松杉靈芝活性成分之研究 Study antioxidant activity of constituents from Ganoderma tsugae

國立台東大學生命科學系 碩士論文

指導教授：魏百祿 博士

松杉靈芝活性成分之研究

Study antioxidant activity of

constituents from Ganoderma tsugae

研究生：陳彥廷 撰

中華民國一百零一年七月

誌謝

在這段漫長求學的日子，看似很漫長實則如過眼雲煙轉瞬即逝。在這過程中 我的人生面臨到很大的轉捩點，這些打擊讓我在研究上失去了動力甚至有想放棄 的念頭。看見著班上同學一個接一個畢業，而我卻還在原地踏步，這些日子真的 很煎熬也很漫長。

首先要感謝我的指導教授魏百祿老師，從入學的暑假一直到畢業的暑假，整 整四年寒暑假從未間斷的辛勤教導，並感謝在他的安排之下讓我有機會到高雄醫 學大學林忠男老師的實驗室做研究。在高醫這段日子真的很感謝林忠男老師的照 顧，在研究過程中他總是給予我很大的幫助，也很熱心的教導我實驗的技巧，在 老師的指導下我學會了天然物的分離及合成的技巧，讓我在研究的過程中順利許 多；在我人生最無助的時候感謝林忠男老師拉了我一把，要不是您給予我的幫忙 我想我今天一定沒辦法順利畢業，心裡真的有無數的感謝！

論文的審查，要特別感謝高雄醫學院林忠男教授及柯宏慧副教授，還有指導 老師魏百祿教授，對於論文嚴謹的審查提供寶貴的意見及熱心的指導，使本論文 能夠更完整。儀器分析上，核磁共振光譜感謝王琪佳學姐的全力幫忙，對於她敬 業的精神表示敬意。

在高醫這段日子以來，感謝藥化科室的伙伴們，林凱偉、鄭人豪(豪哥)、涂 皇堯學長，王雅婷、邱淑燕學姐，及台東大學的同學吳欣諭、林以婷、貢丸、盧 泯任。感謝大家的陪伴及鼓勵，讓我克服困難完成學業，在此由衷感謝。特别感 謝凱偉學長，不論是在實驗上或是生活雜事都幫助我很多，這四年真的很感謝你 不厭其煩的幫忙我。

最後感謝我的家人及支持我的親戚們，謝謝你們沒有放棄我如果不是你們一 直以來的包容及支持，我想今天我也不能順利的畢業。

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松杉靈芝活性成分之研究

作者:陳彥廷

系所：國立台東大學生命科學系

摘要

本次研究從松杉靈芝子實體氯仿層中分離出兩種新 lanostanoids 類型的

三萜類化合物，分別為 3α-acetyl-5α-lanosta-22-oxo-8,24-dien-21-oic acid 命 名為 G.C 2 (1) 及 3-oxo-5α-lanosta-22-6,8.24(24')-trien-21-oic acid 命名為

G.C 3 (2)，其結構之鑑定利用光譜分析並與過去的文獻做比對。將本次分 離出之兩個新的化合物及過去所分離出之 Tsugaric acid A (3) ，3α-hydroxy -lanosta-8,24-dien-21 oic acid (4) 及 3α-oxo-5α-lanosta-8,24-dien-21 oic acid

(5) 。在活性試驗中進行抗氧化活性測試，將化何物 1-5 進行 1,1-diphenyl -2-picrhydrazyl (DPPH) ， 2',2'-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) 及 xanthine oxidase (XO) 三種抗氧化活性試驗。在 DPPH 清除 活性試驗中，化合物 1-5 皆沒有清除自由基之活性；在 ABTS 清除活性試 驗中，化合物 1-5 皆沒有清除活性； XO 活性抑制試驗中，化合物 3 及 5 在 高濃度中有不錯的抑制能力，其 IC₅₀ 值分別為 177.7 ± 3.58 μM 及 117.83 ± 2.07 μM 。

關鍵詞: 松杉靈芝、抗氧化、XO

Study antioxidant activity of constituents from Ganoderma tsugae

Author:Yen-Ting Chen

Abstract

In this study isolated two new lanosta-type triterpene compounds from

Ganoderma tsugae CHCl

₃ fraction. The two new compounds were

3α-acetyl-5α-lanosta-22-oxo-8,24-dien-21-oic acid, named G.C 2 (1), and 3-oxo-5α-lanosta-22-6,8.24(24')-trien-21-oic acid named G.C 3 (2). The structures were characterized by spectroscopic methods and compaired with literature. The antioxidant activities of triterpenoids G.C 2 (1), G.C 3 (2), Tsugaric acid A (3), 3α-hydroxy-5α-lanosta-8,24-dien-21-oic acid (4), and 3α-oxo-5α-lanosta-8,24-dien-21-oic acid (5), have been determined by the methods of DPPH radical scavenging capacity, ABTS radical cation

scavenging activity and inhibitory activity on xanthine oxidase (XO).The results showed, in DPPH radical scavenging capacity compound 1-5 did not scavenging capacity. In ABTS radical cation scavenging activity, that 1-5 did not scavenging capacity. In high concentrations, compounds 3 and 5

displayed an inhibitory effect on xanthine oxidase(XO) activity with IC50

values of 177.7 ± 3.58 μM and 117.83 ± 2.07 μM, respectively.

keywords: Ganoderma tsugae, antioxidant, XO

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目 次

中 文 摘 要 - - - i 英 文 摘 要 - - - i i 目 次 - - - i i i 圖 表 目 次 - - - i v 第 一 章 前 言 與 研 究 動 機 - - - 1 第 二 章 成 分 之 研 究 - - - 1 7 第 一 節 松 杉 靈 芝 的 形 態 - - - 1 7 第 二 節 成 分 之 分 離 - - - 1 8 第 三 節 化 學 成 分 構 造 與 證 明 - - - 2 1 第 一 項 G . C 2 ( 1 ) 之 結 構 證 明 - - - 2 1 第 二 項 G . C 3 ( 2 ) 之 結 構 證 明 - - - 3 3 第 三 章 實 驗 部 份 - - - 4 9 第 一 節 儀 器 與 材 料 - - - 4 9 第 二 節 生 物 活 性 試 驗 - - - 5 3 第 四 章 結 果 與 討 論 - - - 5 8 第 五 章 化 合 物 物 理 化 學 性 質 - - - 6 6 第 六 章 參 考 文 獻 - - - 6 8

圖 表 目 次

圖 一 自 由 基 代 謝 路 徑 - - - 3 圖 二 自 由 基 及 活 性 氧 對 生 理 之 影 響 - - - 6 圖 三 t s u g a r i c a c i d A 結 構 - - - 1 3 圖 四 t s u g a r i c a c i d B 結 構 - - - 1 3 圖 五 t s u g a r i o s i d e B 結 構 - - - 1 4 圖 六 3α - a c e t o x y - 5 α - l a n o s t a - 8 , 2 4 - d i e n - 2 1 - o i c a c i d e s t e r β -d- g l u c o s i d e 結 構 - - - 1 4 圖 七 3 - o x o - 5α - l a n o s t a - 8 , 2 4 - d i e n - 2 1 - o i c a c i d 結 構 - - - 1 5 圖 八 松 杉 靈 芝 形 態 - - - 1 7 圖 九 松 杉 靈 芝 成 分 分 離 流 程 - - - 1 9 圖 十 松 杉 靈 芝 分 離 出 之 新 化 合 物 之 結 構 - - - 2 0 圖 十 一 G . C 2 ( 1 ) 紅 外 線 光 譜 ( I R ) - - - 2 4 圖 十 二 G . C 2 ( 1 ) E I - M S 圖 譜 - - - 2 5 圖 十 三 G . C 2 ( 1 ) 氫 光 譜 (¹H - N M R ) - - - 2 6 圖 十 四 G . C 2 ( 1 ) 碳 光 譜 (^{1 3}C - N M R ) - - - 2 7 圖 十 五 G . C 2 ( 1 ) D E P T 光 譜 - - - 2 8 圖 十 六 G . C 2 ( 1 ) C O S Y 光 譜 - - - 2 9 圖 十 七 G . C 2 ( 1 ) C O S Y 放 大 光 譜 - - - 3 0 圖 十 八 G . C 2 ( 1 ) H M B C 光 譜 - - - 3 1 圖 十 九 G . C 2 ( 1 ) H M B C 放 大 光 譜 - - - 3 2

v

圖 二 十 G . C 3 ( 2 ) 紅 外 線 光 譜 ( I R ) - - - 3 6 圖 二 十 一 G . C 3 ( 2 ) E I - M S 圖 譜 - - - 3 7 圖 二 十 二 G . C 3 ( 2 ) 氫 光 譜 (¹H - N M R ) - - - 3 8 圖 二 十 三 G . C 3 ( 2 ) 碳 光 譜 (^{1 3}C - N M R ) - - - 3 9 圖 二 十 四 G . C 3 ( 2 ) D E P T 光 譜 - - - 4 0 圖 二 十 五 G . C 3 ( 2 ) C O S Y 光 譜 - - - 4 1 圖 二 十 六 G . C 3 ( 2 ) C O S Y 放 大 光 譜 - - - 4 2 圖 二 十 七 G . C 3 ( 2 ) H M Q C 光 譜 - - - 4 3 圖 二 十 八 G . C 3 ( 2 ) H M Q C 放 大 光 譜 - - - 4 4 圖 二 十 九 G . C 3 ( 2 ) H M B C 光 譜 - - - 4 5 圖 三 十 G . C 3 ( 2 ) H M B C 放 大 光 譜 - - - 4 6 圖 三 十 一 化 合 物 3 及 5 於 不 同 濃 度 下 抑 制 x a n t h i n e o x i d a s e 之 情 形 - - - 6 2

表 一 松 杉 靈 芝 l a n o s t a n o i d s 成 分 及 其 細 胞 毒 性 - - - 1 6 表 二 化 合 物 1 及 2 之 ¹H - N M R 及 ^{1 3}C - N M R 資 料 - - - 4 7 表 三 化 合 物 1 - 5 清 除 D P P H 自 由 基 之 活 性 試 驗 結 果 - - - 5 8 表 三 化 合 物 1 - 5 清 除 D P P H 自 由 基 之 活 性 試 驗 結 果 ( 續 ) - - - 5 9 表 四 化 合 物 1 - 5 清 除 A B T S 自 由 基 之 活 性 試 驗 結 果 - - - 6 0 表 四 化 合 物 1 - 5 清 除 A B T S 自 由 基 之 活 性 試 驗 結 果 ( 續 ) - - - 6 1

