全靜脈營養液中添加

全靜脈營養液中添加 L-glutamine 對燒傷老鼠營養素代 謝及免疫反應之影響

葉松鈴

台北醫學大學保健營養系

前言

燒燙傷是一種創傷後之發炎反應(post-traumatic inflammatory disease)，嚴重燒 燙傷會造成賀爾蒙分泌之改變、蛋白質及脂質之分解、糖質新生、引起嚴重氮流失、

代謝速率增加，也會活化吞噬細胞和中性球(neutrophil)及 arachidonic acid 之代謝反 應，產生 eicosanoid 之代謝產物並促進 cytokine 之生成(1-4)。有研究顯示燒傷病人 免疫功能會降低，體內 IgG 量減少、延遲性皮膚敏感試驗及腸道免疫功能受損，造 成細菌轉移，而使病人較易受到感染，產生敗血性之併發症(5-7)。另外燒傷也會促 使活性氧自由基之產生，而使遠離燒傷部位之器官受損(8-10)。Deitch 等人(11)建議 燒傷 20%或不及 20%但有營養不良的人均應積極給予營養支持。

Glutamine(GLN)是全血中含量最多的氨基酸，也是細胞間質中含量最多的 游離氨基酸，由於其在體內可自行合成，以往常忽略其重要性，近年來，一些研 究發現在受傷及一些異化的疾病狀況下，血中及骨骼肌中 GLN 的濃度有明顯下 降(12,13)，其下降量的多寡與其存活率相關(14 )，而根據研究嚴重燒燙傷病人血 中 GLN 濃度較正常人減少 58%,且此種低 GLN 濃度會持續 21 天以上(15)。另外 一些複製快速的細胞如淋巴球、fibroblasts、癌細胞和腸黏膜細胞等均消耗大量 的 GLN (16 )，加上其在一些細胞、組織培養上的必要性，遂逐漸受到重視，甚 至被認為在某些生理或疾病狀況之下，GLN 是一種必需氨基酸(17)。有研究顯示 GLN 添加於全靜脈營養(total parenteral nutrition,TPN)的配方中，有助於維持腸道 構造和功能之完整性並可增加氮保留量(18-20 )。GLN 除了在疾病狀況下對蛋白 質代謝有正面影響外，近年來的實驗顯示 GLN 之添加在體外實驗可促進 T lymphocyte 增生(21)，在 interleukin(IL)-2 存在下 GLN 之添加可促進 killer cell 之 活性同時 tumor necrosis factor (TNF)-α、interferon-γ之產生亦與 GLN 有 dose response 之關係(22)。人體實驗中顯示，骨髓移植的病人，飲食中添加 GLN 的組 別血中 T lymphocyte、CD4 及 CD8 較未添加組高(23)，手術後的病人若添加 GLN 可使 T-cell DNA 之合成增加，但對 IL-2、TNF、IL-6 無影響(24)。在 GLN 對 NO 之產生上 in vitro 得到的結果並不一致，O'Dorod 等人(25)之實驗顯示，GLN 會促 進 neutrophil 產生 NO 。而 Meininger 等人(26)的實驗則顯示 GLN 會調節 arginine-NO pathway 抑制 L-citrullin 轉變成 L-arginine， 因而抑制 NO 之產生，

而抑制 NO 之產生可應用於減輕發炎反應。

在燒燙傷補充 GLN 之研究方面，補充較高量 GLN 之燒傷老鼠其細菌轉移 之比例較低(27)，而給予 Arginine 或 GLN 之前驅物質 ornithin A-ketoglutarate (OKG)之老鼠在燒傷後 2-3 天氮平衡之情形顯著較未添加 OKG 者為佳(28)，另外 燒傷病人之中性白血球在體外實驗中若培養液中有 GLN 存在時，其噬菌能力會 增強(29)。

TPN 是一種不經由腸道之營養支持方式，常用於重症病人。燒燙傷病人常 需要 TPN 作為營養支持，目前並無在 TPN 溶液中添加 GLN 對燒傷病人營養素 代謝及免疫反應之研究。因此本研究擬以燒傷老鼠之動物模式來探討 TPN 溶液 中添加 GLN 對燒傷老鼠之影響。本研究將分成兩部分進行，由於燒傷會造成免 疫能力之降低，為研究 GLN 之添加對燒傷後 24 小時內細胞激素及 T 淋巴球之 變化情形，第一部份先以 TPN 方式輸入含 GLN 之溶液一星期再進行燒傷，來探 討 GLN 之添加是否有可能減輕燒傷所造成之異化作用，並增強燒傷後之免疫能 力。因現實生活中燒傷之發生並不能預知，故第二部份為燒傷後再給予富含 GLN 之 TPN 溶液 2 或 3 天，燒傷後之 48-72 小時是燒傷異化作用最嚴重之時期，而 老鼠在燒燙傷 3 天之後可能漸漸恢復，故在輸入富含 GLN 之 TPN 48 及 72 小時 後分別抽血，來觀察 GLN 之添加對燒傷後之異化作用及免疫能力之影響。

