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細胞核酸純化,重組DNA,PCR

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Academic year: 2021

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(1)2012/2/3. 教育部高中生物科學資優生培育計畫-高雄區 DNA萃取純化與電泳分析 重組DNA技術與基因選殖 聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR) DNA定序(DNA sequencing) 基因定點突變 (Site-directed mutagenesis)技術 DNA交互配對(雜交)反應(DNA hybridization). 授課教師:楊文仁 任職單位:高雄大學生物科技研究所 1. 細菌質體DNA DNA可分為兩大類:(1)質體 (plasmid) DNA;(2)染色體(chromosomal) DNA, 質體通常存在細菌內。 質體是細菌染色體以外的遺傳物質,由雙股環狀DNA組成。細菌所帶質體的 大小及數目不定,通常只有數千個鹽基對(bp)。 質體DNA具有自行複製的能力,可以在細菌間互相轉移,而將外來的基因轉 移到其他宿主細胞中表現。 在生物技術的應用方面,質體DNA常被用來做為載體 (vector) 以選殖特定的 DNA以及表現特定的蛋白質之用。因此,質體DNA的製備是分子生物學的一 項基本且重要的技術。 質體DNA製備的原理及步驟 1. 培養並收穫細菌。 2. 破壞細菌的細胞壁與外膜。 3. 破壞細胞膜使細菌裂解。 4. 移除染色體DNA。 5. 移除蛋白質與RNA。 6. 純化質體DNA。. 2. 1.

(2) 2012/2/3. 細菌質體DNA萃取 萃取質體DNA的方法很多,最常用的 是鹼性溶解法(alkaline lysis) 及煮沸法 (boiling method) 。. 提高滲透壓使細胞裂解. 鹼性溶解法(alkaline lysis) 原理是利用鹼處理質體DNA和染色 體DNA,使兩者雙股打開呈單股狀 態,再加入酸中和鹼使得單股DNA 回復成為雙股DNA。 細菌以NaOH及SDS分解,並使蛋 白質及DNA變性,再以酸中和。 質體DNA分子在中和後恢復原態, 但細菌染色體DNA則無法完全復原 而與SDS-K+ 形成複合物,可用離 心沉澱加以去除。 上清液中所含的質體則可以酒精或 異丙醇將其沉澱。 sodium dodecyl sulfate (SDS;十二烷基硫酸鈉). http://bioinfo2010.wordpress.com/ 3. 煮沸法(boiling method)製備質體DNA :(原生質)球狀體,原生質球幾乎 或完全去掉了細胞壁的細菌細胞. Plasmid. boiling. Plasmid. 4. 2.

(3) 2012/2/3. http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/. 5. 萃取的質體,以不同限制酵素作用,經 電泳分離DNA片段後,比較各DNA片段 之分子量大小,用以檢測所分離的質體 DNA之正確性。 洋菜膠電泳是把 agarose 加熱溶解後再 冷凝,洋菜膠會以氫鍵形成凝膠。而經 限制酶切過的 DNA 片段,在電場影響 下會在凝膠中移動,帶負電荷的 DNA 分子會向正極方向移動。. 大片段. 小片段. 移動速度依分子大小而定,分子愈大移 動性愈慢。而凝膠中 agarose 的濃度決 定了空隙的大小,特定大小的 DNA 片 段在不同濃度的膠中移動速率均不同, 故每次電泳均需以 DNA marker 做為比 較。 核酸在膠體中可經溴化乙錠 ethidium bromide (EtBr) 染色, EtBr 會嵌入核 酸鹼基中,以紫外線照射,則核酸吸收 紫外線波長的光線,再經 EtBr 放出可 見波長的光線,藉以觀察核酸的位置。. http://www.molecularstation.com/agarose-gel-electrophoresis/. 3.

