人類羊水幹細胞分化為肝細胞之研究

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

人類羊水幹細胞分化為肝細胞之研究

中 華 民 國 95 年 10 月 26 日

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫

題目: 人類羊水幹細胞分化為肝細胞之研究

Title: The study of the differentiation from human amniotic stem cells to

hepatocytes.

計畫類別：

個別型計畫

□

整合型計畫

計畫編號：NSC 94－2314－B－006－077－

執行期間：

94 年 08 月 01 日至 95 年 07 月 31 日

計畫主持人：張峰銘

共同主持人：

計畫參與人員：張炯心、游振祥、柯慧貞

成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：精簡報告 □完整報告

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份

□國際合作研究計畫國外研究報告書一份

處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、列管計畫

及下列情形者外，得立即公開查詢

□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢

執行單位：國立成功大學醫學系婦產科

中

華

民

國

95 年

10 月

25 日

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國科會計劃研究成果報告 題目: 人類羊水幹細胞分化為肝細胞之研究

Title: The study of the differentiation from human amniotic stem cells to hepatocytes. 關鍵詞：肝細胞，幹細胞，臍帶血，羊水，分化 2006-10-25 成大婦產科 張峰銘 中文摘要 幹細胞具有多重分化、自我更新與造血的潛能，因此，其目前應用於各幹細胞移植、基 因治療和免疫治療等領域。臍帶血中含幹細胞，但數量有限，無法提供研究和臨床的需要。 另一方面，胚胎幹細胞飽受道德爭議。所以，誠如文獻所提及：羊水幹細胞 ，除了不影響胎 兒染色體培養與胎兒生長之外，並且沒有胚胎幹細胞受道德爭議的優點。再者，羊水中含有 很多胎兒各器官發育過程中脫落的細胞，比其他組織具有較豐富之幹細胞數量，所以是極佳 的幹細胞取材來源。 羊水裡面含有一些從羊膜表面剝落下來含有很多胎兒的皮膚、呼吸道、消化道、泌尿道 等各器官發育過程中脫落的細胞，這些細胞的染色體和胎兒是完全一樣的。而且我們也知道 這些細胞在分化上是要比臍帶血幹細胞還要來得早。然而從胚胎學的觀點來看，其中可能亦 含有各胚層脫落的下來之幹細胞。因此在妊娠16 至18 週之間施行羊膜穿刺所獲得的此時期 之羊水中應該比成人個體中或臍帶血中有較高之機會存有更多更早期的幹細胞。 雖已有文獻 [Tsai et al.,2004] 提出在體外利用人類羊水幹細胞靠各種刺激因子成功培養 出來自外胚層的類神經細胞和來自中胚層的軟骨、脂肪、韌帶等組織的細胞。目前為止，想 在體外利用人類羊水幹細胞培養出來自內胚層般細胞如肝臟細胞時，卻無法達成 [Tsai et al.,2004]。另外，目前所培養出來自內胚層般如肝臟細胞者，還是從人類胎兒臍帶血中或骨髓 的幹細胞刺激而得，並非來自人類羊水幹細胞培養而得[Lee et al.,2004]。然而又有文獻提及在 老鼠的試驗中，靠著老鼠羊水內的某些未知生長因子的共同培養確實可以促進老鼠肝細胞和 骨髓細胞的增生[Heidari et al.,2004]。 為此，我們想進一步研究從人類羊水幹細胞培養出如肝臟細胞的方法和關鍵因素的歸 納。本研究呈現正面結果,亦即證明由人類羊水幹細胞可以培養出人類內胚層般類肝臟細胞。 我們將進一步的探討此類肝臟細胞形態學系列相關研究。 研究目的： 研究從人類羊水幹細胞培養出肝臟細胞的方法以及證明人類羊水幹細胞培養出肝臟細胞 的存在，並歸納其中的關鍵因素。 研究方法: 1. 細胞製備：自 94 年 08 月 01 日至 95 年 07 月 31 日止, 收集懷孕 16 ~ 18 週的羊水，約 2-5 ml ，合計 42 例。 2. 體外培養：培養羊水幹細胞時，採用混合少量羊水與少量臍帶血血清於培養液的方法。生 長分化則以各適當濃度的細胞生長因子和某些抗氧化劑的添加加以刺激，如：Epidermal growth factor （EGF）， Fibroblast growth factor-basic （bFGF），hepatocyte growth factor