實驗材料及方法

第一部份

本計劃擬以 230-250g 之雄性 Wistar rat 為實驗對象，經一星期之適應期後，將老 鼠分成 2 組，分別進行頸靜脈插管，完全由 TPN 方式供給營養一星期，兩組輸 入 之 TPN 溶 液 營 養 素 含 量 均 完 全 相 同 只 有 胺 基 酸 組 成 不 同 ， 一 組 添 加 Glycine(Gly)，一組添加 GLN，以往之研究顯示在 TPN 溶液添加 2%之 GLN，在 氮平衡及維持小腸黏膜細胞重量上均較未添加組為佳(30)，故本研究亦以此為添 加量。兩組輸液為等氮量（Isonitrogenous），TPN 溶液中所含熱量為 1kcal/1ml, 每天給予之熱量為 270kcal / kg BW, N / kcal 為 1:105, protein、fat、carbohydrate 約佔總熱量之 22%、11%、67%，一星期後進行燒燙傷實驗。本實驗組別為 GLN 燒傷組(GLN-Burn)及 Gly 燒傷組(Gly-Burn)。

燒燙傷實驗之動物模式：

將老鼠以腹腔注射麻醉後，剃掉背部的毛，將老鼠置於一底部開有一長方形空窗 之隔熱模型中，將剃毛部位緊貼於空窗，再將此曝露處浸於沸水中 10 秒鐘，造 成老鼠體表約 25%之三度燙傷(31,32)，燙傷後立即給予腹腔注射生理食鹽水 (10ml/100g BW)以補充水分(32)。燙傷後之 1-6 小時每小時由頸靜脈抽血 0.5 ml，並於 24 小時時犧牲取血、腹腔 macrophage 及肝、腎、肺、脾等器官，來探 討 GLN 添加與否對燒傷後短時間內不同時間點細胞激素及 nitric oxide (NO)產 生之變化，及燒燙傷 24 小時後非特異性免疫反應、T 淋巴球分佈之情形。

測定之項目為：

1. 血漿中 NO 之測定：Arg 為 NO 之前身，本研究擬比較兩組各不同時間點 NO 產生量之差異性來探討 NO 與其他代謝變化上之相關性。NO 會轉變成 nitrate 及 nitrite, 將 nitrate 以 nitrate reductase 轉變成 nitrite 後，以比色法測定之 (Calbiochem-Novabiochem Corp, USA)。

2. 血漿中 cytokine 之測定：擬測定之 cytokine 包括與發炎反應相關之 Interleukin (IL)-1β 、 IL-6 、 tumor necrosis factor(TNF)-α 及 與 T cell proliferation 相關之 IL-2，cytokine 之測定為利用 ELISA 之方法(Biosource, Belgium)(33)。

3. macrophage cytokine之分泌：將兩組分離出之macrophage 以 2x10⁶/ml之濃度 置於培養皿中，以定量之LPS來刺激，經過 24 小時之培養後將之離心取上清 液，以測定其cytokine之製造量，

4. 巨噬細胞吞噬綠膿桿菌之能力：由於臨床資料顯示燒傷病患最容易被綠膿 桿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染，本計劃擬用顯微鏡下觀察吞噬作用的 方法，先將綠膿菌培養至mid-log phase，以 4℃的PBS洗 2 次，再以RPMI 1640 調整細菌濃度為 10⁸ CFU/ml。 將腹腔收集之巨噬細胞以冷卻的RPMI 1640 清洗，再以含 10% 胎牛血清之RPMI調整細胞濃度為 2 x 10⁵ cells/ml。

吞噬作用之進行是將滅過菌、直徑 11 mm之圓型蓋玻片放入 24 孔培養皿 中的每一孔洞中，再加入 1ml的巨噬細胞，在 37℃之CO₂培養箱中靜置 2 小時，讓巨噬細胞吸附於蓋玻片後，將未吸附之腹腔細胞沖洗掉，在 37℃，

