流式質體儀：超高速之微生物鑑定定量研究－細胞溶解

流式質體儀：超高速之微生物鑑定定量研究－細胞溶解

張書奇，國立中興大學環境工程學系 助理教授 楊倧儒，國立中興大學環境工程學系 博士班研究生

鄭建宗，國立中興大學物理學系 助理教授 計畫編號：NSC 99-2221-E-005-036-MY2

摘要

面對一項未知的環境樣品時，利用傳統或是新興的生物檢測方式（如螢光現 地雜交或聚合酶連鎖反應等）均無法同時得知此樣品中包含了哪些物種、各種物 種之數目及各物種所扮演的功能性角色，應用微流體生物晶片技術之流式質體儀 可以有效解決此一問題。微流體生物晶片具有高專一性及靈敏度、分析速度快、

樣品及試劑使用量少、高度可攜性，節省空間與成本，減少人為誤差等優點，可 將分析化學實驗室中之儀器設備微小化並製作在平面化的晶片上，具有進樣、混 合、傳輸、反應、分離以及檢測等多項功能。本研究藉由微機電工程中之微影與 軟微影製程進行微流體生物晶片之光罩設計、母模製作、微小電極製作與實驗晶 片整合，完成整合式電溶解微流體生物晶片，進行細胞溶解實驗。常見細胞溶解 方法有熱能法、超音波法、化學法、電溶法、微篩法等。本研究選用電溶法進行 細胞溶解。將微流體生物晶片之微小電極接上導線，並提供穩定的電壓，當樣品 通過微小電極間隙時，藉由高壓電場的瞬間放電，造成樣品細胞表面產生穿孔。

並藉由propidium iodide 染料透過表面穿孔進入細胞體內與 DNA 結合染色，經 光源激發後發出紅色螢光，判斷細胞是否溶解成功。本研究利用整合式電溶解生 物晶片進行細胞溶解的成功率可達96.5%，處理速率可達 14 Hz 以上，明顯優 於目前文獻中之細胞溶解效率並且超出研究計畫預定之細胞溶解目標90%與處 理速率1 Hz 以上之目標。此結果是繼流式質體儀平台開發之油相流體動態聚焦 及微水珠形成技術完成後，再次奠定另一項穩固的基礎。

關鍵字：微流體、生物晶片、細胞溶解、微電極、微製造、電溶解

一、 前言

利用傳統的環境微生物檢驗方法，無法直接有效地鑑定微生物，甚至無法準 確地定量一未知樣品中包含哪些物種、各物種之數目與其在環境中所扮演的功能

性角色。這些資訊的取得有助於解決環境微生物領域的一些基本的問題，如：可 以得知微生物生態系中各微生物之實際優勢菌種及其所扮演的功能性角色，解決 這些問題的共通性新穎平台技術即為流式質體儀。流式質體儀平台技術也可以應 用在生物醫學、生物科技、藥物傳輸、藥物篩選、土壤地下水污染整治、廢水處 理與生態工程。目前，本研究之目標為解決環境微生物與微生物生態學上之難 題，其目的在於可以快速地鑑定微生物之物種、數量與界定其在環境中所扮演之 功能性角色；而成功之儀器原型研發，也將為質體學（Omics）研究帶來相當大 的突破。

為了解細胞體內功能性基因的表達，細胞溶解為最常見的前處理方法，細胞 溶解之後，才能將分子探針順利送達細胞內部之去氧核醣核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）與訊息核醣核酸（messenger ribonucleic acid, mRNA）等生物分子 進行雜合反應。細胞溶解方式有熱能法（Jamil et al., 2005）、超音波法（Theodore et al., 2005）、化學法（Schilling et al., 2002）、電溶法（Huang et al., 2001; Lin et al., 2001）、微篩法（Carlo et al., 2003）、與雷射法（Lee et al., 2006）等。

所有細胞溶解方法中以雷射法之成功率最高但處理耗時，必須以光學鑷子

（optical tweezers）將細胞移入雷射光聚焦處進行切開，此方法並不適用於微流 體生物晶片之快速處理要求；其他方法中，以電溶解法所需時間最短，但是溶解 成功率偏低。本研究是利用電溶解法結合微流體晶片進行大腸桿菌細胞溶解實 驗。實驗結果顯示，整合完成之電溶解微流體晶片保存了電溶解方法之快速溶解 之特色，同時有效提高了溶解成功率。