(4) 2012/2/3. http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/ DNA電泳影片: http://www.youtube.com/watch?v=SJIpQ78O-Ts&feature=related. M. 1. 2. 3. 7. 4 Circular form. Linear form. Coiled form. Supercoiled form. 二○一○年國際生物奧林匹亞競賽 國手選拔初賽 Q:下列那種處理最不會影響DNA片段在電泳膠體內之泳動速率? (A) 將DNA片段上所帶的負電加以中和 (B) 增加DNA片段的長度 (C) 將DNA片段的序列改變 (D) 將DNA片段上的胞嘧啶加以甲基化 (E) 將DNA片段縮短. 解答:. 8. 4.

(5) 2012/2/3. 重組DNA技術(Recombinant DNA technology) = 基因工程;遺傳工程(Genetic engineering) Key element of biotechnoloy:use recombinant DNA methods to move a gene from any organism to any other organism.. 9. 重組DNA之建構. 製備重組DNA分子的兩種重要酵素: 1.限制內切酶:就像一把剪刀在特定 專一位置上剪切DNA分子 2.DNA接合酶:就像膠水般能將二段 DNA接合在一起. 10. 5.

(6) 2012/2/3. Restriction enzymes split DNA into specific fragments  Restriction enzymes (restriction endonucleases, RE): recognize specific base sequences in double strand DNA and cleave, at specific places, both strands of a duplex containing the recognized sequences. 1. Restriction enzymes are found in prokaryotes. Their biological role is to cleave foreign DNA. 2.Ther ecogni z edsequencei s“ palindromic (迴文)” .Gr eekmeans“ running back again” . e.g. Radar; Do geese see God? 上海自來水來自海上; 花蓮噴水池水噴蓮花. Sac II (from Streptomyces achromogenes). 3. The pattern of fragment that DNA be cleaved by several RE can serve as a fingerprint of a DNA molecule (RE map) 11. 限制酶的種類 已知的限制酶分為Type I、Type II與 Type III三類。 Type I與Type III限制酶同時具有endonuclease與methylase的活性。 Type I限制酶會隨機的切割距離辨識位置~1000 bp的序列,Type III 則只會切割距離辨識位置24~26 bp的序列。 Type II限制酶,則會專一地切割所辨識的核酸序列的位置,一般可 辨識雙股DNA上特定的4~8個鹼基,並能在認知序列內的特定位點上 切割雙股螺旋DNA。 每一種限制酶能辨識一特定的DNA序列並加以切割,但它不會切割 細菌自己的 DNA,因為細菌 DNA 上的切割位置已被甲基化,稱為 restriction-modification system。 不同的細菌中可純化出具不同專一性的限制酵素,可用來做基因剪 接時的「剪刀」,使其成為基因或分子遺傳操作上極為有用的工具 ,目前被廣泛應用於遺傳工程、基因選殖(cloning)和基因圖譜分析 (gene mapping) 。 12. 6.

(7) 2012/2/3. 限制酶的命名 限制酶的命名是以該酶來源的原核生物的名稱爲依據,即酶的名稱 的第一個大寫字母取自於屬名的第一個字母,第二、三個小寫字母 取自於種名的前兩個字母,字母後面的羅馬字則是簡單地表明該種 生物中不同限制酶分離的先後順序。 限制酶名稱的書寫方式,前三個字母常用斜體或加下橫線表示。 例如, 分離自產色鏈黴菌(Streptomyces achromogenes )的兩種限 制酶被分別命名爲SacI和 SacII。 若同一生物種內又分爲不同的血清型或菌株品系,其名稱則放在限 制酶名稱的第三個字母之後。 例如限制酶HincⅡ和HindⅢ則是分別來自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的c和d血清型菌株。 E. Escherichia (屬). co coli. (種). R. RY13. (品系). I. 首先發現. 在此類細菌中發現 的順序. Quiz: 請說明限制酶HindIII各 字母所代表的意義。(12分) 【94 年高考】 1. H: 2. in: 3. d : 4. III:. 13. Type II restriction endonuclease EcoRI cleavage. Cohesive end (Sticky end) (protruding; overhang). Hind II cleavage. 7.

(8) 2012/2/3. 15. DNA連接作用. 16. 8.

