四機四 D 4970H133 鄭柔柔
蛋白質中的夜明珠——
綠色螢光蛋白
英文名稱：（green fluorescent protein,GFP）
定義：從水母(Aequorea victoria)體內發現的發光蛋白。分子品質為26kDa，由238 個氨基酸構成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成發光團，是主要發光的位置。
其發光團的形成不具物種專一性，發出螢光穩定，且不需依賴任何輔因數或其他 基質而發光。
綠色螢光蛋白就是一種酵素，他在和鈣離子結合之後，會造成螢光素（luciferin）
的氧化，因而釋放能量，產生螢光。
基本介紹：
綠色螢光蛋白分子的形狀呈圓柱形，就像一 個桶，負責發光的基團位於桶中央，因此，綠色螢 光蛋白可形象地比喻成一個裝有色素的“油漆 桶”。裝在“桶”中的發光基團對藍色光照特別敏 感。當它受到藍光照射時，會吸收藍光的部分能 量，然後發射出綠色的螢光。利用這一性質，生物 學家們可以用綠色螢光蛋白來標記幾乎任何生物 分子或細胞，然後在藍光照射下進行顯微鏡觀察。
發現者：
20 世紀 60 年代，一位日本科學家從美國西岸打撈了大量發光水母，帶 回位於華盛頓州的實驗室進行研究。這些水母在受到外界的驚擾時會發出 綠色的螢光，這位科學家希望找到這種水母的螢光素酶。然而，經過長期
的重複努力，居然毫無收穫。他大膽地假設，這種學名叫 Aequorea victoria 的水母能發光也許並不是常規的螢光素/螢光素酶原理。他想，可能存在有 另一種能產生螢光的蛋白。此後，他進行了更多的實驗，終於搞清楚了這 種水母的特殊發光原理。原來，在這種水母的體內有一種叫水母素的物質，
在與鈣離子結合時會發出藍光，而這道藍光未經人所見就已被一種蛋白質 吸收，改發綠色的螢光。這種捕獲藍光並發出綠光的蛋白質，就是綠色螢 光蛋白。這位日本科學家也因為這項發現，獲得了剛剛頒發的諾貝爾化學 獎，他就是日本科學家下村修。
綠色螢光蛋白有什麼用呢？
螢光蛋白可分成食用性的天然藻蛋白和實驗用的螢光蛋白。最早被應用在基礎醫 學研究的追蹤顯像劑，後來則被廣泛應用到胚胎發育及器官發生學、轉殖動植物 研究、食品添加劑、甚至於有機二極體的製程應用上。
生物技術中的應用研究 1〃分子標記
作為一種新型的報告基因，GFP 已在生物學的許多研究領域得到應用。
利用綠色螢光蛋白獨特的發光機制，可將 GFP 作為蛋白質標籤(protein tagging)，即利用
DNA 重組技術，將目的基因與 GFP 基因構成 融合基因，轉染合適的細胞進行表達，然後借 助螢光顯微鏡便可對標記的蛋白質進行細胞 內活體觀察。由於 GFP 相對較小，只有 238 個氨基酸，將其與其他蛋白融合後不影響自身 的發光功能，利用 GFP 的這一特性已經加深 了我們對細胞內一些過程的瞭解，如細胞分 裂、染色體複製和分裂，發育和信號轉導等。1996 年，Ehrdardt 等人首次報 導了利用 GFP 的特性研究細胞分化蛋白 FtsZ 的定位。研究顯示 FtsZ 在細胞 分裂位元點形成了一個環狀物，且至少有 9 種蛋白在細胞分裂中起重要作 用，儘管對這些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用 GFP 融合蛋白已經搞 清楚了它們聚合的順序以及在蛋白定位中的一些特徵。利用 GFP 來檢測目 標蛋白的定位已為我們提供了一種對細胞內的一些基本的生理過程進行更 詳盡觀察的新方法。
除用於特定蛋白的標記定位外，GFP 亦大量用於各種細胞器的標記如 細胞骨架、質膜、細胞核等等。Shi 等人曾報導將 GFP 融合到大腸桿菌細胞 膜表面用作標記蛋白，這一技術將有助於提高多肽庫的篩選效率、疫苗的 研製、構建細胞生物感測器用作環境檢測以及探測信號轉導過程等等。這 些都為傳統生物學研究提供了新思路和新方法，成為交叉學科研究的熱點。
GFP 標記的微管
2〃藥物篩選
許多新發展的光學分析方法已經開始利用活體細胞來進行藥物篩選，