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第一章 前言與研究動機

1956年 哈 曼 博 士 （ Dr. Harman ） 提 出 「 自 由 基 理 論 」¹， 在 這 個 理 論 被 提 出 後 陸 續 有 許 多 科 學 報 告 指 出 ， 人 體 內 產 生 的 自 由 基 與 老 化 之 間 有 著 密 不 可 分 的 關 係 。 更 因 為 當 時 所 提 出 之 自 由 基 理 論 ， 更 多 科 學 家 投 入 自 由 基 的 研 究 ， 也 証 明 自 由 基 與 老 化 確 實 有 直 接 的 關 聯 ； 不 只 如 此 ， 自 由 基 也 與 現 在 許 多 疾 病 有 密 不 可 分 的 關 係 ， 如 老 化 、 心 血 管 疾 病 、 巴 金 森 氏 症 及 國 人 十 大 死 因 榜 首 的 癌 症，這 些 疾 病 都 是 因 為 自 由 基 所 引 起²，因 此，瞭 解 自 由 基 對 體 內 分 子 所 造 成 之 傷 害 在 疾 病 的 發 展 與 預 防 上 是 相 當 重 要 的 一 個 研 究 方 向 ； 既 然 自 由 基 的 存 在 與 我 們 生 活 習 習 相 關 ， 那 更 要 去 認 識 自 由 基 。

自 由 基 ( free radicals ) 是 指 含 有 一 個 或 多 個 不 成 對 電 子 而 獨 立 存 在 之 原 子、分 子 或 離 子³；換 言 之 也 就 是 含 有 奇 數 電 子 之 化 學 單 元 ， 都 可 稱 之 為 自 由 基 。 不 同 型 態 的 自 由 基 其 化 學 反 應 差 異 相 當 大 ， 而 大 部 分 的 自 由 基 皆 是 處 於 較 不 穩 定 的 狀 態 ， 與 非 自 由 基 分 子 做 比 較 ， 易 與 其 他 分 子 發 生 反 應 ； 換 言 之 自 由 基 是 因 為 電 子 量 不 平 衡 ， 因 此 容 易 去 搶 別 人 的 電 子 來 讓 自 己 平 衡 ， 所 以 很 容 易 就 會 與 別 的 分 子 發 生 反 應 因 此 ， 被 搶 電 子 的 分 子 也 處 於 電 子 量 不 平 衡 ， 導 致 不 穩 定 的 狀 態 也 會 去 搶 別 人 的 電 子 讓 自 己 平 衡 ， 所 以 會 形 成 一 連 串 的 連 鎖 反 應 。 活 性 氧 ( reactive oxygen species：

ROS )， 廣 義 的 活 性 氧 為 含 氧 高 的 反 應 極 性 分 子 ， 許 多 活 性 氧 亦

屬 於 自 由 基 ， 由 於 自 由 基 與 活 性 氧 的 反 應 性 非 常 好 ， 幾 乎 所 有 的 生 物 分 子 都 能 被 氧 化 或 修 飾 。 通 常 自 由 基 和 活 性 氧 會 經 由 生 物 性 ( 體 內 )和 環 境 性 ( 體 外 )過 程 產 生 ， 並 引 起 連 鎖 反 應 而 形 成 更 多 的 自 由 基⁴。

(一 )自 由 基 的 來 源 ， 大 致 可 分 為 生 物 性 來 源 及 環 境 性 來 源 兩 種 ：

(1) 生 物 性 來 源 ︰

生 物 體 在 正 常 好 氧 性 呼 吸 的 作 用 下 ， 氧 氣 自 粒 線 體 的 電 子 傳 遞 鏈 、 微 粒 體 細 胞 色 素 P-450或 其 他 系 統 ， 經 由 連 續 的 步 驟 接 受 四 個 電 子 和 四 個 氫 原 子 而 還 原 成 水 ， 在 此 過 程 中 電 子 的 轉 移 會 依 序 產 生 超 氧 陰 離 子 ( O2.- ) 、 過 氧 化 氫 ( H2O2 ) 和 氫 氧 自 由 基 ( ． OH ) 反 應 過 程 如 (圖 一 )。 此 外 ， 一 些 較 為 複 雜 的 代 謝 反 應 及 生 化 合 成 作 用 亦 會 產 生 其 他 自 由 基⁵。 除 了 一 些 代 謝 反 應 外 生 活 緊 張 或 是 壓 力 過 大 會 使 體 內 產 生 自 由 基 。

(2) 環 境 性 來 源 ︰

介 由 外 在 環 境 所 產 生 的 自 由 基 。 主 要 包 括 空 氣 污 染 、 抽 煙、UV 照 射、離 子 輻 射 及 暴 露 於 化 學 物 質 中。工 廠 排 放 之 廢 氣 及 汽 機 車 所 排 出 之 氣 體 造 成 空 氣 污 染 ， 若 長 期 暴 露 在 此 環 境 下 亦 會 產 生 許 多 自 由 基 ， 造 成 體 內 疾 病 的 發 生 率 提 高⁶。 日 常 生 活 中 ， 攝 取 過 多 食 品 添

3 

 

SOD ( superoxide dismutase)

H₂O₂

Catalase

加 物 、 過 度 加 工 之 產 品 、 燒 烤 及 高 脂 肪 食 物 ， 或 是 亂 服 用 藥 物 等 ， 都 會 造 成 自 由 基 的 產 生⁷。

   

   

         

   

                   

圖 一 自 由 基 代 謝 路 徑  

 

三 重 態 氧 分 子

過 氧 化 氫

氫 氧 自 由 基

超 氧 陰 離 子

O₂^-

H₂O₂

H2O^＋O2

GPX ( glutathione peroxidase)

H₂O^＋GSSG (glutathione)

  當 細 胞 暴 露 於 活 性 氧 及 自 由 基 下 ， 在 細 胞 內 及 細 胞 外 的 主 要 組 成 分 ， 蛋 白 質 、 酵 素 、 醣 類 、 脂 質 、DNA 和 RNA 都 是 活 性 氧 和 自 由 基 主 要 的 攻 擊 目 標 ⁸ 。

(二 )自 由 基 及 活 性 氧 對 生 物 體 分 子 之 傷 害 ：

(1) 對 脂 質 傷 害 ：

脂 質 和 脂 蛋 白 的 不 飽 和 脂 肪 酸 ， 容 易 因 自 由 基 作 用 引 起 氧 化 。 人 體 內 ， 細 胞 膜 上 不 飽 和 脂 肪 酸 的 氧 化 是 最 常 發 生 。 氫 氧 自 由 基 的 產 量 過 多 ， 容 易 引 起 細 胞 膜 的 脂 質 氧 化 。 多 元 不 飽 和 脂 肪 酸 受 到 自 由 基 攻 擊 後 會 產 生 脂 質 自 由 基 ， 氧 會 與 這 些 脂 質 自 由 基 反 應 形 成 過 氧 化 自 由 基 及 氫 過 氧 化 物 ， 這 些 過 氧 化 物 會 繼 續 行 連 鎖 反 應 ， 導 致 細 胞 膜 的 損 傷 ^8,9。 許 多 研 究 顯 示 ， 活 性 氧 及 脂 質 過 氧 化 物 在 許 多 疾 病 、 癌 症 及 老 化 上 扮 演 著 相 當 重 要 的 角 色 。

(2) 對 DNA傷 害 ：

在 人 體 內 ， 自 由 基 最 主 要 的 攻 擊 目 標 為 DNA。 氫 氧 自 由 基 ( ． OH ) 攻 擊 DNA 會 造 成 多 種 化 學 性 的 改 變 ， 亦 會 攻 擊 所 有 DNA 的 組 成 ， 而 造 成 DNA 鹼 基 之 修 飾 、 交 叉 聯 結 ( cross-linking )、 DNA 鹼 基 與 蛋 白 質 結 合 及 DNA 股 斷 裂 等¹⁰。 在 1984 年 首 度 發 表 之 論 文 提 到 8-hydroxyl-2'- deoxyguanosine (8-OH-dG) ， DNA 上 2′- dG的 C-8 位 置 上 受 到 氫 氧 自 由 基 攻 擊 ， 氧 化 傷 害 生 成 8-OH-dG 其 產 物 會 在 DNA 的 模 板 上 引 起 miscode ， 造 成 G→T 和

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A→C 配 對 錯 誤，使 得 DNA 複 製 及 合 成 時 發 生 misreading 進 而 引 發 突 變 及 癌 化 等 現 象 發 生 。 在 研 究 中 發 現 多 種 疾 病 如 巴 金 森 氏 症 、 阿 茲 海 默 症 、 糖 尿 病 、 癌 症 、 肝 炎 及 類 風 濕 關 節 炎 等 疾 病 的 組 織 中 皆 可 發 現 8-OH-dG 含 量 上 升。因 此，8-OH-dG 常 作 為 組 織 氧 化 傷 害 及 罹 癌 風 險 的 指 標^11,12。 (3) 對 蛋 白 質 傷 害 ：

蛋 白 質 被 氧 化 的 狀 態 下 ， 其 氨 基 酸 殘 基 會 受 到 多 種 的 氧 化 修 飾 ， 如 蛋 白 質 羥 基 的 形 成 。 蛋 白 質 經 常 與 過 渡 金 屬 離 子 結 合 ， 因 此 過 氧 化 氫 ( H2O2 ) 會 在 蛋 白 質 的 特 定 位 置 上 形 成 氫 氧 自 由 基 (． OH ) ， 這 樣 會 使 蛋 白 質 成 為 被 攻 擊 的 目 標¹³。蛋 白 質 在 幅 射 的 照 射 下 及 有 氧 的 環 境 中，也 會 進 行 連 鎖 的 氧 化 反 應 ， 導 致 細 胞 中 的 自 由 基 會 以 倍 數 量 增 加 ， 造 成 細 胞 的 損 傷 嚴 重 會 使 細 胞 死 亡¹⁴。