(9) 2012/2/3. DNA 連接酶作用機制. All ATP and NAD-dependent ligases appear to join DNA in a similar way but utilize a different nucleotide energy source to catalyze the reaction. 磷酸二酯鍵. 重組DNA影片( 4’ 36” ) : http://www.youtube.com/watch?v=x2jUMG2E-ic. 17. 基因選殖 (gene cloning) 基因選殖的步驟包括:  分離感興趣的DNA(例 如胰島素基因)  把感興趣的DNA接合 到載體  把重組的DNA轉形到 宿主細胞中  篩選含有重組DNA的 宿主細胞  檢測含有重組DNA或 是否產出適當蛋白質 產物的宿主細胞. 18. 9.

(10) 2012/2/3. 選殖載體 (cloning vector) 選殖載體的條件:  具有複製起點,使DNA可以在宿主細胞中進行複製。  具有許多單一特殊的限制酶切位,以供選殖DNA片段使用。  具有篩選性的標記,可以用來測定選殖重組DNA是否已轉移至細胞中或顯示 外來的DNA是否已經插入至載體上。. pBR322. multiple cloning site (MCS). 19. Clone a foreign DNA into the PstI site of pBR322 1. Cut the vector to generate the sticky ends 2. Cut foreign DNA with PstI also – compatible ends 3. Combine vector and foreign DNA with DNA ligase to seal sticky ends 4. Now transform the plasmid into E. coli. 20. 10.

(11) 2012/2/3. Bacterial Transformation Traditional method involves incubating bacterial cells in concentrated calcium salt solution The solution makes the cell membrane leaky, permeable to the plasmid DNA Newer method uses high voltage to drive the DNA into the cells in process called electroporation. Screening Transformants Transformation produces bacteria with: Religated plasmid Religated insert Recombinants Identify the recombinants using the antibiotic resistance (Fig. 4.4) Grow cells with tetracycline so only cells with plasmid grow, not foreign DNA only. Next, grow copies of the original colonies with ampicillin which kills cells with plasmid including foreign DNA.. 21. Screening With Replica Plating Replica plating transfers clone copies from original tetracycline plate to a plate containing ampicillin. A sterile velvet (天鵝絨) transfer tool can be used to transfer copies of the original colonies Desired colonies are those that do NOT grow on the new ampicillin plate.. Plasmid cloning影片(4’ 24” ): http://www.youtube.com/watch?v=acKWdNj936o&NR=1. 22. 11.

(12) 2012/2/3. Vectors for cloning large pieces of DNA. Fosmids are similar to cosmids but are based on the bacterial F-plasmid. The cloning vector is limited, as a host (usually E. coli) can only contain one fosmid molecule. Low copy number offers higher stability than comparable high copy number cosmids.. 23. 如何分離真核生物中感興趣的基因 利用反轉錄酶製備感 興趣的基因. Use of reverse transcriptase to make cDNA of a eukaryotic gene. 分離細胞全部RNA 純化mRNA 以反轉錄酶製備cDNA (complementary DNA) 用PCR放大擴增感興趣 的基因的cDNA 以電泳分離純化感興趣 的基因. 24. 12.

