小 GTP 結合蛋白 rab3B 和 rab3C 在牛嗜鉻性細胞中生理功能的
研究
THE MOLECULAR CLONING AND CHARACTERIZATION OF TWO SMALL GTP- BINDING PROTEINS IN BOVINE ADRENAL MEDULLA CHROMAFFIN CELLS
中文摘要
Ras-like 的小分子 GTP 結合蛋白(G 蛋白)在過去幾年中的研究已經迅速地蓬 發展。這些分子量在 20-30KDa 之間的 G 蛋白, 有著不同的生理功能。包括 控制細胞的增生, 訊息傳導物質的釋放和運輸等。為了得知 rab3 小 G 蛋 白的生理功能, 我們利用 rab3 基因序列相同的部分當做探針, 在牛腎上腺 髓質嗜鉻性細胞的 cDNA 基因庫中, 篩選到 rab3B 和 rab3C 的 cDNA。而且 這 兩個 cDNA 已經送入大腸桿菌中表現出各別的蛋白質而且這兩種蛋白質可以 分別和 GTP 結合。此外, 我們還得到兩種專一性非常高的抗體, 分別對
抗 rab3B 第 199 到 218 個胺基酸和 rab3C 第 207 到 226 個胺基酸。因為這二個 小 G 蛋白在這個區域胺基酸序列差異最。利用這兩種抗體,我們也在北方 點漬法的結果看出 rab3B mRNA 廣布於很多組織中, 最主要的為腎上腺髓 質, 而在胰臟中則沒有發現。同時透過免疫細胞、組織化學染色法及西方 點漬法等技術, 來分析這兩種蛋白在嗜鉻性細胞和 PC12 細胞中的分佈情形
。在嗜鉻性細胞中, rab3B 在細胞膜及內質網上只有少量的表現。Rab3C 蛋 白表現量則顯然比 rab3B 要多, 且集中在細胞膜、分泌兒茶酚胺的顆粒膜 上及細胞液中, 但是在內質網中則沒有存在。 而在另一個神經細胞模型 PC12 中 ,rab3B 及 rab3C 的表現都不高,細胞受到 adenosine agonist
CGS21680 或 cAMP 類化物如 dbcAMP 刺激時, 此時 rab3C 蛋白表現會隨之增 高, 而 rab3B 蛋白量則沒有明顯的變化。此外, 在處理 NGF 的 PC12 細胞中, 可以在 neurite 末端觀察到 rab3C 的表。未來, 我們利用目前已製備完 成的工具(包括抗體、CDNA 及 mutant 等)來繼續探討這二種小 G 蛋白的生理 功能。
英文摘要
To study the physiological functions of two small GTP-binding proteins, rab3B and rab3C, we have isolated cDNA clones of these two genes from a bovine adrenal medulla cDNA library.
Recombinant proteins of these cDNA clones were expressed in Escherichia coli using a GST-expression system. Polyclonal antibodies against synthetic polyptides containing the
hypervariable domains of rab3B (amino acid 199-218) and rab3C (amino acid 207-226) were generated. We have used these
antibodies to investigate the localization and subcellular distribution of rab3B and rab3C in bovine adrenal chromaffin cells and PC12 cells by immunocytochemical staining and immunoblot analysis. In chromaffin cells, rab3B was present in the plasma membrane and endoplasmic reticulum (ER) fractions.
On the other hand, rabeC appeared in the plasma membrane, granule and cytosol fractions, but not in the ER fraction . In pc12 cells, only a very low level of rab3B was found.
Stimulation of PC12 cells with NGF or an A2a-selective agonist (CGS21680) did not result in any significant change in the amount of rab3B protein. In contrast the rab3C protein level
was increased by CGS 21680 and a cAMP analog (dibutyry -cAMP).
Furthermore, rab3C was localized in the neurite terminal of the NGF- treated cells. We have also examined the tissue
distribution of rab3B. Northern blot analysis indicated that rab3B is widely distributed in many tissues, except in pancreas. Among all of the tissues tested, rab3B is most abundant in adrenal medulla. In the future, our ultimate goal is to study the functions of rab3B and rab3C in neuronal cells using the molecular tools we have developed.