5%的CO₂培養箱中靜置 30 分鐘。以冷卻的PBS沖洗吸附在蓋玻片上的巨噬 細胞以去除未被吞入之綠膿桿菌。以 1% methanol固定細胞後，再以 1%

crystal violet染色。以油鏡將細胞放大 1000 倍後，觀察 100 個巨噬細胞的 吞菌作用，並計算每個細胞吞噬細菌的數目。將巨噬細胞吞噬綠膿桿菌的 數目，分為三種程度：小於 6 個，6 個至 19 個，大於 19 個細菌。分別計 算 100 個巨噬細胞中三種所佔的百分比(34)。

5. 自然殺手(NK)細胞比例、數目及細胞活性之測定：將脾臟細胞取出並製成 單一懸浮液，更進一步利用Tris-Ammonium chloride緩衝液將紅血球懸浮，

白血球則利用Hank’s溶液清洗三次。將NK細胞分離出後，利用Fluorescein isothiocyanate (FITC)及Phycoerythin (PE)染色之單株抗體來計算不同表面 標記之比例和數目。NK細胞之活性則先培養其標的細胞(YAC-1 細胞株)，

將YAC-1 細胞與⁵¹Cr一起培養約 4 小時，再將殘餘之⁵¹Cr除去，此時再加入 NK細胞與已經與⁵¹Cr培養過的標的細胞一起培養，過一段時間取出上清 液，以counter計算其放射強度(35)。

6. T細胞之反應：取全血測定之。CD4⁺及 CD8⁺為helper T 及supressor T淋巴球 上之細胞標記，測定CD4⁺及 CD8⁺蛋白質可知T淋巴球之變化情形。CD4⁺及 CD8⁺量之下降或CD4⁺/ CD8⁺比例下降均表示免疫能力降低(36)。CD4⁺及 CD8⁺ T淋巴球以接合FITC之antibody結合後以Flow Cytometry測定之(37)。

第二部份

同樣以 230-250g 之雄性 Wistar rat 為實驗對象，經一星期之適應期後，將老鼠分 成 2 組，麻醉後分別進行頸靜脈插管並同時燒燙傷，燒燙傷後由 TPN 方式供給 營養二或三天，兩組輸入之 TPN 溶液營養素含量均完全相同只有胺基酸組成不 同，如第一部分實驗所述。在燒傷後之 48 及 72 小時分別犧牲老鼠，取腹腔吞噬 細胞、血及肝腎肺等器官。

其測定項目為：

1. 肺、肝、腎之過氧化物之測定：根據研究顯示燒燙傷時 neutrophil 會侵襲遠 端器官，造成器官中 malondialdehyde(MDA)之濃度增高，使器官受損(9,10)。

測定器官中 MDA 之濃度可間接知道器官受損之程度。各器官以 250mM sucrose, 10mM Hepes 調成 pH 7.4 後，打成 15%之均質液測定其中之 TBARS 濃度(38)。

2. 肺、肝、腎臟抗氧化酵素活性之測定：Saitoh 等人(9)之研究顯示在燒傷 6 小 時後即可看出肺中 superoxide dismutase (SOD)之活性明顯較未燒傷組高，顯 示燒傷確會造成較大之氧化壓力。本研究擬測定肺、肝、腎之 SOD 及 glutathione peroxidase (GSHPx)活性，來探討 Arg 添加對燒傷老鼠體內抗氧化 酵素活性之影響，並比較不同時間點抗氧化酵素活性之改變。SOD 及 GSHPx 之測定為將 15%之器官均質液，經離心後取 cytosolic fraction 測定其中之酵 素活性(38)。

3. 血漿中乳酸之分析：血漿中乳酸濃度可作為兩組醣解作用進行之依據。

4. 血漿中游離脂肪酸之分析：血漿中游離脂肪酸濃度可知兩組脂解作用進行之 狀況。

5. 血漿中 NO 濃度之測定：測定方法如第一部分所述。可知 GLN 添加對燒傷 異化作用下血中 NO 產生之影響。

6. macrophage cytokine 之分泌：測定方法如第一部分所述。

7. T 細胞之反應：測定方法如第一部分所述。

8. 巨噬細胞吞噬綠膿桿菌之能力：測定方法如第一部分所述。

預期結果

預期 GLN 不論燒傷前或後添加於 TPN 溶液中可減輕燒傷所引致之異化作 用，並增強免疫反應，期望將來可實際應用於燒傷之病患。但由於 GLN 對 NO 之產生到底是抑制或促進尚有爭議，可能亦因疾病狀況不同而有不同之影響，因 為燒傷亦屬於一種發炎反應，若 GLN 之添加促進 NO 之產生，其對燒傷時所造 成之正面或負面影響仍有待本實驗結果來釐清。

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