二、 材料與方法

本研究主要是利用微機電系統中之微影製程技術製作微流體生物晶片之母 模與微小電極，再配合軟微影製程整合微小電極與微流體之微通道，成為電溶解 微流體生物晶片，進行細胞溶解實驗。

1. 微流體晶片母模與微通道之製備

利用微機電系統之微影製程技術進行母模開發。先將矽基板或玻璃基板 清洗乾淨後經由光阻塗佈機（SCD-6000，詠欣儀器，台灣），將光阻（JSR THB121N，久理企業，台灣）均勻地塗佈在基板上，塗怖厚度約 30 μm，

而第一段轉速的目的為使光阻能均勻的塗怖在玻璃基板上；第二段轉速的目 的為決定光阻所需塗怖的厚度。接著使用曝光機（國立中興大學貴重儀器中 心，OAI-500）UV 光照射，使 UV 光透過所設計之光罩，將特定圖案轉移到 光阻上，最後利用顯影液（AD-TMAH 0.5，久理企業，台灣）將圖案顯影出 來，以本研究之負光阻為例，經照射之部位光阻結構變強，經顯影液浸泡後

將未顯影部分移除，留下所需的圖案，即完成微流體晶片之母模。以上三步 驟-光阻塗佈、曝光、顯影-是微影製程的三大基本步驟（張, 1997）。微影製 程三步驟之示意圖如圖1 所示。微通道之製作則是將去除氣體之聚二甲基矽 氧 烷 （Polydimethylsiloxane, PDMS, SYLGARD 184A ＆ B Dow Corning Chemical, USA））倒在母膜上，以加熱平板烘烤，待其冷卻硬化後，在進行 翻模動作，即可將母膜上突出之圖案轉移至PDMS 膠膜成為凹入之微通道。

（a）光阻塗佈 （b）曝光

（c）顯影

圖1 微影製程之三大步驟 2. 電溶解微流體生物晶片製作

微小電極製作是在清洗完成的玻璃基板上進行微影製程，再進行真空濺 鍍（HUV Series, Syskey Technology LTD，Taiwan），在高真空的腔體中通入 氬氣（Ar），利用電漿使其離子化後轟擊金屬靶材造成靶材金屬離子化，濺鍍 在試片表面，再進行光阻剝離的步驟，利用丙酮將光阻剝離，即可將所需要 的金屬電極圖案轉移到玻璃基板上，再與翻模完成已經具有微通道圖案之 PDMS 膠模一起進行氧氣電漿（Femto UHP, Diener Electronics GmbH +Co. KG, Germany）表面改質，在真空的腔體中通入氧氣，經由電漿的激發使氧氣離 子化，轟擊 PDMS 表面，使其轉變為親水性，然後進行此已經具有微通道之

PDMS 與具有微電極玻璃基板之接合，完成後為含有微小電極之電溶解微流體 生物晶片，如圖2 所示。

3. 以微小電極進行細胞溶解

先 將 培 養 好 的 大 腸 桿 菌 加 入 稀 釋 100 倍 的 PicoGreen^（P-7581, Invitrogen, Inc., USA）與propidium iodide（P-1304, Invitrogen Inc., USA）

以水浴30C靜置 30 分鐘（WB211-B, KANSIN INSTRUMENTS CO., LTD.）後 進行離心（Mikro 120, Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Germany），將上清 液倒掉，再加入油相，油相液體為Tripropylene glycol diacrylate（#246832,

（a）光阻塗佈 （b）真空濺鍍

（c）光阻剝離 （d）微小電極微流體生物晶片

（e）微小電極微流體生物晶片

圖2 微小電極微流體生物晶片製作步驟

Sigma-Aldrich，簡稱 TPGDA）。再以超音波震盪方式（Level 2、10 sec）將大 腸桿菌之細胞均勻分散在油相中（Virsonic 100，Virtis Company，USA），並 將 微 流 體 生 物 晶 片 之 微 電 極 與 導 線 焊 接 ， 導 線 另 一 端 接 上 電 源 供 應 器

（TH-3105，勝特利電子，中國）作為電力來源進行細胞溶解，如下圖 3 所示。

圖3 微小電極微流體生物晶片完成圖

三、 結果與討論

本研究利用微機電系統開發出整合微小電極之電溶解微流體生物晶片，以六 道微小電極，並配合電源供應器，持續的提供40 伏特之電壓進行大腸桿菌之細胞 溶解，而下圖 4 為在顯微鏡下觀察所拍攝的微小電極圖，後方水平較窄者之淡色 線條為微通道，其寬度約為20 μm，前方鉛直方向之兩道黑色較寬者即為微電極，