(13) 2012/2/3. 聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR) 由Kary Mullis發明,並於1993年獲得了諾貝爾化學獎。 PCR能使DNA在試管中大量擴增,其原理是在擬擴增的DNA片段兩端分別設 計一個前置引子(forward primer)和反置引子(reverse primer),使其與已變性 的單股目標DNA緩冷配對黏合(annealing)後,利用DNA聚合酶(DNA polymerase)以目標DNA的兩股分別做為模板(template)來合成新的DNA股。 PCR過程主要分成三大部份: 1.變性反應(denaturation):以高溫92℃-95℃使雙股模板DNA分離 2.緩冷配對黏合(annealing) :使引子與單股模板DNA做緩冷配對(40℃-52℃) 3.延長反應(extension):將溫度調整到DNA聚合酶作用的有效溫度而合成新的DNA股 (72℃). 在理想的條件下,DNA以幾何級數增加。理論上,一個DNA分子若重複操作 PCR 25次,那麼DNA的分子數將會擴增到225 = 106 個分子。 影響PCR DNA合成時精確性的因素 所欲合成的DNA的長度,長度越長出錯機率越高。 循環數(越多時精確度越低) 聚合酶的種類(有校對能力者為佳) Mg2+ (0.5-2.5mM)的量等。 25. 聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR) 一般的DNA聚合酶有效作用溫度是37℃,在高溫分離雙股時會破壞DNA聚合酶 的活性。然而在耐高溫的細菌(Thermus aquaticus)中分離出來的DNA聚合酵素 (Taq DNA polymerase)在95℃中其活性的半衰期(half life)長達40分鐘,故可供 PCR操作使用。 Taq聚合酶的有效作用溫度為72℃,在這溫度下,每分鐘可合成2000-4000個核 苷酸(nucleotides)。由於Taq聚合酵素的發現,使PCR之操作得以自動化。 Taq聚合酶缺乏3‘ 至5’ 端外切酵素(exonuclease)的特性,因而在DNA合成時沒有 校對(proofreading)的功能,Taq聚合酶合成DNA時,在每一個循環中錯誤配對 的頻率可高達1/6000個核苷酸。 PCR的技術已廣泛地應用在學術,工業和醫學上的研究,例如 DNA序列的分析 病原菌的分析 基因定位突變 遺傳病之診斷 基因表現與選殖 水質及食品檢驗 26. 13.

(14) 2012/2/3. 聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR). PCR影片: http://www.youtube.com/watch?v=_YgXcJ4n-kQ&feature=related. 27. PCR實驗操作:http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/ 利用PCR技術將DNA分子擴增之電泳圖. 28. 14.

(15) 2012/2/3. PCR的反應條件. Buffer. 0.1 ~1μg 0.1-1. 0μM each 0.2 mM each 50 mM 1.5 mM 10 mM 2.5 Unit 50or100μL. DNA template Primers dNTPs KCl MgCl2 Tris-HCl (pH 8.4) Taq polymerase Total volume. 注意!此為PCR常用之反應條件,隨著樣本、DNA序列等的不同,各項條件應斟酌調整。. PCR溫度循環設定 94℃ 94℃ 55℃ 72℃ 72℃ 4℃. 5 min 1 min 1 min 1 min 5 min ∞. 25 ~ 30 cycles. 29. PCR溫度循環設定 起始以高溫將雙股DNA分離 對PCR而言,將雙股DNA完全分開是相當重要的起始步驟,作用不完全將會 降低PCR的產量。在GC含量50%以下時,溫度設定在95℃時間1~3分鐘。 時間可隨著模版上GC的比例增加逐漸調升。 通常94~95℃進行1~2分鐘即可將兩股DNA分離,如果GC含量過高,可將時 間提高至4~5分鐘。或者加入10-15%glycerol、10%DMSO、5% formamide 等溶液促使DNA分離,但此等溶液的副作用是會抑制Taq DNA polymerase 約50%的活性。. Primer黏合溫度 一般來說,引子與模版DNA黏合溫度(annealing temperature;Ta)大約是引子 分離核酸溫度(melting temperature; Tm)減5 ℃。而這溫度最好落於55-75 ℃ 之間。如果除了目標產物外,有些非預期的產物出現,則可逐漸提高黏合溫 度約1~2℃。 若2 條引子所算出之Ta 相差超過6 ℃以上(可能會影響PCR 的產率),可以將 算出溫度較低的那段引子的3’ 或5’ 端加幾個鹼基。 Tm(℃) = 2(A+T) + 4(G+C). 15.

