid layer)進行酸捕捉，結合成 NH4+，促使體表 NH3 濃度降低，進而提供細胞內 NH4+解離的驅動力，如此循環完成排氨之目的。. 七、魚體代謝性酸中毒對於排氨機制的影響馴養淡水酸性環境(pH5)的青鱂魚仔魚，因酸性環境造成體內代謝性酸中毒，誘導大量 H+排放，置於正常水體(pH7)下測量，其體表 H+累積反而比 pH7 組低，而 NH4+排放比 pH7 組高，Na+皆為排放(圖 7)。本實驗與斑馬魚有著不同的結果，斑馬魚仔魚馴養 pH4 的淡水，其體表 H+累積顯著高於 pH7 組(Horng et al., 2009)。然而青鱂魚與斑馬魚仔魚的排氨量比較，其青鱂魚排氨量較高，進行較旺盛的酸捕捉 33.

(35) 機制可能為造成體表 H+累積較低的因素，這意味著青鱂魚仔魚酸處理會利用促進較多氨排放，帶動 H+的排放，彼此互為因果關係。Wu 等人(2010)將淡水青鱂魚轉移至 pH6 的測量水體下，發現排氨量增加，意味著體表環境的酸化有助於氣態氨的排放，並利用排氨帶動酸的排放，進行酸捕捉進而將氨排除，與本篇誘導酸排放有著相同的結果。細胞的檢測發現，進行 H+、NH4+排放和 Na+吸收的位置為 MRC，而 KC 則具有部分擴散 NH4+、Na+的情形發生(圖 8)。給予魚體代謝性酸中毒，會增加 NH4+排放的方式誘導大量 H+排放，細胞表面進行酸捕捉造成 H+累積降低，導致與 pH7 組無差異，意味著利用增強排氨機制促進大量 H+排放的結果(圖 8A, B)。而 MRC 上的 NHE 將大量 H+排出的同時，伴隨著大量的 Na+吸收，所以酸處理也進而增加 Na+ 的吸收，並且 KC 也增加 Na+的擴散量，以維持體內 Na+離子恆定(圖 8C)。. 八、不同區域的細胞，其排氨機制能力的差異經由以上結果，可得知 MRC 為主要進行排氨機制的位置。本實驗利用細胞的檢測發現，卵黃囊上 MRC 的 H+累積顯著低於軀幹上的 MRC(雖淡水 pH7 組無達到顯著差異，但也稍低)，而 NH4+排放顯著高於軀幹上的 MRC；而卵黃囊上 MRC 的 Na+吸收也顯著比軀幹上. 34.

(36) 高，以上結果意味著卵黃囊上 MRC 的排氨機制較為旺盛(圖 9)。而 pH5 組其卵黃囊的 MRC 為鹼性(H+累積為負值)，意味著促進大量 NH3 排出，在體表酸累積的微環境進行酸捕捉，導致細胞表面鹼性的結果；而卵黃囊上的 KC 呈鹼性，推測為 MRC 大量排的 NH3 擴散過去酸捕捉所導致的結果，或為 KC 本身擴散少量氨的影響(圖 9A)。而軀幹因排氨機制較卵黃囊上不旺盛，以致於 MRC 的 H+累積較高，而排 NH4+、Na+吸收較低(圖 9)。綜合以上結果，推測因卵黃囊上代謝較快，導致含氮廢物濃度(氨、尿素)較高，直接由血液端運送至卵黃囊的離子細胞內，再經由頂膜上的運輸蛋白執行排氨機制，將之排除體外。. 結語綜合以上實驗結果，本論文之推論包括： (1) 海水青鱂魚排酸和排氨調節功能皆在 MRC 上執行，並且有著與淡水魚類似的排氨機制。利用 NH4+在細胞內脫 H+後，經由 Rh 蛋白運送 NH3，伴隨 NHE 將 H+排出，NH3 在體表微環境進行酸捕捉，進而將 NH4+排除體外。因此 NHE 在海水青鱂魚排氨機制上扮演重要的角色。 (2) 當青鱂魚面臨代謝性酸中毒會增強排氨機制，以排氨的型式帶動酸的排放，造成 NHE 增加 H+排放、Na+吸收的回饋作用，增強體. 35.

(37) 表 H+微環境的驅動力，促進大量 NH3 排放與 H+結合。 (3) 卵黃囊上的排氨機制較軀幹旺盛。因卵黃囊上代謝較快，導致含氮廢物濃度(氨、尿素)較高，直接由血液端運送至卵黃囊的離子細胞內，再經由頂膜上的運輸蛋白執行排氨機制，將之排除體外。. 36.