中間間隙寬度約為3 μm，左側黑色較寬者為電極正極，右側黑色較寬者為電極負 極，當有菌體通過中間間隙時，因高壓電場作用，會產生瞬間放電，造成細胞溶 解。

圖4 微小電極與微通道之顯微鏡影像

PicoGreen^為可穿過細胞壁與細胞膜之高靈敏度之DNA螢光染料，即任何細胞

只要仍有DNA存在，均可被PicoGreen^有效染色，表示只要是活細胞或是細胞中 DNA尚未完全分解之前，均會被染色且在波長約 480nm之光線照射線會發出綠色 螢光。Propidium iodide螢光染料原本無法進入健康之細胞體內，但在細胞穿孔或 是細胞溶解之後可進入細胞體內與DNA結合，Propidium iodide與DNA結合後其螢 光可增強20-30 倍，經光源激發後放射出紅色螢光。因此，通常藉Propidium iodide 染色判定細胞是否能夠繼續生存（viable）或是死亡（cell death）之依據。本研究 在細胞尚未進行細胞溶解實驗前即將各個細胞封裝在一小水珠中，在此小水珠 中，已事先將PicoGreen^與Propidium iodide溶入。如果在實驗之前，該細胞仍為 健康之細胞，則在光源激發下應只顯出綠色螢光而無紅色螢光，若是在實驗之前 即已經受損，則會顯出綠色與紅色兩種螢光。在螢光顯微鏡下可以利用不同之波 長濾鏡組合，即可觀察兩種螢光並藉此判定細胞溶解成功與否。

圖5 則為樣品染以PicoGreen^與Propidium iodide雙螢光染料染色後，在未經 微小電極進行細胞溶解前以螢光顯微鏡觀察攝影，影像經負片處理後呈現如圖 5 所示（為避免列印時浪費油墨，以負片方式呈現），圖 5（ａ）中之黑點為健康之 大腸桿菌，而圖 5（ｂ）為樣品染以Propidium iodide螢光染料且尚未經由微小電 極進行細胞溶解前以螢光顯微鏡攝影之影像（以負片呈現）。此圖代表在經由水珠 封裝處理後之大腸桿菌樣品幾乎全部仍為活菌的狀態，其存活率約於96.7%。

（ａ） （ｂ）

圖 5 將大腸桿菌染以PicoGreen^與Propidium iodide，未經細胞溶解前之螢光顯 微鏡影像（負片），圖（a）中黑點為綠色螢光之大腸桿菌，圖（b）中黑點為未 經細胞溶解但已受損之大腸桿菌，兩圖之背景顏色差異係由於圖（b）之亮點很 少，所以整體視野螢光亮度極弱而為純黑色，經負片處理及轉換為純白色所致。

而經微流體生物晶片之微小電極細胞溶解後之大腸桿菌於微通道之末端將

樣品收集後，在螢光顯微鏡下觀察並計算細胞溶解成功率(至少挑選 21 個視野進 行計數)，觀察之視野影像（負片）如圖 6 所示。圖 6（a）中為經微小電極細胞 溶解後之大腸桿菌被光源激發後所放射之綠色螢光影像（負片呈現），圖中黑點 即為大腸桿菌；而圖 6（ｂ）為同一個視野之紅色螢光影像（負片呈現），圖中 黑點為已經成功溶解之大腸桿菌，可發現兩影像的螢光亮點位置幾乎重複。本研 究中共計數了21 個視野，在 21 個視野的觀察下，可發現發出PicoGreen^螢光之 大腸桿菌，其螢光亮點位置與Propidium iodide紅色螢光亮點位置重複，代表著 大腸桿菌已成功地被溶解。