含 氧 自 由 基 對 生 物 體 細 胞 及 分 子 之 傷 害 與 許 多 疾 病 有 著 密 不 可 分 的 關 係，其 自 由 基 及 活 性 氧 對 生 理 之 危 害 之 關 聯 如 ( 圖 二 ) 所 示 。 因 此 ， 瞭 解 自 由 基 與 疾 病 之 間 的 作 用 關 係 ， 便 能 有 效 防 止 疾 病 的 發 生 達 到 預 防 的 作 用 ， 不 管 對 於 醫 學 或 是 人 們 都 是 很 重 要 的 發 現

變 性 產 物

老 化

鹼 基 結 構 改 變

DNA 斷 裂

癌 症 ( Cancer )

圖 二 自 由 基 及 活 性 氧 對 生 理 之 影 響

 

活 性 氧 或 自 由 基

脂 質 過 氧 化

細 胞 膜 失 去 功 能

擴 大 反 應

細 胞 死 亡 蛋 白 質

氧 化 作 用

氧 化 作 用

攻 擊 DNA

細 胞 突 變

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生 物 體 中 含 有 多 種 清 除 自 由 基 或 是 活 性 氧 之 抗 氧 化 物 質 。 在 人 體 中 ， 抗 氧 化 防 禦 機 制 可 依 所 在 位 置 分 為 水 相 溶 液 部 份 與 脂 溶 性 部 份。主 要 的 水 溶 性 抗 氧 化 物 則 包 括 了 抗 壞 血 酸 ( ascorbic acid ) 及 glutathione ( GSH ) 。 主 要 的 脂 溶 性 抗 氧 化 物 包 括 生 育 醇 、 ubiquinol ( coenzyme Q ) 、 及 許 多 膳 食 纖 維 衍 生 而 來 的 類 胡 蘿 蔔 素 等 。 上 述 之 水 溶 性 或 脂 溶 性 抗 氧 化 物 ， 其 作 用 原 理 都 是 基 於 還 原 反 應 ； 簡 單 來 說 ， 此 類 的 抗 氧 化 劑 本 身 非 屬 於 自 由 基 ， 當 在 體 內 清 除 自 由 基 時 還 會 有 新 的 自 由 基 產 生 ， 但 這 類 的 自 由 基 較 為 安 定 ， 並 可 經 由 其 他 的 途 徑 加 以 還 原 ， 將 產 生 的 自 由 基 還 原 成 不 具 傷 害 性 的 物 質 ， 因 此 可 以 達 到 阻 斷 連 鎖 反 應 的 作 用⁷。

(三)抗氧化劑依其不同的作用方式，可以分為四種類型：

(1) 自 由 基 終 止 型 ( Free radical terminator )：

體 內 自 由 基 產 生 過 量 會 造 成 氧 化 傷 害 ， 若 能 讓 自 由 基 無 法 產 生 ， 就 能 達 到 抗 氧 化 目 的 ， 所 以 此 類 的 抗 氧 化 劑 稱 之 為 預 防 型 的 抗 氧 化 劑 ， 能 完 全 阻 斷 自 由 基 的 產 生 。 在 日 常 飲 食 中 可 多 攝 取 含 有 黃 酮 類 成 分 的 製 品 ， 如 茶 類 飲 品 中 的 兒 茶 素 及 水 果 中 所 含 的 維 生 素C， 上 述 物 質 都 具 有 不 錯 的 抗 氧 化 能 力²；甚 至，可 以 從 一 些 市 面 上 所 販 賣 的 保 健 食 品 中 得 到 含 有 抗 氧 化 的 物 質 ， 如 葡 萄 籽 錠 等 。

(2) 氧 清 除 型 ( Oxygen scavenger )：

氧 化 反 應 中 最 重 要 也 不 可 缺 的 物 質 就 是 氧 氣 ， 此 類 抗 氧 化 劑 的 作 用 原 理 就 是 將 反 應 中 的 氧 氣 去 除 ， 反 應 中 若 缺 少 啟 動 的 因 子 就 無 法 進 行 ， 因 而 達 到 抗 氧 化 目 的 。

(3) 還 原 劑 型 ( Reducing agents )：

此 類 的 作 用 原 理 在 上 述 就 有 提 到 ， 將 會 造 成 氧 化 反 應 發 生 的 物 質 還 原 使 他 不 具 氧 化 功 能 ， 或 是 將 此 物 質 還 原 傷 害 力 較 低 的 物 質 ， 並 可 以 利 用 其 他 途 徑 加 以 還 原 ， 阻 斷 連 鎖 反 應 的 進 行 。

(4)鉗 合 劑 型 ( Chelating agents )：

在 氧 化 反 應 發 生 後 ， 若 有 金 屬 離 子 存 在 會 讓 氧 化 反 應 速 度 增 加 。 因 此 這 些 金 屬 離 子 被 形 容 為 催 化 劑 ， 並 能 夠 使 反 應 加 快 。 此 類 作 用 原 理 ， 鉗 合 這 類 金 屬 離 子 降 低 氧 化 反 應 速 率 ， 雖 可 以 降 低 反 應 速 率 ， 但 無 法 阻 止 反 應 之 進 行 。

上 述 四 種 抗 氧 化 劑 之 類 型 ， 在 許 多 科 學 論 文 中 關 於 抗 氧 化 活 性 之 測 定 ， 皆 會 測 定 其 活 性 ； 上 述 四 種 是 抗 氧 化 劑 好 與 壞 的 指 標 ， 其 活 性 越 好 也 就 代 表 抗 氧 化 活 性 越 強 。 許 多 研 究 指 出 ， 黃 酮 類 、 多 酚 及 多 醣 類 化 合 物 具 有 很 好 的 抗 氧 化 能 力 ， 並 廣 泛 存 在 植 物 中

15,16,17

。 黃 酮 類 化 合 物 抗 氧 化 能 力 取 決 於 OH 基 團 的 多 寡 ， OH 基 量 越 多 抗 氧 化 能 力 越 好，化 合 物 中 游 離 OH 基 團 中 的 氫 離 子 會 被 提 供 出 來 參 與 反 應 ， 將 被 氧 化 的 物 質 還 原 。 與 氫 離 子 是 否 具 有

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電 子 提 供 能 力 亦 有 極 大 的 關 聯^18,19。 在 文 獻 中 也 提 到 ， 若 植 物 中 的 總 酚 含 量 越 高 ， 則 抗 氧 化 的 活 性 越 好²⁰。 在 過 去 許 多 研 究 中 發 現 ， 抗 氧 化 物 質 廣 泛 存 在 於 植 物 體 中 ， 由 其 是 植 物 之 二 次 代 謝 之 產 物 經 實 驗 証 明 具 有 不 錯 的 抗 氧 活 性²⁰。 由 文 獻 的 結 果 ， 本 人 相 信 在 天 然 物 中 之 抗 氧 化 成 分 一 定 還 有 很 多 值 得 去 研 究 。

靈 芝 從 古 至 今 一 直 都 是 養 生 及 治 病 的 常 用 偏 方 ， 在 老 祖 先 的 中 醫 學 對 於 靈 芝 的 評 價 很 高 ， 稱 它 為 一 種 滋 補 強 壯 、 扶 正 固 本 的 珍 貴 藥 材 ， 在 許 多 的 藥 材 及 草 藥 中 ， 靈 芝 的 地 位 及 價 值 比 人 蔘 還 要

高 ^21,22。具 有 仙 草、長 生 不 老 草、仙 藥 及 神 奇 的 東 方 蘑 菇 等 別 名 。

中 國 最 早 的 藥 學 專 著，約 見 於 公 元 前 一 世 紀 左 右 的『 神 農 本 草 經 』，

書 中 將 靈 芝 列 為 上 品，並 記 載 其 藥 效 為：主 耳 聾，利 關 節，保 神 ， 益 精 氣 ， 堅 筋 骨 ， 好 顏 色 。 從 文 獻 結 果 顯 示 目 前 為 止 由 靈 芝 中 分 離 出 150 種 化 合 物 ， 約 可 分 為 10 大 類 ： 多 醣 、 核 苷 、 夫 喃 、 甾 醇、生 物 鹼、氨 基 酸 蛋 白、三 萜、油 脂、無 機 離 子 及 有 機 鍺 等 ²³。     靈 芝 最 常 被 用 做 民 間 用 藥 ， 大 多 用 來 治 療 肝 炎 或 是 肝 癌 。 在 許 多 研 究 文 獻 中 也 顯 示，靈 芝 具 有 降 血 糖 ²⁴、降 血 壓 ²⁵ 抗 血 小 板 凝 聚 ²⁶、抗 菌 ²⁷、抗 癌 ²⁸、保 肝 ²⁹、免 疫 調 節 ³⁰及 細 胞 毒 之 作 用 ³¹。 針 對 靈 芝 屬 ( Ganoderma ) 做 了 一 些 相 關 之 研 究 ， 在 赤 芝

( G.lucidum ) 中 發 現 了 新 的 lanostanoid 化 合 物 ganoderic aldehyde A 及 steroid 化 合 物 2β,3α,9 α-trihydroxyergosta

-7,22-diene， 這 兩 種 新 的 化 合 物 針 對 肝 癌 細 胞 ( PLC/PRF/5 )^{3 2} 有 細 胞 毒 性 ， 鹿 角 靈 芝 ( G. amboinense ) 活 性 成 分 研 究 中 得 到 lucidone A 及 2β-methoxyl-3α,9α-dihydroxyergosta-7,22-diene ， 兩 個 活 性 成 分 皆 具 有 鼻 煙 癌 很 強 ( KB cell line ) 的 細 胞 毒 性 ^{3 3}； 赤 芝 ( G.lucidum ) 除 了 對 癌 細 胞 具 有 細 胞 毒 性 之 外 還 能 夠 抗 病 毒，在 赤 芝 ( G.lucidum ) 中 分 離 出 新 的 lanostanoid 三 萜 類 化 合 物 lucidumol A 及 ganoderic acid beta ， 並 發 現 這 兩 個 新 的 化 合 物 具 有 很 明 顯 抗 人 類 免 疫 缺 陷 病 毒 蛋 白 脢 的 活 性 ( anti HIV-1)³⁴

。 從 上 述 關 於 靈 芝 之 相 關 一 系 列 的 研 究 ， 在 過 去 的 研 究 都 偏 重 於 靈 芝 之 抗 癌 的 活 性 ； 並 沒 有 太 多 有 關 於 抗 氧 化 之 相 關 研 究 ， 從 許 多 研 究 結 果 都 可 知 道 自 由 基 與 許 多 疾 病 皆 有 很 大 的 關 聯 ， 靈 芝 內 可 能 也 存 在 許 多 抗 氧 化 的 物 質 還 沒 有 被 人 類 所 探 討 ， 因 此 從 事 抗 氧 化 活 性 之 研 究 一 定 有 不 錯 的 價 值 。

