以中草藥複方生產低膽固醇與

(1)

國立臺東大學生命科學系碩士論文

Department of Life Science National Taitung University

Master Thesis

以中草藥複方生產低膽固醇與高卵磷脂含量雞蛋之研究

Study on the Effect of Chinese Medicine Herbal Complexs on the Production of

Egg with Low Cholesterol and High Phosphatidylcholine Contents

研究生: 黃復華撰 Student: Fu Hwa Huang 指導教授: 李俊霖博士 Advisor: Chun-Lin Lee, Ph.D.

中華民國 103 年 1 月

January 2014

(2)

(3)

國立臺東大學生命科學系碩士論文

（以中草藥複方生產低膽固醇與高卵磷脂含量雞蛋之研究）

研究生：黃復華撰指導教授：李俊霖博士

中華民國 103 年 1 月

(4)

I

(5)

I

(6)

謝辭

大學畢業後多年重新返回校園學習，內心充滿矛盾，經過漫長的 3 年半學習，

工作與課業雙重壓力下,勉力完成相關學分進修ヽ試驗與論文撰寫。其中受益匪淺之處不少，尤其專業學識方面，均有深刻學習及體會。因為以在職生身分進修，

每日工作之餘方能利用下班時間思考相關課業問題，往往思維片段無法連貫。故要感謝指導教授李俊霖老師就學期間不斷地指導與指正，尤其是試驗與論文撰寫修改方面，方能如期完成，及口試時江啟銘老師ヽ魏百祿老師之建議與指正，至為感激。

本校生科系課程安排具有多方面之學科，有動物ヽ生態及植物等相關課程，

求學期間除專題報告等碩士班必修課目外，更選修一些本身有興趣ヽ有實用性與知識性之課目，如李俊霖老師有關論文撰寫ヽ生物技術等課程，魏百祿老師之中草藥研究法，李炎老師生物訊息學，黃祥恩老師植物轉殖工程與分子病理學，與學生進台東大學生科系研究所前預期研習目標完全相符，接觸些不同領域，同時也開拓學生視野。因本身白天上班一般到實驗室多為晚間下班或星期假日時間，

同時研究題目與實驗室內其他同學迥然不同，與實驗室內其他同學較無法討論，

但同學在實驗時仍幫助不少，尤其協尋相關藥品與儀器存放處。能夠到東大進修，

更要感謝前台東縣動物防疫所陳志峰所長鼓勵，所長不論工作或學習幫助之處，

在此不再累述，國立台東專校現就職單位校長各級長官及本科張主任之支持，在校務科務繁忙下仍同意學生進修，除感謝外仍是感謝。

學海無涯，有人曾說畢業才是學習的開始，對中草藥之研究應會持續不斷。

繼往開來，中草藥科學化應不只是一句口號，前人數千年累積經驗，有其缺點但應也有可取之處，相信在相關分析檢驗技術不斷進步下，對其了解應更為明朗，

更可造福於人群。簡而言之，台東大學生科系 3 年多的學習過程，值回票價。

I

(7)

縮寫表 (Abbreviation)

ACh (acetylcholine)：乙醯膽鹼

AChE (acetylcholinesterase)：乙醯膽鹼酯酶 Apo (apolipoprotein )：載脂蛋白

ALT (alanine aminotransferase) : 氨基丙酸轉氨酶 AST (aspartate aminotransferase): 天門冬酸轉氨酶 BHA (butylated hydroxylanisole): 丁基羥基甲氧苯 BHT (butylated hydroxytoluene): 二丁基羥基甲苯 CTP (cytidine triphosphate):胞苷三磷酸

DPPH (α,α-diphenyl β-picrylhydrazyl): 1,1-二苯基苦味肼基自由基 FSH (follicle-stimulating hormone) :濾泡刺激素

HDL-C (high density lipoprotein cholesterol)：高密度脂蛋白膽固醇

HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A)：羥甲基戊二酸輔酶 A HPLC (high performance liquid chromatography): 高效能液相層析法

IDL (intermediate low density lipoprotein)：中密度脂蛋白

LCAT (lecithin cholesterol acyltransferase):卵磷脂膽固醇脂醯基轉移酶 LDL-C (low density lipoprotein cholesterol)：低密度脂蛋白膽固醇 LPS (lipopolysaccharide)：脂多醣

LPL (lipoproitein lipase):脂蛋白脂解酶 LH (luteinizing hormone): 黃體刺激素

MDD (mevalonate 5-diphosphate decarboxylase):甲羥戊酸5-焦磷酸脫羧酶 MVD (mevalonate pyrophosphate decarboxylase):甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧酶 NF-κB (nuclear factor kappa B)：制核因子