（a） （ｂ）

圖

P

6 以封裝於微水珠中之大腸桿菌經細胞溶解後之PicoGreen^ 螢光顯微鏡影像

（a）與Propidium iodide螢光顯微鏡影像（b），顯示絕大部分之大腸桿菌均已經 溶解成功。

所以本研究計算經微小電極細胞溶解後之溶解成功率計算方式為，計數在各 個 視 野 中 同 時 發 出 icoGreen^綠 色 螢 光 染 料 之 大 腸 桿 菌 亮 點 位 置 及 發 出 Propidium iodide紅色螢光染料之大腸桿菌亮點數目加上未重複數目視為一個視 野下的總菌數（分母）；再計算經細胞溶解後Propidium iodide進入細胞體內與 DNA染色後經光源激發後明顯發出紅色螢光之亮點數目（分子），再將兩者相除 換算為百分比。以此方式計算之成功率之分母可能較大，但以較保守之方式（分 母較大）來計算可確保後續之平台開發技術有較佳之結果，而本研究計算重複實 驗之細胞溶解成功率為 96.5％。表 1 為本研究之電溶法與其他文獻中細胞溶解 方式之比較，由表中可見，在比較溶解效率下，除雷射法與微篩法外，本研究所 達到之溶解效率為最高，如本文前言所述，雷射法因處理之速度太慢並不適用於 微流體生物晶片，而微篩法則會造成樣品間的交互污染也不適用於微流體生物晶

25μm  25μm 

片細胞封裝之型式。在比較輸出速率下，文獻中之電溶法雖有可能較本研究之速 率快，但目前僅成功應用於哺乳類細胞，而尚未成功應用於細菌細胞。因此，就 溶解效率與輸出速率雙方面之比較，本研究成果已明顯超越目前國際間所有微生 物細胞溶解之成果。

進一步比較本研究與文獻中電溶法結果，文獻中之電溶法細胞溶解主要樣品 為紅血球細胞，而紅血球細胞並無細胞壁且細胞較大（較容易接觸到微流道中之 微電極），相對的地較容易在微流體晶片中進行細胞溶解；本研究所使用之大腸 桿菌尺寸較小且有細胞壁，要提高其溶解效率之難度較高。

表1 微流體中各種細胞溶解方法比較 細胞溶解成功率(%)

方法 暴露時間

（秒） 哺乳類 細菌

輸出速率

（Hz） 參考文獻 熱能法 120 - - - Savla et al., 1998;

He et al., 2001 超音波法 10~60 21~

75.9 63 - Marentis et al., 2005;

Belgrader et al., 1999 化學法 180 - - - Liu et al., 2005

電溶法 0.005~

1.32 71~81 - 1~10⁶

Lu et al., 2005;

McClain et al., 2003;

Xia et al., 2005;

Ikeda et al., 2007 微篩法 - 99 - 2 Carlo et al., 2003 雷射法 10^-6~240 75 56~

99.8 ＜0.1

He et al., 2005;

Dhawan et al., 2006;

Hofmann et al., 2005 電溶法 ＜0.001 - 96.5 14 本研究

進一步比較文獻中使用電溶法進行細胞溶解之電壓條件與電極區之暴露路 徑長短，如表2 所示。本研究與文獻中之研究同樣使用 40 伏特電壓進行細胞溶 解（Lu et al., 2005; Lee and Cho, 2007），文獻中之研究以 40 伏特進行紅血 球細胞溶解之成功率小於 60％，而本研究以六道微電極進行細胞溶解成功率為 96.5％；文獻中之紅血球細胞在電極區之暴露路徑為 40 μm，而本研究之之暴露 路徑為10 μm。因此，本研究之結果較文獻所報導的結果更佳。

表2 與文獻中電溶法溶解細胞之效率比較 方法 細胞 細胞大小

（μm）

暴露路徑

（μm）

成功率

（%） 參考文獻 電溶法 紅血球 6~8 40 2 <60 Lee and

Cho, 2007 電溶法 大腸桿菌 0.5~3 10 96.5 本研究

四、 結論

本研究將微生物有效的封裝於微水珠中並分散於油相，可有效防止微生物細 胞溶解後造成交叉污染的情況；本研究並利用六道微小電極，成功地將細胞溶解 成功率提升到 96.5％。除此之外，處理速率可達到 14 Hz 以上。目前，本研究 結果已超越國際間所有文獻所記載之快速細菌細胞溶解之成果。這項成果是繼油 相流體動態聚焦與高穩定高均一度微水珠的產生後，再次奠定了流式質體儀的研 究開發基礎。流式質體儀之開發完成也可提供環境微生物與微生物生態學領域一 個可以快速鑑定微生物之技術平台。

五、誌謝

感謝行政院國家科學委員會透過一般型專題研究計畫對本研究之資助（NSC 99-2221-E-005-036-MY2）。

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