這一技術能從數量眾多的化合物中快速篩選出我們所感興趣的藥物。基於 細胞的螢光分析可分為三類：即根據螢光的密度變化、能量轉移或螢光探 針的分佈來研究目標蛋白如受體、離子通道或 酶的狀態的變化。螢光
探針分佈是利用信號傳導中信 號分子的遷移功能，將一螢光蛋白 與信號分子相偶聯，根據螢光蛋白 的分佈情況即可推斷信號分子的 遷移狀況，並推斷該分子在遷移中 的功能。由於 GFP 分子量小，在 活細胞內可溶且對細胞毒性較 小，因而常用作螢光探針。
在細胞體內分子之間的相互 作用非常複雜，其中很多涉及到信 號分子在細胞器之間的遷移。例如當信號分子和某一特殊受體結合後常會 導致配體-受體複合物從某一細胞區域遷移到另一區域，而這一遷移過程通 常會介導一重要的生理功能。因而，這些受體常常被用作藥物篩選的目標，
若某一藥物具有與信號分子類似的功能，那麼該藥物即具有潛在的醫藥價 值。利用 GFP 螢光探針，將很容易從數量眾多的化合物中判斷出哪些化合 物具有與信號分子相似的能引起配體一受體複合物遷移並介導生理反應的 功能，且這一篩選過程簡單方便，所需成本也很低。利用這一原理，已經 成功構建了一個篩選模型用於研究藥物介導的糖皮質激素受體(hGR)的遷移 過程。在一 96 孔板中培養細胞，並以一編碼 hGR GFP 蛋白的質粒轉染該細 胞。當細胞用待篩選的藥物處理後， hGR-GFP 從細胞質遷移人細胞核的過 程可即時或在某一時段內被證實，根據螢光分佈即可推斷哪一種藥物具有 與 hGR 配體相類似的功能。利用 GFP 來進行藥物篩選由於受其必頇與遷移 的信號分子相偶聯，其篩選容量相對較低，但是由於 GFP 在細胞內的穿透 性強及獨特的發光機制，因而在藥物篩選中具有相當大的應用潛力。
3〃融合抗體
近二十年來，抗體生成技術有了飛速發展，已經從細胞工程抗體(雜交 瘤技術一單克隆抗體)發展到了第三代抗體：基 因工程抗體，尤其是噬菌體抗體庫技術的出 現，解決了人源抗體的研製問題，促進了各種 性能優良抗體以及具有多種功能的抗體融合 蛋白的開發。單鏈抗體(Single-chain v
c 為藥物篩選的 GFP
線粒體中表達的 GFP
ariable fragment，ScFv)是研究得較多的一種小分子抗體，其優越陛在於可 在宿主細胞內大量表達，易於基因工程操作，尤其易於構建抗體融合蛋白。
近年來，關於綠色螢光蛋白融合單鏈抗體的報導很多，國內也有相關報導，
如程虹等報導將抗肝癌單鏈雙功能抗體融合 GFP 真核表達載體並導人小鼠 成纖維細胞 NIH3T3 表達並獲得成功。因融合抗體具有與抗原結合及發射螢 光兩種特性，故這一人工分子可用做免疫染色的檢測詴劑，直接應用於流 式細胞儀和免疫螢光的標記及腫瘤的檢測等等。
由於技術上的的原因，一般融合抗體均置於原核表達系統如 E.coli 中表 達。為便於表達蛋白的分離純化，一般在單鏈抗體的 N 端或 C 端插入一 6×His 序列，便於用 Ni-NTA 親和層析柱純化目標蛋白。但這一技術也存在一些問 題。由於抗體分子記憶體在二硫鍵，而在原核表達系統內由於抗體不能正 確折疊，容易形成包涵體，表達出來的目標蛋白無活性，需要在氧化還原 體系中進行複性。但近來也有報導在動物細胞 細胞質中成功表達出具有抗 原結合活性的單鏈抗體。若能成功解決融合抗體的表達問題，則在免疫染 色及腫瘤檢測這一領域融合抗體將扮演極為重要的角色。
4〃生物感測器
蛋白質工程技術已經開始採用將一具有信號傳導功能分子識別位元點 的分子結合到另一分子上來設計生物感受器。綠色螢光蛋白由於其獨特的 光信號傳導機制，以及在表達後易被周圍化學環境和蛋白之間的相互作用 所影響的特性，因而極適於用做活細胞體內的光學感受器。第一個基於 GFP 的生物感受器為 Ca2+感受器，由 Romoser 和 Miyawaki 幾乎同時提出。這一
感受器原理是利用鈣調蛋白結 合鈣離子後引起的空間構象變 化導致兩種 GFP 突變體間發生 螢光共振能量轉移。但是由於大 多數蛋白不能像鈣調蛋白那樣 承受較大的空間構象變化，為克 服這一缺點，人們開始提出利用 基因融合技術將一新的分子識別位點結合到 GFP 上以構建新的分子感受 器。Doi 和 Yanagawa 根據這一原理將 TEM1 β -內醯胺酶(Bla)融合到 GFP 上。