本 次 之 研 究 是 以 松 杉 靈 芝 為 主 要 題 材 ， 松 杉 靈 芝 在 民 間 常 被 用 來 做 為 增 強 免 疫 力 及 抗 癌 等 民 間 藥 ； 現 將 過 去 關 於 松 杉 靈 芝 之 相 關 研 究 整 理 如 下 。

1. 林 忠 男 博 士 於 1997 年 發 表 之 論 文 ， 在 松 杉 靈 芝 中 分 離 出 兩 種 新 的 lanostanoids 化 合 物 ， 分 別 為 3α-acetoxy

-5α- lanosta-8,24-dien-21-oic acid ， 命 名 為 tsugaric acid A ； 及 3α-acetoxy-16α-hydroxy -24β-methyl-5α-lanosta-

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8,25- dien-21-oic acid， 命 名 為 tsugaric acid B^{3 5}。

2. 高 雄 醫 學 大 學 藥 學 研 究 所 實 驗 室 於 1998 年 發 表，於 松 杉 靈 芝 中 分 離 出 一 個 新 的 lanostanoids 酯 苷 及 已 知 的 steroid 化 合 物 ， 分 別 為 3α-acetoxy-5α-lanosta-8,24-dien-21-oic acid ester β-

d

-glucoside ； 已 知 2β,3α,9α-trihydroxy-5α- ergosta-7,22-diene,8α-epidioxygergosta 。並 針 對 這 兩 種 化 合 物 做 細 胞 毒 性 之 試 驗 ， 經 由 酯 苷 化 合 物 的 作 用 下 會 導 致 Hep 3B 肝 癌 細 胞 走 入 細 胞 凋 亡 ， 並 且 具 有 濃 度 效 應 ， 隨 濃 度 之 增 加 會 使 細 胞 停 滯 在 G1 期 ； steroid 化 合 物 的 作 用 會 使 Hep 3B 之 細 胞 週 期 停 滯 在 G2/M 期 ， 其 IC50 值 為 87.1 μg/mL ^{3 6}。

3. 中 興 大 學 於 1999 年 發 表 之 論 文，利 用 甲 醇 萃 取 松 杉 靈 芝 的 粗 萃 物 具 有 不 錯 的 抗 氧 化 活 性 ， 其 中 包 括 DPPH 自 由 基 、 氫 氧 自 由 基 的 清 除 活 性 ； 二 價 鐵 離 子 的 鉗 合 能 力 ， 能 夠 有 效 減 少 8-OH-dG 的 產 生 ³⁷。在 前 言 就 有 提 到 氫 氧 自 由 基 會 攻 擊 DNA 上 2^′-dG 的 C-8 位 置 上 受 到 氫 氧 自 由 基 攻 的 擊 氧 化 傷 害 生 成 8-OH-dG ，這 類 產 物 就 是 造 成 癌 化 最 重 要 的 因 子 ， 所 以 在 研 究 結 果 顯 示 松 衫 靈 芝 的 粗 萃 物 ， 能 夠 有 效 的 清 除 氫 氧 自 由；並 能 夠 抑 制 8-OH-dG 的 產 生，更 能 夠 說 明 松 衫 靈 芝 中 的 成 分 具 有 抗 氧 化 的 活 性 。

4. 高 雄 醫 學 大 學 藥 學 所 實 驗 室 2000 年 發 表，於 松 杉 靈 芝 中 分

離 出 三 種 新 的 lanostanoids 化 合 物 ³⁸ ， 分 別 為 (24R,S)-3α -acetoxy-24-hydroxy-5α-lanosta-8,25-dien-21-oic ac

id，

命 名 為 tsugaric acid C ；

3α- acetoxy-5α -lanosta-8,24-dien-21- O-β- d

-xyloside 命 名 為 tsugarioside B ； 3α-acetoxy-(Z) -24-methyl-5α-lanosta- 8,23,25- trien-21- oic acid ester β-

d

-xyloside 命 名 為 tsugarioside C 。 研究除了新發現的 lanostanoids 化合物， 並 將 過 去 發 現 的 其 餘 化 合 物 也 一 起 加 入 實 驗 ， 研 究 結 果 發 現 ， 化 合 物 tsugarioside B 在 不 同 的 細 胞 毒 性 試 驗 中，針 對 PLC/PRF/5 、 T-24 、 HT-3 及 SiHa 細 胞 中 皆 有 不 錯 的 against activity ， 其 ED50 值 分 別 為 6.5、

8.6 、 7.2 及 9.5 g/mL ； tsugaric acid A 在 T-24 細 胞 中 具 有 不 錯 的 細 胞 毒 活 性 ， 其 ED50 為 3.1 μg/mL 。

5. 高 雄 醫 學 大 學 實 驗 室 於 2008 年 發 表，在 松 杉 靈 芝 中 分 離 出         其 中 一 種 已 知 成 分 tsugaric acid A ， 由 tsugaric acid A 所 做 研 究 結 果 中 發 現 在 大 鼠 fMLP/CB 細 胞 中 能 夠 有 效 抑 制 超 氧 陰 離 子 的 產 生 ； 並 且 能 夠 保 護 人 類 的 角 質 層 細 胞 不 被 UVB 光 照 射 所 傷 害 ， 由 結 果 得 知 tsugaric acid A 具 有 不 錯 保 護 皮 膚 細 胞 及 防 止 氧 陰 離 子 產 生 的 功 能 ³⁹。 將 上 述 之 化 合 物 結 構 整 理 如 ( 圖 三 至 圖 七 )， 並 將 其 活 性 整 理 成 表 格 如 ( 表 一 ) 所 示 。 由 過 去 相 關 之 研 究 結 果 ， 於 松 杉 靈 芝 分 離 出 之 三 萜 類 化 合 物 具 有 細 胞 毒 性 ， 或 松 杉 靈 芝 甲 醇 的 粗 抽

13 

物 具 有 很 好 的 抗 氧 化 活 性 。 本 人 相 信 在 松 杉 靈 芝 中 一 定 還 有 許 多 抗 氧 化 之 活 性 成 分 還 未 曾 被 分 離 出 ， 這 些 成 分 都 值 得 去 做 研 究 。

HOOC

O O

圖 三 tsugaric acid A 結 構

HOOC

O O

CH3

圖 四 tsugaric acid B 結 構

R'OH₂C

O O

H

R'=β-

D

-xylosyl

圖 五 tsugarioside B 結 構

ROOC

O O

R=β-

D

-glucoside

圖 六   3α-acetoxy-5α-lanosta-8,24-dien-21-oic acid ester β-d-glucoside 結 構

15 

HOOC

O

圖 七   3-oxo-5α-lanosta-8,24-dien-21-oic acid 結 構

表一 松杉靈芝 lanostanoids 成分及其細胞毒性( ED50 values in μ

g/mL )

cell line^a compound

PLC/PRF/5 T-24 212 HT-3 SiHa CaSKi

tsugaric acid A 6.8 3.1

c c c

b tsugaric acid B b

b

10.3

c c

b tsugarioside B 6.5 8.6

b

7.2 9.5

c

3α-acetoxy-5α-lanota-

8,24-dien-21-oic acid ester β-d-glucoside

b 1.73

c

6.8 8.4

c

3β-hydroxy-5α-lanosta- 8,24-dien-21-oic acid

c 4.41 c 3.48 5.50 6.21

3β-acetoxy-5α-lanosta- 8,24-dien-21-oic acid

9.23 5.84 b c c 3.92

3-oxo-5α-lanosta-8,24- dien-21-oic acid

12.1 8.22 c 6.88 5.12 7.15

a

For significant activity of the pure compounds, an ED

5 0 < 4.0 μg/mL is required.

b

NS, no significant activity of the pure compounds.

c

Not determined.

17 

第二章 成分之研究

第一節 松杉靈芝的形態

松 杉 靈 芝 ( Ganoderma tsugae Murr .) 的 子 實 體 ， 屬 多 孔 菌 科 ( Polyporaceae ) 靈 芝 屬 ( Ganoderma )， 生 於 落 葉 松 和 紅 松 木 的 幹 部

及 倒 木 上 ，

為 台 灣 常 見 之 品 種 ， 亦 被 作 為 保 健 產 品 之 素 材 。 子 實 體 一 年 生 菌 蓋 為 扇 形 或 腎 形 ， 長 7~18 cm × 寬 5~14 cm、

厚 度 1~3 cm；菌 蓋 面 皮 殼 有 光 澤 呈 紅 褐 色 至 紫 紅 色，無 環 帶 邊 緣 有 稜 紋 。 菌 柄 側 生 長 2~10 cm、 粗 1~3 cm， 色 澤 與 菌 蓋 相 同 或 較 深 色 。 菌 肉 為 白 色 、 菌 管 呈 肉 桂 色 或 黃 褐 色 ； 孢 子 為 褐 色 卵 形 ， 雙 層 壁 且 內 壁 具 有 小 刺 ( 圖 八 )³¹。

圖 八 松 杉 靈 芝 形 態

第二節 成分之分離

本 次 實 驗 是 承 接 先 前 之 實 驗 ， 從 先 前 實 驗 所 子 實 體 分 離 出 之 CHCl3 fraction 依 其 化 合 物 與 固 定 相 之 吸 附 能 力 與 極 性 高 低 之 不 同 進 行 純 化 分 離 。 將 CHCl3 fraction 以 丙 酮 ( acetone ) 與 正 已 烷 ( n-Hexane ) 比 例 2:3 進 行 管 柱 層 析，共 分 離 出 5 個 劃 分 區 且 在 濃 縮 後 發 現 有 白 色 結 晶 粉 沉 澱 ， 並 將 這 五 個 劃 分 區 濃 縮 後 之 白 色 結 晶 分 別 進 行 抽 氣 過 濾 ， 共 得 到 五 個 白 色 粉 晶 化 合 物 。 針 對 粉 晶 2、3 進 行 管 柱 層 析，結 晶 2 以 乙 酸 乙 酯 ( EtOAc ) 與 正 已 烷 ( n-Hexane ) 比 例 1:2 做 沖 提 得 到 化 合 物 1 。 結 晶 3 利 用 二 氯 甲 烷 ( dichloromethane ) 與 正 已 烷 ( n-Hexane ) 比 例 1:3 做 沖 提 得 到 化 合 物 2 。 本 次 實 驗 分 離 出 的 兩 個 化 合 物 皆 由 松 杉 靈 芝 分 離 而 得 之 新 的 化 合 物 。 主 要 的 分 離 流 程 如 ( 圖 九 )。