(16) 2012/2/3. 引子(primer)設計的注意事項: 引子長度通常為18-25個鹼基長。 GC含量約佔40-60% 。 最好3’ -端的鹼基為G/C。 避免引子本身形成二級結構。 同一反應中的引子序列不可互補,以免造成自相黏合 形或primer dimer的情況 6. 避免引子所要黏合的目標形成二級結構 7. 引子黏合溫度盡量不要相差5℃以上。 8. 3'端尤其重要,必須不含有與其他引子互補的序列, 並且要與模板完全互補,絕對不可以有mismatch。 1. 2. 3. 4. 5.. 31. Design the primer pairs, 15-mer for each, to amplify the gene sequencebel ow wi t hPCR?I tneedst oi ndi cat et he5’ - and3’ -end of each primer. 5’ -GCGTTGACGGTATCAAAACGTTAT… …TTTACCTGGTGGGCTGTTCTAATC-3’ Ans: 5’-GCGTTGACGGTATCAAAACGTTAT… …TTTACCTGGTGGGCTGTTCTAATC-3’ 3’-CGCAACTGCCATAGTTTTGCAATA… …AAATGGACCACCCGACAAGATTAG-5’. 5’-GCGTTGACGGTATCAAAACGTTAT… …TTTACCTGGTGGGCTGTTCTAATC-3’ ……ACCCGACAAGATTAG-5’ 5’-GCGTTGACGGTATCA…… 3’-CGCAACTGCCATAGTTTTGCAATA… …AAATGGACCACCCGACAAGATTAG-5’. 32. 16.

(17) 2012/2/3. DNA polymerases的選擇 Thermostable polymerase 種類繁多,一般常使用Taq polymerase, 但有時針對所合成fragment 的長度及正確性,可考慮其他酵素。. 33. 反(逆)轉錄PCR (Reverse Transcription PCR; RT-PCR) 過程:反轉錄酶以RNA為模 版合成互補DNA (complementary DNA; cDNA),接下來再利用 PCR的原理來大量擴增這 段cDNA。 RT-PCR是目前在體外 (in vitro)觀察基因表現最敏感 的方法之一,可以檢測很 低拷貝數的RNA。 RT-PCR廣泛應用於遺傳 病的診斷以及檢測RNA含 量的定量分析。. Reverse transcription影片(0:38):http://www.youtube.com/watch?v=68zTyjeUsqY. 17.

(18) 2012/2/3. 反轉錄PCR合成第一股cDNA使用的引子種類. 35. 即時聚合酶連鎖反應(Real-time PCR;即時PCR) Real-time PCR又稱定量即時聚合酶連鎖反應(Quantitative real time polymerase chain reaction,簡稱 qRT-PCR或q-PCR),是一種在DNA 擴增反應中,以螢光染劑偵測每次PCR循環後產物總量的方法。 一般的PCR進行後,反應多已達到飽和,測得的產物為end-point的PCR 產物,若要以傳統的PCR做定量分析,則要對同一樣品同時做不同循環 的PCR反應,再將產物以電泳分離,費時費工且容易污染。 即時PCR的基本原理有兩個要點: 1. 對PCR反應中的每一個循環的產物能進行即時偵測並記錄下來。 2. 用於即時偵測PCR產物的螢光染料,標記在一段可以與目標序列進行特異性 結合的探針上,並且處於淬滅狀態,只有當探針與模板特異性結合以後才有 可能釋放出螢光信號。. 即時PCR常用螢光探針有三種: DNA結合染劑(SYBR Green I) 雜交探針(hybridization probe) 水解探針(hydrolysis probe,又稱TaqMan probe) q-PCR Probe 動畫 : http://www.biosearchtech.com/support/videos/real-time-pcr-probe-animation-video.aspx q-PCR 動畫: http://www.lifetechnologies.com/featured-solutions/pcr/real-time-pcr-animation.html. (因時間因素,請自行上網參閱). 18.

(19) 2012/2/3. SYBR Green I. 雜交探針(hybridization probe). 37. 水解探針(hydrolysis probe) (又稱TaqMan probe). 即時PCR. 19.