PBS (phosphate buffer saline)：磷酸緩衝液 PCh (phosphatidylcholine): 卵磷脂

PUFA (polyunsaturated fat):多元不飽和脂肪酸 PL (phospholipid):總磷脂質

ROS (reactive oxygen species)：活性氧原子 SOD (superoxide dismutase):超氧歧化酶 TC (total cholesterol)：總膽固醇 TG (triglyceride)：三酸甘油酯 TMA (trimethylamine):三甲胺 VTG (vitellogenin):卵黃蛋白原

VLDLR (very low density lipoprotein receptor): 極低密度脂蛋白受體 VLDL (very low density lipoprotein):極低密度脂蛋白

VLDLy (very low density lipoprotein y):極低密度脂蛋白y XO (xanthine oxidase):黃嘌呤氧化酶

I

(8)

中文摘要

雞蛋中膽固醇、卵磷脂為雞胚胎組織器官發育之重要營養來源。膽固醇食用後主要為人體合成維他命 D 及各種類固醇類激素等重要代謝前驅物質，但攝取過多時可導致動脈硬化而發生心血管、中風及糖尿病等疾病。雞蛋為富含各種營養物質，但普遍認為膽固醇含量過高而不敢食用，故需適度調控降低雞蛋中膽固醇含量；而卵磷脂具有預防心血管及神經退化性疾病等之多項生理活性。鑑於目前降低雞蛋膽固醇含量之研究，多以使用降膽固醇藥物或飼料中添加各種礦物質，

往往影響雞隻與人體健康，造成雞蛋藥物殘留及雞隻糞尿代謝產物排泄汙染環境。

中草藥複方正確使用時，具有多途徑、多效性及多組織器官目標與不易產生抗藥性特性。鑒於中草藥分析方法，除傳統五行邏輯理論及「君、臣、佐、使」配伍用藥理論辯證施治外，亦可以現代科學統計試驗方法分析研究複方。本試驗目的希望以現代統計分析方法分析中草藥複方作用功效，同時生產安全、無藥物殘留及無汙染環境之保健雞蛋。方法係使用複方中草藥以飼料添加劑方式添加於蛋雞飼糧中，藉以降低雞蛋中膽固醇與提高卵磷脂之含量。試驗設計係利用正交 T 值法將黃耆、黨參、刺五加、當歸、淫羊藿、何首烏 6 種中草藥複方型式組合，

以正交 T 值表及 2 水平劑量 (添加與不添加) 分為 12 組，每組 10 隻，添加於蛋雞飼糧中，為期 5 週；試驗動物為 12 週齡海蘭蛋雞，飼養至平均每日產蛋率 8 成以上；試驗結束後採集雞蛋及雞隻血清，檢測雞蛋蛋黃中膽固醇、卵磷脂、三酸甘油酯及血清中膽固醇、三酸甘油酯含量。以正交 T 值法分析結果顯示，在複方中草藥主藥或輔助功效藥分析方面，黨參、當歸、淫羊藿於降低膽 固醇作用具顯著效果 (p＜0.05)，刺五加也有降膽固醇作用但未達顯著效果，黃 耆ヽ何首烏則為輔助功效；黃耆、淫羊藿、何首烏於提升卵磷脂作用則達顯著效 果 (p＜0.05)，當歸有增加卵磷脂作用但未達顯著效果，黨參、刺五加則為輔助 功效。以 Dunnett’s test 分析比較各試驗組 (第 1 至 11 組)與對照組 (第 12 組，

未添加中草藥)，蛋重方面結果顯示，各試驗組與對照組比較無顯著差異 (p＞

0.05)。血清中膽固醇含量各試驗組與對照組比較則無顯著差異 (p＞0.05)，三酸 甘油酯全複方試驗組則達顯著差異 (p﹤0.05)。蛋黃中膽固醇含量之結果顯示，

黃耆、黨參、刺五加、當歸、淫羊藿、何首烏組顯著低於對照組 (p＜0.05)。蛋 黃卵磷脂含量之結果顯示，黃耆、黨參、刺五加、當歸、淫羊藿、何首烏組及黃 耆、淫羊藿、何首烏組顯著高於對照組 (p＜0.05)，蛋黃三酸甘油酯之結果顯示，

各試驗組與對照組間則無差異性 (p＞0.05)。綜合分析顯示含六種中草藥之全複 方試驗組具有最合宜及顯著的降膽固醇與提升卵磷脂之效果。在雞隻飼養健康狀況指標評估則檢測血清中肝臟之天門冬酸轉胺酶 (aspartate aminotransferase, AST)、氨基丙酸轉胺酶 (alanine amino transferase, ALT) 及腎臟肌胺酸酶 (creatinine) 酵素，結果顯示，各試驗組與對照組間均無顯著差異 (p＞0.05)，表 示蛋雞試驗期間生長正常。雞蛋內中草藥藥物殘留檢測方面，則使用 high