19 

Ganoderma tsugae less fraction (85 g)

Chromatographed with Acetone and n-Hexane

A:N=3:4 A:N=2:3 A:N=1:2 A:N=1:1 A

Fr.1 Fr.2 Fr.3 Fr.4 Fr.5

E:N＝ 1:2 D:N＝ 1:3 1 2

A： Acetone E： Ethyl acetate D： Dichloromethane N： n-Hexane

1. G.C 2 ( 1 ) ( 38.9 mg ) 2. G.C 3 ( 2 ) ( 52.3 mg )

圖 九 松 杉 靈 芝 成 分 分 離 流 程

HOOC

O

O O

   

G.C2 ( 3α-acetyl-5α-lanosta-22-oxo-8,24-dien-21-oic acid) ( 1 )

O

HOOC

OH

 

G.C3 ( 3-oxo-5α-lanosta-22-6,8,24(24')-trien-21-oic acid) ( 2 )

圖十 松 杉 靈 芝 分 離 出 之 新 化 合 物 之 結 構

21  HOOC

O

O O

1

3

5 7

9

11 13

15 17 19

21

23

25 27

29 31

第三節 化學成分構造與證明

第一項 G.C 2 ( 1 ) 之結構證明

化 合 物 1 白 色 粉 晶，比 旋 光 度 [α]²⁵ D :- 2 ( c 0.25, methanol )。

紅 外 線 光 譜 ( 圖 十 一 ) 中 ， 3439 cm^{- 1} 為 羧 酸 上 的 羥 基 ( hydroxyl group ) 的 吸 收 ， 1631 cm^-1 羰 基 ( carbonyl group )。

EI-MS ( 圖十二，70eV ) 在 m/z ( rel. int. )：可得知分子離子峰出現在

m/z 512，基峰出現在 m/z 357，其它顯著峰有 m/z 497 [M-Me]

^＋ , 479 [497-H2O]^＋, 451 [479-C=O]^＋。

由 ¹H-NMR 光 譜 ( 圖 十 三 ,CDCl3 )中 可 得 知 ： 有 八 個 單 峰 的 一 級 甲 基 ( teritary methyl group )， 分 別 出 現 在 δ 0.86 ( 3H , s , Me-13 ) ，0.88 ( 3H , s , Me-28 ) ， 0.91 ( 3H , s , Me-30 ) ， 1.00 ( 3H , s , Me-19 ) ， 1.12( 3H , s , Me-28 ) ， 1.59 ( 3H , s ,

Me-27 ) ， 1.67 ( 3H , s , Me-29 ) 及 2.07 ( 3H , s , Me-32 ) ， 比

對 過 去 文 獻 ³⁵得 知 為 羊 毛 甾 烷 類 的 骨 架 ( lanostane skeleton ) 上 之 甲 基 質 子 的 吸 收 信 號 ， δ 2.07 (3H, s ) 有 一 乙 醯 基 ( acetyl group ) 之 甲 基 吸 收 訊 號，在 δ 5.12 ( 1H, t ,J= 6.8 Hz )為 olefinic proton 的 吸 收 訊 號 。

由 ¹³C-NMR 光 譜 ( 圖 十 四 ) 及 DEPT 光 譜 ( 圖 十 五 ) 中，

共 有 三 十 二 個 碳 之 訊 號 ， 八 支 單 峰 之 甲 基 訊 號 、 九 支 亞 甲 基 之 吸 收 訊 號 ， 另 還 有 五 支 次 甲 基 及 十 支 四 級 碳 之 吸 收 訊 號 。 δ 170.8 為 羰 基 碳 ( carbonyl carbon ) 的 吸 收 訊 號 ， δ

77.8 為 C-3 位 上

有 α-acetoxyl group 的 吸 收 訊 號 ， 以 及 有 一 個 三 級 碳 於 δ 123.4 之 吸 收 訊 號 、 三 個 四 級 碳 分 別 於 δ 131.1 、 136.0 、 136.0 ， 由 此 可 得 知 共 有 兩 對 雙 鍵 ， 可 知 一 對 位 於 環 內 C-8 與 C-9 上 、 另 外 一 對 於 側 鏈 C-24 與 C-25 上 。

此 化 合 物 之 碳 與 氫 之 光 譜 除 了 C-17 、 C-20 、 C-22 及 C-23 與 tsugaric acid A 不 同 外 ， 其 他 皆 一 樣 。 由 上 述 可 知 1 為 一 種 3α-acetyl-5α-lanostae 型 化 合 物 。 在 二 維 光 譜 的 部 分 ， 由 COSY 圖 譜 ( 圖 十 六 ) 可 知 到 H-17∕ H-20 及 H-23∕ H-24 有 ¹H-¹H 間 之 關 聯 ( 以 bold line ) 表 示 記。在 HMBC 光 譜 中 ( 圖 十 八 ) 有 H-20 (δ

2.75 )∕ C-21 (

δ

180 ) 及 C-22 (

δ

219 ) 關 聯 ， H-23

( 1.95 )、 ( 2.33 )∕ C-22 (δ

219 ) , C-20(

δ

57.1 ) 及 C-25 (

δ

131.3 )

之 關 聯 ， 由 此 可 證 明 化 合 物 1 的 構 造 式 為 3α-acetyl-5α-lanosta -22-oxo-8,24-dien-21-oic acid，其 他 二 維 光 譜 可 近 一 步 支 持 以 上 之

23 

結 構 。 綜 合 以 上 資 料 及 文 獻 之 比 對 ， 可 證 明 此 結 構 之 分 子 式 為 C32H48O5 ；因 化 合 物 1 為 天 然 物 界 首 次 發 現 之 新 化 合 物，故 將 1 命 名 為 G.C 2。

圖十一紅外線光譜圖十一 G.C 2(1) 紅外線光譜 ( IR )

25 

512.3507 圖十二 G.C 2(1) EI-MS圖譜

圖十三 G.C 2(1) 氫的光譜( 1 H-NMR )

27 

圖十四 G.C 2(1) 碳的光譜( 13 C-NMR )

圖十五 G.C 2(1) 的 DEPT光譜 圖十五 G.C 2(1) 的 DEPT光譜

29 

圖十六 G.C 2(1) 的 COSY光譜

圖十七 G.C 2(1) 的 COSY光譜放大光譜

 

31 

圖十八 G.C 2(1) 的 HMBC 光譜

 

圖十九 G.C 2(1) 的 HMBC 放大光譜

 

33 

第二項

 

G.C 3 ( 2 ) 之結構證明

O

HOOC

OH

1

3 5 7

9

11 13

15 17 19

21

23 24 24'

25 27

29

    化 合 物 2 白 色 粉 狀 物 ， 比 旋 光 度 [α]²⁵ D :–2 ( c 0.25,

methanol )。 紅 外 線 光 譜 ( 圖 二 十 ) 中 ， 3431 cm^-1 為 羧 酸 上 的 羥 基 ( hydroxyl group ) 的 吸 收， 2952 cm^{- 1} 為 CH2 的 吸 收，1635 cm^-1 羰 基 ( carbonyl group ) 的 吸 收 。

EI-MS ( 圖 二 十 一 70eV ) 在 m/z ( rel. int. )： 可 得 知 分 子 離 子 峰 出 現 在

m/z 482， 基 峰 出 現 在 m/z 451， 其 它 顯 著 峰 有 m/z 439

[M-COOH]^＋。

    由 ¹H-NMR 光 譜 ( 圖 二 十 二 , Acetone-d6 ) 中 可 得 知：有 七 個 一 級 甲 基 ( teritary methyl group) 的 吸 收 訊 號 ， 分 別 出 現 在 δ 0.67 ( 3H , s , Me-18 ) ， 1.01 ( 3H , d , J= 6.8 Hz , Me-26 ) ， 1.02 ( 3H , d ,6.8 Hz , Me-27 ) ， 1.04 ( 3H , s , Me-29 ) ， 1.11 ( 3H , s , Me-28 ) ， 1.21 ( 3H , s , Me-19 ) 及 1.66 ( 3H , s , Me-30 ) ，

比 對 過 去 文 獻 ³¹得 知 為 羊 毛 甾 烷 類 的 骨 架 ( lanostane skeletone ) 上 之 甲 基 質 子 的 吸 收 信 號 ， δ

5.14 ( m , 1H ) 有 一 個 羥 基

( hydroxyl group ) 的 吸 收 訊 號，δ 5.45 ( d , 6.0 ) ， 5.55 ( d , 6.0 ) 分 别 各 具 有 一 個 次 甲 基 氫 ( methine proton ) 的 吸 收 訊 號 。     由 ¹³C-NMR 光 譜 ( 圖 二 十 三 ) 及 DEPT 光 譜 ( 圖 二 十 四 ) 中 ， 共 有 三 十 一 個 碳 之 訊 號 ， 結 構 中 共 包 含 有 δ 215.8 有 一 個 羰 基 之 吸 收 訊 號 ， 五 支 單 峰 及 兩 支 雙 峰 之 甲 基 訊 號 、 八 支 亞 甲 基 之 吸 收 訊 號 ， 另 還 有 七 支 次 甲 基 及 九 支 四 級 碳 之 吸 收 訊 號 ， 在 δ 118.5 ，δ 121.8 為 三 級 碳 之 吸 收、在 δ 143.9 ， δ 146.1 為 四 級 碳 之 吸 收 訊 號 ， 由 此 可 得 知 共 有 兩 對 雙 鍵 ， 可 知 分 別 位 於 環 內 C-6 與 C-7 上 、 及 C-8 與 C-9 上 。

    在 二 維 光 譜 的 部 分 ， 由 COSY 圖 譜 ( 圖 二 十 五 ) 可 證 實 各 氫 間 之 關 聯 ， H-6∕ H-7 、 H-11∕ H-12 、 H-15∕ H-16 、 H-16