(38) 參考文獻 Avella, M., and Bornancin, M. (1989). A new analysis of ammonia and sodium transport through the gills of the freshwater rainbow trout (Salmo gairdneri). J Exp Bio. 142, 155-175. Boeuf, G. and Payan, P. (2001) How should salinity influence fish growth? Comp. iochem. Physiol. C 130, 411–423 Braun, M. H., Steele S. L., Ekker, M. and Perry, S. F. (2009). Nitrogen excretion in developing zebrafish (Danio rerio): a role for Rh proteins and urea transporters. Am J Physiol Renal Physiol 296, F994–F1005 Choe, K. P., Kato, A., Hirose, S., Consuelo Plata, Sindic, A., Romero, M. F., Claiborne, J. B. and Evans, D. H. (2005). NHE3 in an ancestral vertebrate: primary sequence, distribution, localization, and function in gills. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 289, R1520-R1534. Claiborne, J. B., Perry, E., Bellows, S. and Campbell, J. (1997). Mechanisms of acid-base excretion across the gills of a marine fish. J Exp Zool. 279, 509–520. Catches, J. S., Burns, J. M., Edwards, S. L. and Claiborne, J. B. (2006). Na+/H+ antiporter, V-H+-ATPase and Na+/K+-ATPase immunolocalization in a marine teleost (Myoxocephalus octodecemspinosus). J Exp Biol 209, 3440-3447. Claiborne, J. B., Blackston, C. R., Choe, K. P., Dawson, D. C., Harris, S. P., Mackenzie, L. A. and Morrison-Shetlar, A. I. (1999). A mechanism for branchial acid excretion in marine fish:identification 37.

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(45) Rate of ammonia excretion (μ μmol g-1 h-1). 18. c. 16 14 12 10. b. 8 6 4 2. a. 0 FW. SW. HA-SW. 圖 1. 馴養於淡水(FW)、海水(SW)和高氨海水(HA-SW, 5 mM NH4+) 的青鱂仔魚，pH 控制為 8，個體每單位體重(g)，每小時(h)，NH4+排放量的比較，數值為 mean ± S.E. (N=4，1 組 20 隻仔魚)。abc 利用 One-way ANOVA 測驗及 Tukey’s 比較試驗的結果，不同字母顯示不同處理組間具顯著差異(p < 0.05)。. 44.

(46) A body yolk. skin. B. 0.12. b. Skin Δ[H+] (μ μM). 0.10 0.08 0.06. a. 0.04 0.02. c. 0.00 -0.02. d. -0.04 FW. C. HA-SW HA-SW (2.5 mM) (5 mM). a (40). MRC KC. 5 4. +. Cellular Δ [H ] (nM). 6. SW. 3 2. b (55). 1. b (25). 0 -1. (31) c SW. HA-SW. SW. HA-SW. 圖2. (A)測量仔魚的位置，整體值測量腹面卵黃囊體表(skin)，細胞值測量卵黃囊區(yolk)和軀幹(body)上的MRC和KC。(B)海水(SW)和高氨海水(HA-SW)處理，對卵黃囊表面累積H+濃度之影響，mean ± S.E. (n=12)，(C)對細胞(MRCs, KCs)所累積的H+濃度之影響。abcd利用 One-way ANOVA測驗及Tukey’s比較試驗的結果，不同字母顯示具顯著差異(p < 0.05)。 45.

(47) A. 0.04. μM) Skin Δ[H+] (μ. a. a. 0.03. ab b. 0.02. bc. 0.01. 0.00 control 100. 200. 1000. EIPA (μ μM). B 7 Cellular Δ [H+] (nM). 500. a (30). MRC KC. 6 5 4 3 2 b (30). 1. b (30). b (30). 0 control. control. 圖 3. SW 組處理 EIPA(NHE 抑制劑)，(A)處理不同濃度(100~1000 µM) 浸泡 30 分鐘，測試 NHE 對於海水魚排 H+的貢獻度，數值為 mean ± S.E. (n=12)。(B)500 µM EIPA 處理 1.5 小時，對細胞所累積的 H+濃度之影響。abc 利用 One-way ANOVA 測驗及 Tukey’s 比較試驗的結果，不同字母顯示具顯著差異(p < 0.05)。. 46.

(48) Rate of ammonia excretion (μ μmol g-1 h-1). 10 a 8 6 4 2. b c. 0 control. 100. 200 EIPA (μ μM). 圖 4. 馴養海水(SW)組的青鱂仔魚，處理 EIPA(100、200 µM)，個體每單位體重(g)，每小時(h)，NH4+排放量的比較，數值為 mean ± S.E. (N=4，1 組有 20 隻仔魚)，abc 利用 One-way ANOVA 測驗及 Tukey’s 比較試驗的結果，不同字母顯示不同處理組具顯著差異 (p < 0.05)。. 47.