(20) 2012/2/3. 每一輪循環中PCR的產出量都以 螢光信號被記錄在PCR儀器的光 學檢測系統,在某一循環中螢光 信號的強度達到預先設定的閾值 (Threshold)時,對應此時的循環 數稱為Ct 值(Threshold Cycle)。 目標DNA起始濃度與其Ct值成反 比,目標DNA的起始濃度越高, 其螢光值越早達到偵測之閥值, 其Ct值越小;反之目標DNA起始 濃度越低,其Ct值則越大。 根據序列稀釋標準樣品的Ct值及 其已知起始濃度,即得一標準曲 線 (standard curve),根據此標 準曲線.可以由樣品的Ct值推算 其起始濃度,達到定量之目的。. Ct. 99學年度大學入學考試指定科目【生物科】非選擇題 利用遺傳工程技術,可將不同來源的DNA組合起來,建構出重組DNA。 試回答下列問題。 1. 遺傳工程技術利用酵素以切割DNA。請問這種酵素是(a)來自哪一類 生物? (1分) (b)其名稱為何? (1分) 2. 利用PCR技術來擴增目標基因時,請問(a)所使用的酵素名稱為何? (1分) (b)在對溫度的敏感性質上,此酵素有何特性? (1分) 3. 能用來接合目標基因的構造稱為載體,請寫出兩種載體的名稱。(2分) 4. 在建構重組DNA過程中,請問(a)能接合目標基因和載體的酵素名稱 為何? (1分) (b)哪一類原核生物常被用來複製重組DNA? (1分) 解答: 1. (a). ; (b). 2. (a). ; (b). 3.. ;. 4. (a). ; (b) 40. 20.

(21) 2012/2/3. DNA定序(DNA sequencing) 在1977年,有兩種DNA定序方法首先被發表出來。 1. 哈佛大學A. Maxam與W. Gilbert發現一種可以選擇性分解鹼基的化學定序法。 2. 由F. Sanger發展出來的雙去氧核苷酸定序法,利用雙去氧核苷酸在特定位置上 造成DNA鏈合成的終止,進而推導出DNA序列。. 這兩個方法,DNA都經過標記且利用凝膠電泳分離DNA片段,目前大多 數的實驗室都使用Sanger的定序方法。 Strategy of the chain-termination method for sequencing DNA. 2’ , 3’ -dideoxy analog. Nobel prize in Chemistry (1980). 3’. 5’. deduce Template sequence 3’ -TACTATGCCAGA-5’. 42. 21.

(22) 2012/2/3. 現在DNA定序都已自動化了,自動定序的原理是改良了Sanger定序的方法,將4種ddNTP 標定上不同的螢光。如下圖所示:. 43. Maxam-Gilbert DNA sequencing method. 22.

(23) 2012/2/3. Chemicals used for Maxam-Gilbert sequencing method. Base specificity. Chemical used for base alteration. Chemical used for altered base removal. Chemical used for strand cleavage. G. Dimethylsulphate. Piperidine. Piperidine. A+G. Acid. Acid. Piperidine. C+T. Hydrazine. Piperidine. Piperidine. C. Hydrazine + alkali. Piperidine. Piperidine. A>C. Alkali. Piperidine. Piperidine. 46. 23.

(24) 2012/2/3. 焦磷酸定序(pyrosequencing)技術 Sanger方法的特點為解讀序列能力較強,每次反應約可得到1,000個 核苷酸序列,因此可提供較多的DNA訊息。但其缺點為操作較複雜, 不易於一定時間內分析大量檢體。 對DNA序列分析的要求通常是解讀的序列越長越好,但在許多分子診 斷工作中,往往需在短時間內偵測很多DNA檢體,而且只需短短的幾 十個核苷酸序列的資訊,就可以提供正確診斷。 例如:在臨床分子診斷領域中,對細菌和其他病原微生物的分子診斷, 或在偵測單一核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism; SNP)時, 只需對最具代表性的十幾到幾十個核苷酸片段進行序列分析即可。 在這種情況下,Sanger 方法未必是最合適的DNA序列分析技術。最 新發展的焦磷酸定序(pyrosequencing)技術,是目前最適合這些目的 的DNA序列分析技術。. 47. Pyrosequencing技術是新世代的DNA序列分析技術(next generation sequencing technology),是針對短到中等長度的DNA序列樣品進行高通 量、高精確度(99%精確)和再現性佳的分析技術。 其原理不同於傳統Sanger方法,係利用幾種生化反應之組合來測定在 DNA合成時,過程中會產生的焦磷酸基團(PPi)之特性,進而將PPi轉換成 ATP,ATP再促使螢光酶(luciferase)放出生物冷光(bioluminescence)。放 出的冷光強度經冷光儀(luminometer)偵測後,轉讀出DNA序列。 該技術特點包括:對DNA的序列分析無須進行電泳、DNA片段無須螢光 標記(因此無須螢光分子的激發和檢測裝置)、可在96孔盤上進行反應,因 此能同時進行多檢體序列分析。 但也因反應特性的限制,精準讀序目前只在20-30個核苷酸序列左右。有 的研究者經過改良,可使該技術的讀序長度增加一倍以上。. 48. 24.