∕H-17 、 H-20∕ H-22 、 H-25∕ H-26 及 H-25∕ H-27 有 ¹H-¹H 之 關 聯 。 由 HMQC 圖 譜 ( 圖 二 十 七 ) 可 證 明 碳 與 碳 之 關 聯 ， C-6∕ C-7 、 C-11∕ C-12 、 C-15∕ C-16 、 C-16∕ C-17 、 C-20

∕C-22 、 C-25∕ C-26 及 C-25∕ C-27 間 碳 與 碳 關 係 相 聯 ( 以 bold 表 示 ) 。 由 HMBC 圖 譜 (圖 二 十 九 ) 可 證 明 碳 與 氫 之 關 聯 ， 由 H-1∕ C-3 、 H-2∕ C-10 、 Me-28 與 Me-29∕ C-3 、 Me-28 與 Me-29∕ C-5 及 Me-19∕ C-10 與 C-5 之 HMBC correlations ，可 建 立 A 環 之 構 造；由 Me-19∕ C-10 , C-9 及

35 

C-5 、 H-7∕ C-5 及 C-9 、 H-6∕ C-8 HMBC correlations ， 可 確 立 B 環 之 構 造；由 H-12∕ C-9 、 H-7∕ C-14 及 H-17∕ C-12 之 HMBC 關 聯 及 C-13 以 及 C-14 係 四 級 碳 可 確 立 C 環 之 構 造；由 Me-18∕ C-17 , C-13 、 Me-30∕ C-14 及 C-15 之 HMBC 關 聯 及 透 過 C-13 及 C-14 為 四 級 碳 可 確 立 D 環 之 結 構 ； 由 Me-26∕ C-24 、 Me-24'∕ C-25 、 H-23∕ C-24' 、 H-22∕ C-24 、 H-20∕ C-23 、 H-20∕ C-21 及 H-16∕ C-20 之 HMBC 關 聯 確 立 其 side chain 之 結 構 且 可 證 明 side chain 以 C-20 與 C-17 相 連 ， 以 上 之 結 果 可 確 定 2 之 結 構 式 為 3-oxo-5α-lanosta-

2-6,8,24(24')-trien-21-oic acid ， 因 化 合 物 2 為 天 然 物 界 首 次 發 現 之 新 化 合 物 ， 故 將 2 命 名 為 G.C 3。

圖二十 G.C 3(2) 紅外線光譜 ( IR )

 

37 

圖二十一 G.C 3(2) EI-MS圖譜

圖二十二 G.C 3(2) 氫的光譜( 1 H-NMR )

 

39 

圖二十三 G.C 3(2) 碳的光譜 13

圖二十四 G.C 3(2) 的 DEPT光譜

41 

圖二十五 G.C 3(2) 的 COSY光譜

 

圖二十六 G.C 3 (2) 的 COSY放大光譜

 

43 

圖二十七 G.C 3 (

2

) 的 HMQC 光譜

 

圖二十八 G.C 3(2) 的HMQC放大光譜

   

45 

圖二十九 G.C 3(2) 的 HMBC 光譜

 

圖三十 G.C 3(2) 的 HMBC 放大光譜

 

47 

表 二 化合物 1 及 2 之 ¹H-NMR 及 ¹³C-NMR 資料

1 ( CDCl

3 )

2 ( acetone-D

6 )

δ H (M , J Hz) δ C δ H (M , J Hz) δ C

1 1.43 ( m ) 30.6 1.43 ( m )

2 1.83 ( m ) 23.2 1.62 ( m )

3 4.67 ( m ) 77.8 4 36.7 5 1.50 ( bs ) 45.2 6 1.44 ( m ) 17.8 1.63 ( m )

7 1.87 ( m ) 25.9 2.04 ( m )

8 136.0 9 136.0 10 37.0 11 2.05 ( m , 2H ) 20.1 12 1.61 ( m ) 30.8 2.43 ( m )

13 44.0 14 49.5 15 1.87 ( m ) 26.4 2.07 ( m )

16 1.47 ( m ) 28.7 1.88 ( m )

17 2.56 ( m ) 43.6 18 0.86 ( s ) 16.9 19 1.00 ( s ) 18.8 20 2.57 ( m ) 57.1 21 180.0

1 1.69 ( m, 2H ) 38.0 2 1.59 ( s ) 37.1 1.66 ( s )

3 215.8 4 48.5 5 1.52 ( td , 11.2 , 3.2 ) 52.4 6 5.45 ( d , 6.0 ) 118.5 7 5.55 ( d , 6.0 ) 121.8 8 143.9 9 146.1 10 38.7 11 1.63 (m , 2H ) 21.8 12 2.00 ( m ) 27.6 1.86 ( m )

13 48.5 14 52.7 15 2.18 ( m ) 45.0 1.50 ( m )

16 5.14 ( m ) 77.4 17 2.16 ( m ) 58.2 18 0.67 ( s ) 18.2 19 1.21 ( s ) 23.3 20 2.42 ( d , 2.8 ) 48.3 21 177.9 22 2.21 ( m ) 24.9 2.06 ( m )

23 2.00 ( m ) 33.8 2.05 ( m )

22 219.0 23 1.95 ( m ) 46.3 2.33 ( m )

24 5.12 ( t , 6.8 ) 123.4 25 131.3 26 0.88 ( s ) 27.5

24 157.5 24' 4.73 ( dd , 11.2 , 1.2 ) 107.8 25 2.26 ( m ) 35.1 26 1.01 ( d , 6.8 ) 22.9 27 1.02 ( d , 6.8 ) 26.5 28 1.11 ( s ) 19.5 29 1.04 ( s ) 22.9 27 1.59 ( s ) 17.6

28 0.91 ( s ) 21.8 29 1.67 ( s ) 25.7 30 1.12 ( s ) 25.0 31 170.8 32 2.07 ( s ) 21.3

30 1.66 ( s ) 26.5

49 

第三章 實驗部份

第一節 儀器與材料

一、 儀器

1.  核 磁 共 振 光 譜 儀 ( Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer  ，   NMR )

以Burker-100 ， 400 MHz FT-NMR Spectrometer ， Varian Gemini-200 MHz FT-NMR Spectrometer ， Unity-400 MHz FT-NMR Spectrometer 測 定 之。化 學 位 移 (Chemical Shift)：

以 δ 值 ( Part per million； ppm ) 表 示 。 吸 收 信 號 縮 寫 ： S ( singlet ) ， d ( doublet ) ， t ( triplet ) ， m

( multiplet ) ， br d ( broad doublet ) ， br t ( broad triplet ) ， dd ( double doublet )。

2. 紅 外 線 光 譜 ( Infrared Spectrophotometer， IR )

以 Perkin Elmer system 2000 FT-IR Spectrophotometer 測 得 檢 品 紅 外 吸 收 光 譜 。

3. 旋 光 計 ( Polarimeter )

以Jasco DIP-370 Digital Polarimeter 求 得 檢 品 之 旋 光 度 [α]^tD。

4. 質 譜 儀 ( Mass Spectra， MS )

Electron Impact Mass ( EI-MS ) ， 以 JEOL TMSD-100

Mass Spectrometer 測 定 之 。 5. 減 壓 濃 縮 機 及 水 浴 鍋

EYELA Rotary evaporator N-1000 EYELA Digital water bath SB-1000

6. 管 柱 層 析 ( Column Chromatography， CC ) 玻 璃 管 柱 購 自 勤 興 化 學 藥 品 儀 器 行 。

7. 薄 層 層 析 ( Thin Layer Chromatography， TLC ) 檢 定 方 法 ：

a. UV lamp Manasln-Light， 254 nm及 360 nm照 射 。 b.10﹪ H2SO4 為 呈 色 劑 ， 加 熱 後 呈 色 。

二、 材料

(一 )溶 媒 部 份 及 化 學 試 藥 分 別 購 自 下 列 廠 商 : 1. 景 明 化 工 有 限 公 司 ：

甲 醇 ( methanol ) 、 丙 酮 ( acetone ) 、 乙 酸 乙 酯 ( ethyl acetate ) 、 二 氯 甲 烷 ( dichloromethane ) 及 正 已 烷 ( n-Hexane )。

2. 德 國 R. D. H 公 司 ：

乙 酸 乙 酯 ( ethyl acetate ) 、 丙 酮 ( acetone )  、   氯 仿 ( chloroform ) 及 正 已 烷   ( n-Hexane )。

        3. 和 光 純 株 式 會 社 ：

51 

二 氯 甲 烷 ( dichloromethane )。

4. 島 久 藥 品 株 式 會 社 ： 硫 酸 ( sulfuric acid )

(二 )核 磁 共 振 光 譜 測 定 用 氘 溶 媒 購 自 下 列 廠 商 ： Sigma-Aldrich：

氘 丙 酮 ( acetone-D6 ) 、 氘 甲 醇 ( methanol-D4 )、

氘 氯 仿 ( chloroform-D1 )、 氘 嘧 啶 ( pyridine-D5 )

(三 )層 析 材 料 ：

1. 矽 膠 板 片 ( TLC plates )：

a. Art. 818033 ALUGRAMSIL G; Art. 81833

ALUGRAMSIL G/UV254 ( 德 國 Macherey Nagel Duren )

b. Art. 5553 DC-Alufolien Kieselgel 60； Art. 5554 DC-Alufolien Kieselgel 60

( 德 國 E. Merck )

2. 充 填 管 柱 之 固 定 相 ( Statinary phase ) 膠 體 ：

a. MN-Kieselgel 60， 0.063~0.2 mm / 70~230 # ASTM；

MN-Kieselgel 60， 0.04~0.063 mm / 230~400 # ASTM ( 德 國 Macherey Nagel Duren )

b. MN-Kieselgel 60， 0.063~0.2 mm / 70~230 # ASTM；

MN-Kieselgel 60， 0.04~0.063 mm / 230~400 # ASTM ( 德 國 E. Merck )。

53 

第二節 生物活性試驗

抗 氧 化 活 性 之 試 驗 ：

1. 實 驗 原 理

本 項 活 性 試 驗 將 針 對 體 外 三 種 不 同 的 氧 化 物 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl ( DPPH )、 2,2'-azinobis-3-ethylbenzothiazoline -6-sulfonic acid ( ABTS ) 、 xanthine oxidase ( XO ) 。