(49) Skin Δ[H+] (μ μM). A. 0.10 a. 0.09 a. 0.08 0.07. a. a. SW SW to FW FW. b. 0.06. b*. 0.05 0.04. c. c. b* c. 0.03. b. b*. 0.02 0. 0.5. 1.0. 1.5. 2.0. Time post transfer (h). Skin Δ[NH4+] (μ μM). B. 80 70 60. #. # #. #. 50. *. 40 30 20. *. *. 0.5. 1.0. FW SW to FW. 10 0. 1.5. 2.0. Time post transfer (h). 圖 5. 外在鹽度改變對仔魚體表 (A)H+和(B)NH4+累積濃度之影響。分別為 SW 轉移 FW 組、SW 組、FW 組，在 0、0.5、1、2 小時測量離子累積情形，數值為 mean ± S.E. (n=6)，*表示該時間點與同組 0 小時具有顯著差異(Student’s t-test, p < 0.05)。abc 利用 One-way ANOVA 測驗及 Tukey’s 比較試驗的結果，不同字母顯示同一個時間點，不同組別具顯著差異(p < 0.05)。#顯示同一個時間點，不同組別具顯著差異 (Student’s t-test, p < 0.05)。. 48.

(50) +. Cellular Δ[NH4 ] (μ μM). 12 b (21). 10. MRC KC. b (25). 8 d (21). 6 4 2 0. d (25). a (20) c (20) SW HA-SW FW. SW HA-SW FW. 圖 6. 馴養 FW、SW 和 HA-SW 組轉移至淡水後的青鱂仔魚，細胞 (MRCs 和 KCs)所累積的 NH4+濃度。abcd 利用 One-way ANOVA 測驗及 Tukey’s 比較試驗的結果，不同字母顯示具顯著差異(p < 0.05)。. 49.

(51) Skin Δ[H+] (μ μM). A. 0.18 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0. *. pH5. pH7. Skin Δ[NH4+] (μ μM). B. Skin Δ[Na+] (μ μM). C. 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0. *. pH5. pH7. pH5. pH7. 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0. 圖 7. 馴養 FW 酸性環境(pH5)的青鱂魚仔魚，在 pH7 環境下測量卵黃囊體表所累積的(A)H+、(B)NH4+排放和(C)Na+濃度之影響，數值為 mean ± S.E. (n=10)。*表示不同處理組具顯著差異 (Student’s t-test, p < 0.05)。 50.

(52) +. cellular Δ[H ] (nM). 2.5. a (38). 2.0. MRC KC a (27). 1.5 1.0 0.5. b (38). b (27). pH5. pH7. 0.0 pH5. μM) cellular Δ[NH4+] (μ. B 12. a (38). MRC KC. 10 8 6. b (11). 4. pH5. pH7. 20. +. cellular Δ[Na ] (μM). c (38). 2 0. C. pH7. pH5 c (26). 10. c (11) pH7. d (36). 0 -10. (36) b. -20. MRC KC. -30 (26) a -40. pH5. pH7. pH5. pH7. 圖 8. 馴養 FW 酸性環境(pH5)的青鱂魚仔魚，細胞(MRCs 和 KCs) (A) 所累積 H+的濃度、(B)NH4+的排放和(C)Na+吸收之影響。abcd 利用 One-way ANOVA 測驗及 Tukey’s 比較試驗的結果，不同字母顯示具顯著差異 (p < 0.05)。 51.

(53) pH5. pH7. A. B b (23). cellular Δ [H+] (nM). 4. MRC KC. 3 2. c (23). 1 0 -1. (14)a. (14)a. 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0. yolk body yolk body. cellular Δ [NH4+] (μM). b b (11) (11). D 16 14 12 10 8 6 4 2 0. a (18) b. a (18). MRC KC b * (12). 4. bc (18). 3 c c (18) (20). 2. yolk body yolk body. 0. c (13). 10. c (12). 1 yolk body yolk body. F 10 c (12). c (15). 5. d (18). 0. 0 -10. -5. -20. (12) b. -30. (18) b. -10 MRC KC. -40 -60. 5. (20). 20. -50. 6. MRC KC. E. +. MRC KC. a (11). yolk body yolk body. C. cellular Δ [Na ] (μM). a (16). -15. (13)a -20 yolk body yolk body. MRC KC (15)a yolk body yolk body. 圖 9. 馴養 FW 酸性環境(pH5)和正常環境(pH7)的青鱂魚仔魚，在卵黃囊和軀幹區域，MRCs 和 KCs (A)(B)所累積 H+的濃度、(C)(D)NH4+ 的排放和(E)(F)Na+吸收之差異。abcd 利用 One-way ANOVA 測驗及 Tukey’s 比較試驗的結果，不同字母顯示具顯著差異 (p < 0.05)。. 52.

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