(25) 2012/2/3. Pyrosequencing技術的基本步驟及原理如下︰ 1. 一個特異性的定序引子和單鏈DNA模板結合,然後加入酶混合物(包括DNA polymerase、ATP sulfurylase、Luciferase及Apyrase)和受質混合物(包括 Adenosine-5’ -phosphosulfate (APS) 和Luciferin)。 2. 在反應中加入一種dNTP,若它正好能和DNA模板的下一個鹼基配對,則會 在DNA 聚合酶的作用下,添加到引子的3’ 端,同時釋放出一個分子的焦磷 酸(PPi)。 3. 在ATP硫酸化酶的作用下,生成的PPi可以和APS結合形成ATP;在冷光酶 的催化下,生成的ATP又可以和冷光素結合形成氧化冷光素,同時產生可見 光。通過CCD光學系統即可獲得一個特異的檢測峰,峰值的高低則和相匹 配的鹼基數成正比。 4. 反應體系中剩餘的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發生降解。 5. 加入另一種dNTP,重覆進行第2~4步驟反應,根據獲得的峰值圖即可讀取 準確的DNA序列訊息。. 49. Pyrosequencing enzyme reactions. Phosphodiester bond formation and release of pyrophosphate during the incorporation of a nucleotide at the end of a growing DNA strand. Apyrase is an ATP diphosphohydrolase. It catalyses the removal of the gamma phosphate from ATP and the beta phosphate from ADP. The phosphate from AMP is not removed.. 25.

(26) 2012/2/3. DNA sequence determination by pyrosequencing. 焦磷酸定序動畫: http://www.youtube.com/watch?v=nFfgWGFe0aA. 51. 基因定點突變(site-directed mutagenesis)技術 定點突變是加拿大科學家Michael Smith發明,他與PCR發明者Kary Mullis 在1993年共同獲得諾貝爾 化學獎。 基因突變可經由自發性或經誘導 產生。在定點突變法之前,突變 株的產生必須經由自然界或用化 學等方法讓基因突變,這屬於隨 機突變。而突變株必須在生物體 上產生改變,才能確定有突變發 生。突變位置必須利用分生或化 學方法來確定。 定點突變是經由設計好的寡核苷 酸,在任何一個基因片段上進行 隨意或設計好的突變,意即此突 變是預先設定好的,所以也有人 將它稱為“反向遺傳法”。. (M13正股) target gene. (DNA polymerase). 26.

(27) 2012/2/3. Tyrosine. Phenylalanine. DNA交互配對(雜交)反應(DNA hybridization) 利用螢光標定之DNA 探針, 藉由hybridization的過程, 在染色體上將基因或DNA 定位。. 54. 27.

(28) 2012/2/3. 南方墨點法(Southern blot) 由英國科學家Edwin Southern 發明,因此命名為Southern blot,用以偵測經由膠體電泳分 離的樣品中,含有特定序列的 DNA片段。 類似的技術也被用來偵測經由 膠體電泳分離的樣品中,含有 特定序列的RNA片段,稱為北 方墨點法(Northern blot)。用以 偵測蛋白質的方法稱為西方墨 點法(Western blot) 。 Southern blot 動畫: http://www.youtube.com/watch?v=6FjjjATsr50. Northern blot 動畫: http://www.youtube.com/watch?v=KfHZFyAD nNg&feature=related. 西方墨點法(Western blot). Western blot 動畫: http://www.youtube.com/watch?v=aGu-NKvKIoA&feature=related. 28.

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