之 清 除 能 力 來 評 估 化 合 物 是 否 具 有 抗 氧 化 的 能 力 。

(1) DPPH自 由 基 之 清 除 ：

利 用 是 否 清 除 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 自 由 基 的 能 力 來 評 估 ， DPPH 溶 液 的 顏 色 為 藍 紫 色 ， 若 化 合 物 具 備 清 除 自 由 基 能 力 ， 反 應 後 顏 色 會 由 藍 紫 色 → 黃 色 吸 光 值 會 改 變 ， 當 化 合 物 抗 氧 化 能 力 越 強 吸 光 值 的 變 化 越 明 顯 ， 利 用 Elisa Reader 於 490 nm 下 測 定 其 吸 光 值 ， 並 利 用 吸 光 值 的 變 化 計 算 出 抑 制 率 及 IC50 值 。 (2) ABTS 自 由 基 之 清 除 ：

ABTS 為 帶 正 電 之 自 由 基，於 630 nm 有 吸 收 波 長，此 項 試 驗 是 測 定 化 合 物 是 否 具 有 氫 離 子 提 供 能 力 ， 若 氫 離 子 的 提 供 能 力 越 強 其 吸 光 值 會 下 降 ， 故 此 可 用 來 評 估 化 合 物 是 否 具 有 抗 氧 化 之 作 用 ， 並 利 用 吸 光 值 的 變 化 計 算 出 抑 制 率 及 IC50 值 。

(3) Xanthine oxidase ( XO ) 之 抑 制 ：

xanthine oxidase ( XO ) 在 細 胞 的 內 質 網 (endoplasmic reticulum ) 上 作 用 後 會 產 生 超 氧 陰 離 子 ( O2.-

) 自 由 基 ； 超 氧 陰 離 子 ( O2. -

) 自 由 基 會 引 起 多 種 疾 病 的 發 生，故 本 試 驗 利 用 化 合 物 抑 制 xanthine oxidase ( XO ) 的 產 生 ， 在 290 nm 測 定 吸 光 值 並 利 用 吸 光 值 的 變 化 計 算 出 抑 制 率 及 IC50 值 。

2. 實 驗 材 料 ：

a. 由 松 杉 靈 芝 分 離 之 純 化 合 物 1、 2 、 tsugaric acid A ( 3 ) 與 其 皂 化 後 之 化 合 物 3 α- h y d r o x y -5α-lanosta -8,24-dien-21-oic acid ( 4 ) 及 3-oxo-5α-lanosta-8,24- dien-21 oic acid ( 5 )

(化 合 物 由 林 忠 男 老 師 所 提 供 ) b. 標 準 品 ： Tocopherol ( TOC )

Butylated hydroxyanisole ( BHA ) Allopurinol

( 購 自 Sigma ) c. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ( DPPH )

2,2'-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ( ABTS )

( 購 自 Sigma )

55 

d. 溶 媒 ： 甲 醇 ( methanol ) ( 購 自 Sigma ) Dimethyl sulfoxide (DMSO)

e. 96-well plates ( NUNC^TM ) f. Elisa Reader ( DYNEX MRX )

      3. 樣 品 配 製 ：

(1) DPPH 自 由 基 之 清 除 ：

將 待 測 之 化 合 物 及 標 準 品 秤 重 ， 利 用 methanol 經 震 盪 機 至 完 全 溶 解 ， 再 以 methanol 稀 釋 成 個 種 不 同 的 濃 度 。 DPPH 也 以 methanol 新 鮮 配 製 ( 0.1 mM )， 並 放 置 冰 盒 中 M 於 避 光 下 備 用 。

(2) ABTS 自 由 基 之 清 除 ：

將 待 測 之 化 合 物 及 標 準 品 秤 重 ， 利 用 methanol 經 震 盪 機 至 完 全 溶 解 ， 再 以 methanol 稀 釋 成 個 種 不 同 的 濃 度 。 配 製 7 mM 的 ABTS stock 溶 液 ， 並 將 Potassium persulfate ( K2S2O8 ) 粉 末 加 入 混 合 ， 並 在 使 用 前 於 暗 室 中 放 置 六 到 八 小 時 。 使 用 時 須 在 波 長 630 nm 下 ， 使 用 methanol 將 吸 光 值 調 整 至 0.7 ± 0.02 後 才 能 進 行 試 驗 。

(3) Xanthine oxidase (XO) 之 抑 制 ：

將 待 測 之 化 合 物 及 標 準 品 秤 重 ， 利 用 DMSO 經 震 盪 機

至 完 全 溶 解 ， 再 以 DMSO 稀 釋 成 個 種 不 同 的 濃 度 。 配 製 0.15 mM xanthine 及 0.1 U xanthine oxidase ( 0.1 units / ml ) 並 以 70 mM phosphate buffer ( pH 7.5) 溶 解 。

      4. 實 驗 方 法 ：

(1) DPPH 自 由 基 之 清 除 ⁴⁰：

在 96-well plate 內 逐 一 加 入 適 量 之 methanol ，並 將 化 合 物 及 標 準 品 秤 重 後 用 methanol 完 全 溶 解 ， 依 不 同 之 濃 度 分 別 加 96-well plate ， 再 加 入 新 鮮 配 製 之 DPPH ( 0.1 mM ) 各 150 μL ，每 個 well 的 總 體 積 為 200 μL，

在 波 長 490 nm 下 測 定 吸 光 值 。 對 照 組 ( positive control ) 為 Tocopherol( TOC )。

(2) ABTS 自 由 基 之 清 除 ⁴¹：

在 96-well plate 內 逐 一 加 入 適 量 之 methanol ， 並 將 化 合 物 及 標 準 品 秤 重 後 用 methanol 完 全 溶 解 ， 依 濃 度 之 不 同 分 別 加 96-well plate ， 再 加 入 新 鮮 配 製 之 7 mM 的 ABTS 各 170 μL，每 個 well 的 總 體 積 為 200 μL，在 波 長 630 nm 下 測 定 吸 光 值 。 對 照 組 (positive control ) 為 butylated hydroxyanisole ( BHA )。

(3) Xanthine oxidase (XO) 之 抑 制 ⁴²：

57 

在 96-well plate 內 逐 一 加 入 適 量 之 70 mM phosphate buffer ( pH 7.5)， 並 將 化 合 物 及 標 準 品 秤 重 後 用 DMSO 完 全 溶 解，依 濃 度 之 不 同 分 別 加 入 96-well plate ，再 加 入 新 鮮 配 製 之 0.15 mM xanthine 30 μL 最 後 再 加 入 反 應 之 酵 素 xanthine oxidase (0.1 U) 60 μL ， 每 個 well 的 總 體 積 為 200 μL ， 在 波 長 290 nm 下 測 定 吸 光 值 。 對 照 組 (positive control ) 為 Allopurinol。

      5. 抑 制 率 的 計 算 公 式 ( Inhibition % )：

A-B

A × 100 %

A： 未 加 抑 制 劑 所 測 得 之 吸 光 值 ( O.D ) B： 加 入 抑 制 劑 後 測 得 之 吸 光 值 ( O.D )

第四章 結果與討論

一、 結果

表 三 化 合 物 1-5 清 除 DPPH 自 由 基 之 活 性 試 驗 結 果 ^a Samples Conc.

(μM)

Absorption Inhibition (%)

IC5 0(μM)^d

1

Control 50 100 200 300

0.381±0.006 0.390±0.002 0.383±0.002 0.382±0.004 0.390±0.001

-2.29 -0.62 -0.29 -2.29

NC^c

2

Control 50 100 200 300

0.359±0.003 0.382±0.004 0.383±0.001 0.376±0.003 0.382±0.003

-6.60 -6.69 -4.92 -6.69

NC^c

3

Control 50 100 200 300

0.614±0.005 0.618±0.006 0.615±0.004 0.614±0.0007

0.598±0.004

-1.40 -0.90 -0.74 1.81

NC^c

a將 0.1 mM DPPH 溶 液 加 入 不 同 濃 度 的 試 驗 化 合 物 中，避 光 反 應 30 分 鐘 後 於 波 長 490 n m 下 測 定 吸 光 值 ， 吸 光 值 表 示 以 平 均 值 ± 標 準 誤 差 (mean ± S.E) 。 此 實 驗 重 複 三 次 。^b Tocopherol 為 對 照 組 。^cNC(Non-calculate)， 無 法 計 算 IC_{5 0}值 。

59 

表 三 化 合 物 1-5 清 除 DPPH 自 由 基 之 活 性 試 驗 結 果 ^a(續 ) Samples Conc.

(μM)

Absorption Inhibition (%)

IC5 0(μM)^d

4

Control 50 100 200 300

0.605±0.004 0.616±

0.0005 0.613±0.003 0.607±0.001 0.590±0.005

-1.88 -1.27 -0.33 2.37

NC^c

5

Control 50 100 200 300

0.600±0.006 0.608±0.007 0.606±0.006 0.603±0.007 0.587±0.002

-1.22 -0.89 -0.39 2.33

NC^c

Tocopherol^b

Control 50 100 200 300

0.604±0.005 0.174±0.15 0.088±0.003 0.088±0.003 0.085±0.0005

71.16 85.43 85.43 85.87

29.12

a將 0.1 mM DPPH 溶 液 加 入 不 同 濃 度 的 試 驗 化 合 物 中，避 光 反 應 30 分 鐘 後 於 波 長 490 n m

下 測 定 吸 光 值 ， 吸 光 值 表 示 以 平 均 值 ± 標 準 誤 差 (mean ± S.E) 。 此 實 驗 重 複 三 次 。^b Tocopherol 為 對 照 組 。^cNC(Non-calculate)， 無 法 計 算 IC5 0值 。

由 表 三 可 知 化 合 物 1、 2 及 3 不 具 有 清 除 DPPH 自 由 基 的 活 性 ； 除 了 化 合 物 4 及 5 在 濃 度 300 μM 時 有 些 許 清 除 DPPH 的 活 性，此 類 自 由 基 的 清 除 能 力 與 化 合 物 OH 基 數 量 的 多 寡 有 相 對 應 的 關 係 ^19,20 ；化 合 物 4 在 3α 位 上 有 一 個 OH 基 團，所 以 跟 其 餘 三 種 化 合 物 比 較 起 來 具 有 些 許 活 性 。

表 四 化 合 物 1- 5 清 除 ABTS 自 由 基 之 活 性 試 驗 結 果 ^a Samples Conc.