（HGF），Nicotinamide，Oncostatin M（OSM），Dexamethasone，ITS Premix，Vit. C， Vit. E 等。接著分兩組，其一內含5% ~ 10% 羊水，另一內含5% ~ 10% 臍帶血清，置於 37°C with 5% humidified CO2 的培養箱培養[Lee et al.,2004] 。

3. RT-PCR：

Step1: RNA 的抽取以Promega 生產的組套SV Total RNA Isolation System 完成.

Step2: RT-PCR 的進行則以Promega 生產的組套ImProm-IITM Reverse Transcription System 完成.

Step3: 進行PCR 時, 分別以六組 primer Albumin ; Cytokeratin ; Tyrosin-aminotransferase ; Glucose-6-phosphatase ; Hepatocyte nuclear factor-4 ; -actin , 條件以 94°C for 30 seconds , 55°C for 30 seconds , and 72°C for 30 seconds for 35 cycles 來進行.

六組Primer Seq. 如下: Albumin

Albu-S: 5'- TgC TTg AAT gTg CTg Atg ACA ggg -3' Albu-A: 5'- Aag gCA AgT Cag Cag gCA TCT CAT C -3' cytokeratin

CK18-S: 5'- Tgg TAC TCT CCT CAA TCT gCT g -3' CK18-A: 5'- CTC Tgg ATT gAC TgT ggA AgT -3' Tyrosin-aminotransferase

TAT-S: 5'- TgA gCA gTC TgT CCA CTg CCT -3' TAT-A: 5'- ATg TgA Atg Agg Agg ATC TgA g -3' Glucose-6-phosphatase

G6P-S: 5'- gCT ggA gTC CTg TCA ggC ATT gC -3' G6P-A: 5'- Tag AgC TgA ggC ggA Atg ggA g -3' Hepatocyte nuclear factor-4

HNF4-S: 5'- CCA AgT ACA TCC Cag CTT TC -3' HNF4-A: 5'- TTg gCA TCT ggg TCA AAg -3'

研究結果:

1. 研究證明：從人類羊水幹細胞培養出人類內胚層般類肝臟細胞是可行的 (Fig.1)。

2. 研究證明：培養羊水幹細胞時，採用混合少量羊水與少量臍帶血血清於培養液的方法，可 以增加細胞的數量。

3. 研究證明：加以各適當濃度的細胞生長因子和抗氧化劑的添加刺激，如：Epidermal growth factor （EGF）， Fibroblast growth factor-basic（bFGF），hepatocyte growth factor（HGF）， Nicotinamide，Oncostatin M（OSM），Dexamethasone，ITS Premix，Vit. C，Vit. E 等， 可以幫助從人類羊水幹細胞培養出人類內胚層般類肝臟細胞。

3 4. RT-PCR 結果圖示如下(Fig. 1): 結論: 由於本研究呈現正面結果,亦即證明由人類羊水幹細胞可以培養出人類內胚層般類肝臟 細胞。我們將進一步的探討此類肝臟細胞形態學系列相關研究。 參考文獻

Heidari Z, Isobe K, Kiuchi K, Goto S, Nakashima I, Tomoda Y. Promotion of proliferation of murine hematopoietic stem cells by growth factors in murine amniotic fluid. J Reprod

Immunol. 1996; 31: 51-64.

Lee KD, Kuo TK, Whang-Peng J, Chung YF, Lin CT, Chou SH, Chen JR, Chen YP, Lee OK. In vitro hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells. Hepatology. 2004 ;40: 1275-1284

Tsai MS, Lee JL, Chang YJ, Hwang SM. Isolation of human multipotent mesenchymal stem cells from second-trimester amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol. Hum