當缺少目標分子時，GFP 處於靜止狀態不會產生螢光。但是當目標分子 β - 內醯胺酶抑制蛋白(BLIP)與 Bla 結合後，即使 GFP 活化產生螢光，而這一變 化很容易被檢測到。將受體蛋白插入到 GFP 表面的技術已經成為構建分子 感受器的有力工具，這種 GFP 感受器能被用來檢測多種分子，如蛋白質、
核酸、激素、藥物、金屬及其他的一些小分子化合物等，其潛在應用前景 極為廣闊。
GFP 在植物研究中的應用
GFP 在腫瘤發病機制研究中的應用
GFP 是一個分子量較小的蛋白，易與其他一些目的基因形成融合蛋白 且不影響自身的目的基因產物的空間構象和功能。 GFP 與目的基因融合，
將目的基因標記為綠色，即可定量分析 目的基因的表達水準，顯示其在腫瘤細 胞內的表達位置和量的變化，為探討該 基因在腫瘤發生、發展中的作用及其分 子機制提供便利條件。
在腫瘤的形成過程中，增殖和凋亡 是一對相互矛盾的統一體。若腫瘤細胞 凋亡佔優勢，腫瘤組織將長期處於休眠 狀態或自行消亡。腫瘤細胞的凋亡受凋亡相關基因調控。用 GFP 轉染腫瘤 細胞凋亡相關基因，並與正常組織進行比較，則大致可判斷此基因為抑制 腫瘤細胞凋亡的基因；反之，為促進腫瘤細胞凋亡的基因。
腫瘤細胞浸潤是腫瘤細胞粘連、酶降解、移動和基質內增殖等一系列 過程的表現，其根本原因在於腫瘤細胞內某些基因表達異常。利用 GFP 的 示蹤特性，研究腫瘤細胞內某些基因異常表達與腫瘤細胞浸潤的關係，即 可揭示腫瘤細胞浸潤的某些機制。
最近 , 有學者用 GFP 依賴的生物感測器測量活細胞內生化動力學 , 通過利用帶有 GFP 標記的蛋白激酶 A 轉染細胞 , 觀測有關 cAMP 的動 態螢光變化 。通過融合藍色螢光 GFP 到調節亞單位或融合綠色螢光 GFP 到 PKA 的催化亞單位 , 設計出了 cAMP 感測器。當 cAMP 濃度很低時 , 兩個螢光分子距離很近 , 並出現 FRET , 如果增加 cAMP 濃度 , 發生 FRET 的可能性急劇下降。利用該方法 , 可以檢測出 cAMP 的動態變化 , 並開創了在整體條件下 , 研究 cAMP 調節信號轉導途徑的新方法。
GFP 的結構雖然具有高度完整性 , 但是實驗中發現 , 在 GFP 中某 些確定的位置 , 插入外源基因 , 完全沒有喪失其螢光性。當把 CaM 插入 黃色螢光 GFP 突變體中 , 得到 Ca 2+ 感測器 , 當 Ca 2+ 結合到 CaM 上 , 導致生色團去質子化 , 使螢光強度增加 7 倍。當在黃色螢光 GFP 中 插入一個 Zif268 鋅指結構 , 可以得到傳導 Zn 2+ 的 GFP , 結果發現螢 光少量增加 , 為改變前的 1.7 倍 , K d 值約 0. 4mmol 。插入外源基因致 使 GFP 螢光敏感性增強的現象 , 提供了一個獲取永久編碼感測器去監測 細胞信號轉導的新路徑。
光伏發電
瑞典研究人員不再盯著植物作為樣板，轉而將目光投向擁有高超光伏 轉化能力的水母，開發出提升收穫太陽能的技術。利用水母身上提取的綠 色螢光蛋白（GFP），該小組製作的裝置可用這些“黏黏綠”將紫外光轉化
將綠黃紅螢光蛋白質植入魚的 DNA 分子結構中
為自由電子。該小組製造的電池由在二氧化矽基底上被一個小縫隔開的兩 個簡單的鋁電極組成，GFP 置於兩電極中間並起連接作用。當把紫外光放 進來的時候，GFP 不斷將光子抓走，並產生電子進入電路產生電流。同時，
GFP 非常廉價，不需要昂貴的添加劑或昂貴的加工，此外，它還能被封裝 成獨立的不需要外光源的燃料電池。科學家相信，此能源裝置縮小後可用 來驅動微小的納米設備。
參考資料：
http://baike.baidu.com/view/957211.htm
http://nature.edu.tw/rchild/classroom3/4?page=42
http://bioinfo.nchc.org.tw/personal/uploadpic/9808-09.pdf