(μM)

Absorption Inhibition (%)

IC5 0(μM)^d

1

Control 25 50 100

0.757±0.01 0.814±0.002 0.803±0.002 0.794±0.003

-7.55 -6.01 -4.91

NC^c

2

Control 25 50 100

0.757±0.03 0.821±0.01 0.818±0.005 0.812±0.006

-8.58 -8.19 -7.44

NC^c

3

Control 25 50 100

0.97±0.004 0.96±0.004 0.968±0.007 0.959±0.003

1.10 0.20 1.13

NC^c

4

Control 25 50 100

0.966±0.004 0.962±0.002 0.957±0.004 0.945±0.003

0.45 0.96 2.17

NC^c

aABTS 陽 離 子 自 由 基 清 除 活 性 實 驗 ， 將 7 mM 的 ABTS 170 μL 分 別 加 入 不 同 濃 度 之 待 測 化 合 勿 中，並 於 波 長 630 nm 測 定 吸 光 值，吸 光 值 表 示 以 平 均 值 ± 標 準 誤 差 (mean ± S.E)。

此 實 驗 重 複 三 次 。^b BHA 為 對 照 組 。^cNC(Non-calculate)， 無 法 計 算 IC5 0值

61 

表 四 化 合 物 1- 5 清 除 ABTS 自 由 基 之 活 性 試 驗 結 果 ^a(續 ) Samples Conc.

(μM)

Absorption Inhibition (%)

IC5 0(μM)^d

5

Control 25 50 100

0.973±0.005 0.960±0.008 0.956±0.005 0.940±0.007

1.27 1.71 3.32

NC^c

BHA^b

Control 25 50 100

0.754±0.02 0.573±0.02 0.317±0.01 0.088±0.001

24.00 58.01 88.37

63.76

aABTS 陽 離 子 自 由 基 清 除 活 性 實 驗 ， 將 7 mM 的 ABTS 170 μL 分 別 加 入 不 同 濃 度 之 待 測

化 合 勿 中，並 於 波 長 630 nm 測 定 吸 光 值，吸 光 值 表 示 以 平 均 值 ± 標 準 誤 差 (mean ± S.E)。

此 實 驗 重 複 三 次 。^b BHA 為 對 照 組 。^cNC(Non-calculate)， 無 法 計 算 IC5 0值 。

由 表 四 可 知 化 合 物 1 及 2 不 論 是 在 低 濃 度 或 是 高 濃 度 皆 不 具 有 清 除 自 由 基 之 活 性，化 合 物 3、4 及 5 在 濃 度 25 μM - 100 μM 有 清 除 自 由 基 之 活 性 。

0 20 40 60 80 100 120

5 μM 10 μM 30 μM 75 μM 100 μM 150 μM 175 μM 200 μM

Inhibition (%)

Allopurinol

3 5

圖 三 十 一  ^{化 合 物} 3 及 5 於 不 同 濃 度 下 抑 制 xanthine oxidase 之 情 形

由圖三十一結果可得知，化合物 3 及 5 在 高 濃 度 時 才 具 有 較 顯 著 的 抑 制 活 性，其 IC50 值 分 別 為 177.7 ± 3.58 μM 及 117.83 ± 3.58 μM 。 對 照 組 Allopurinol 在 低 濃 度 就 具 有 很 顯 著 之 抑 制 活 性 ，IC50 值 為 3.2 ± 0.3 μM。

63 

二、 討論

由 前 言 可 得 知 ， 自 由 基 及 活 性 氧 之 存 在 造 成 許 多 疾 病 的 發 生 ， 如 心 血 管 疾 病 、 巴 金 森 氏 症 及 國 人 十 大 死 因 榜 首 的 癌 症 。 本 篇 研 究 ， 松 杉 靈 芝 所 分 離 出 之 三 萜 化 合 物 進 行 體 外 的 抗 氧 化 活 性 試 驗 。

在 DPPH 自 由 基 之 清 除 活 性 ， 化 合 物 1-5 皆 無 清 除 自 由 基 之 活 性；化 合 物 2 雖 然 在 C-16 上 具 有 一 個 β 位 向 的 OH，但 可 能 在 此 位 向 上 氫 離 子 的 提 供 能 力 較 差 ， 所 以 沒 有 清 除 自 由 基 之 活 性 。 從 許 多 過 去 的 研 究 結 果 顯 示 ， 類 黃 酮 具 有 很 強 之 DPPH 清 除 活 性 ， 此 類 化 合 物 之 所 以 有 那 麼 強 的 活 性 與 hydroxyl group ( OH ) 的 數 量 多 寡 有 相 當 大 的 關 係， hydroxyl group 越 多 其 清 除 自 由 基 的 能 力 越 強 ^43,44； 清 除 之 作 用 方 式 主 要 是 由 離 羥 基 上 所 丟 出 的 電 子 能 與 自 由 基 產 生 反 應 ， 使 原 本 活 潑 的 自 由 基 安 定 ， 參 與 反 應 的 類 黃 酮 化 合 物 也 會 形 成 活 性 較 低 之 flavonoid aroxyl radicals ⁴⁵； 類 黃 酮 化 合 物 B 環 上 之 3',4' 位 上 之 hydroxyl group 已 經 被 證 實 具 有 較 強 的 DPPH 清 除 之 活 性 ⁴⁶。 前 言 中 有 提 到 從 松 杉 靈 芝 甲 醇 的 粗 抽 物 具 有 很 好 的 DPPH 自 由 基 的 清 除 活 性 ； 但 是 本 次 所 分 離 出 之 新 的 化 合 物 及 過 去 的 已 知 化 合 物 卻 沒 有 清 除 自 由 基 的 活 性；經 過 去 文 獻 資 料 ^37,47,48 的 結 果 顯 示 在 DPPH 抗 氧 化 試 驗 中 ， 具 有 很 強 的 清 除 能 力 皆 是 在 高 極 性 層 中 的 粗 抽 物 才 看 的 到 ， 有 可 能 是 因 為 在 高 極 性 層 中 的 化 合 物 含 醣 或 是 酯 類 的 結 構 才 具 有 很

強 的 清 除 活 性，本 次 試 驗 的 化 合 物 皆 為 lanostaniods 類 型 的 化 合 物 ， 由 此 可 知 此 類 的 化 合 物 的 作 用 活 性 不 在 DPPH 自 由 基 的 清 除 。

在 ABTS 自 由 基 之 清 除 活 性 試 驗 中，化 合 物 1 及 2 皆 沒 有 清 除 自 由 基 之 活 性 ， 化 合 物 3-5 在 濃 度 25-100 μM 時 具 有 較 弱 的 清 除 活 性 。ABTS 經 由 過 氧 化 氫 作 用 後 會 產 生 ABTS⁺ 自 由 基 ， ABTS⁺ 自 由 基 可 藉 由 抗 氧 化 之 物 質 將 其 還 原 成 安 定 的 ABTS ； 本 次 參 與 試 驗 之 化 合 物 ， 看 起 來 對 於 ABTS 自 由 基 皆 無 太 大 的 清 除 活 性 。 此 類 自 由 基 之 清 除 能 力 與 氫 離 子 的 提 供 能 力 有 關 ， 氫 離 子 提 供 能 力 越 強 其 清 除 活 性 越 好 。 本 次 實 驗 所 分 離 出 兩 種 新 的 化 合 物 皆 沒 有 清 除 自 由 基 之 活 性，可 能 因 為 化 合 物 1 在 C-22 上 有 一 個 氧 原 子 ； 化 合 物 2 在 C-3 上 也 有 一 個 氧 原 子 故 沒 有 將 ABTS⁺ → ABTS 因 此 在 清 除 活 性 上 較 不 明 顯 。

經 由 xanthine oxidase ( XO ) 酵 素 的 作 用 後 會 使 氧 原 子 還 原 成 超 氧 陰 離 子 ( O2.- )， 在 前 言 中 就 有 提 到 此 類 自 由 基 的 活 性 較 大 ； 也 知 到 自 由 基 與 疾 並 具 有 很 大 的 關 聯 ， 故 利 用 活 性 試 驗 去 測 試 化 合 物 是 否 具 有 抑 制 酵 素 的 活 性 。 在 xanthine oxidase ( XO ) 抑 制 活 性 試 驗 中 化合物 1 、 2 及 4 不 論 在 高 濃 度 或 是 低 濃 度 下 皆 沒 有 抑 制 活 性 ；化 合 物 3 及 5 在 高 濃 度 下 皆 有 顯 著 之 抑 制 活 性 ， 其 IC 50 分 別 為 117.708 ± 3.58 μM 及 177.83 ±2.07 μM 。由 文 獻 結 果 顯 示 ⁴⁹， 抑 制 酵 素 的 活 性 與 氫 離 子 的 鍵 結 有 相 當 直 接 的 關

65 

聯 可 能 在 結 構 上 有 hydroxyl ( OH ) 基 ， 或 又 是 在 結 構 上 具 有 carbonyls ( C=O ) 基 這 些 都 會 使 抑 制 酵 素 的 活 性 增 加 。 本 次 實 驗 所 分 出 化 合 物 2 在 C-3 有 carbonyl 基 ， C-16 有 β 位 向 的 hydroxyl (OH) 基 ； 但 卻 沒 有 抑 制 活 性 與 文 獻 論 述 不 同 ， 可 能 是 因 為 C-3 之 carbonyl 基 在 苯 環 上 不 易 與 酵 素 作 用；C-16 上 的 hydroxyl (OH) 基 可 能 是 β 位 向 也 不 易 與 酵 素 作 用，因 此 沒 有 抑 制 活 性 。

由 本 次 的 實 驗 結 果 可 得 知 ， 化 合 物 1 及 2 由 於 這 兩 種 新 的 化 合 物 屬 於 lanostanoids 類 型，在 自 由 基 的 清 除 能 力 上 較 不 具 有 活 性 ， 可 能 此 類 的 化 合 物 具 有 其 他 的 生 物 活 性 值 得 更 深 入 的 探 討 與 研 究 ， 將 來 可 以 做 細 胞 毒 性 試 驗 或 是 更 深 入 去 探 討 其 作 用 的 機 轉 等 。 而 在 松 杉 靈 芝 中 可 能 還 具 有 其 他 之 活 性 成 分 還 尚 未 被 發 現 ， 將 來 可 以 在 朝 這 方 面 去 做 更 多 及 深 入 的 研 究 ， 並 將 這 些 從 天 然 物 所 得 之 化 合 物 ， 應 用 在 食 品 業 或 是 新 藥 之 開 發 。