II

(9)

performance liquid chromatography (HPLC) 分別檢測全複方中草藥ヽ添加全複方及未添加中草藥之雞蛋，結果未發現中草藥成分殘留於雞蛋中，驗證本複方中草藥及雞蛋為無藥物殘留，具有食品安全性。試驗結束並採集肝臟組織，肉眼病理觀察無任何病變，組織病理切片化學染色，鏡檢觀察肝臟細部脈管組織及肝細胞型態，均未發現損傷。再則檢驗全複方及各單味中草藥抗氧化能力，全複方中草藥及黃耆ヽ當歸ヽ黨參ヽ刺五加ヽ何首烏ヽ淫羊藿甲醇提取物，中草藥甲醇提取液在濃度 3.75 mg/mL 至 120 mg/mL 範圍內檢測對 DPPH 自由基清除能力。於提取液固定濃度 15 mg/mL 時比較結果依序為淫羊藿 (96.51±0.54%)ヽ刺五加 (95.37±0.41%)ヽ當歸 (66.22±1.29%)ヽ黃耆 (65.95±8.62%)ヽ全複方中草藥 (61.15±11.72%)ヽ何首烏 (47.19±13.60%)ヽ黨參 (42.83±14.79%)。

關鍵字：正交 T 值法、蛋雞ヽ雞蛋、膽固醇、卵磷脂

III

(10)

Study on the Effect of

Chinese Medicine Herbal Complexs on the Production of Egg with Low Cholesterol

and High Phosphatidylcholine Contents

Abstract

Cholesterol and phosphatidylcholine in egg are important source of nutrition of chicken embryonic organ development. Cholesterol mainly for the body to vitamin D and a variety of steroid hormones and other important metabolic precursors, but too much can cause atherosclerosis, cardiovascular disease, stroke and diabetes. Egg is rich in various nutrients, but it is generally believed that a high level of cholesterol and dare not eat, so need to control appropriate lower cholesterol content in egg. Pho- sphatidylcholine has some protective effects of cardiovascular, neurodegenerative diseases, and physiological activity. In view of the current research on reducing cholesterol content of egg, to drop the use of cholesterol drugs or add a variety of minerals in the feedstuffs, often affect the chicken and human health, causing egg drug residue and chicken excretion and urine excretion of the metabolites of environmental pollution. Chinese herbal medicine when used correctly, has the multi-way, multi-organs and target pleiotropic effects and is not easy to produce drug resistance characteristics. In view of Chinese herbal medicine analysis method, in addition to the traditional five elements theory, can also use methods of modern scientific statistical analysis to study the effects of compound. The objective of the experiment was to use modern statistical analysis method in the analysis of compound Chinese medicine efficacy, and production safety, no drug residue and no pollution to the environment and health egg. The purpose of this study is to investigate the effects of different assembly of dietary Traditional Chinese Medicine herbs (TCM) for decreasing cholesterol and increasing phosphatidylcholine concentration of egg yolk in laying hens. Hyline laying hens of 35-week old were separated into 12 groups fed with basal feedstuffs and treatments with Astragalus membranaceous, Codonopsis tangshen Oliv, Acanthopanax senticosus, Angelica sinensis (Oliv) Diels, Epimedium grandiflorum Morr and Polygonum multiflorum Thunb by orthogonal t value design respectively. The experimental period lasted 5 weeks. Eggs and blood were collected

IV

(11)

for samples at end. Plasma and egg yolk contents of cholestrol and phosphatidylcholine were measured by Elisa assay kit. In egg yolk cholesterol, the results of experimental group by TCM compound was significantly lower than control group, and phosphatidylcholine was higher statistically significant (p<0.05).

Triglyceride contents in egg yolk were no difference (p＞0.05). Plasma cholesterol did not change significantly,triglyceride was significant (p<0.05). Plasma aspartate aminotransferase (AST)、 alanine aminotransferase (ALT) and creatinine were no difference between experimental and control group (p＞0.05). The biopsy liver tussues were observed by H&E staining. The TCM compound experimental group did not cause drug-induced hepatocellular injurying. The TCM compound and egg yolk were analyzed for medicine residues by high performance liquid chromatography (HPLC) method, and did not find any substance of TCM in egg yolk. The antioxidant and antiradical of the TCM were determined by the DPPH method. The ability of DPPH free radical scavenging of herbal medicine:Epimedium (96.51±0.54%) >

Acanthopanx (95.37±0.41%) > Angelica (66.22±1.29%) > Astragalus(65.95±8.62%)>

fully herbal medicine complexs (61.15±11.72%) > Polygonum multiflorum (47.19±13 .60%)> Codonopsi (42.83±14.79%) at concentration 15 mg/mL. The conclusions showed that egg yolk cholesterol were significantly decreased and increased phosphatidylcholine contents of egg yolk by TCM treatments (p＜0.05), and safety.

Keywords: orthogonal t value designヽlaying hensヽeggヽcholesterolヽphosphatidy- lcholine

V

(12)

隨著國民生活水準提高，食品種類發展日趨多樣化，除傳統食品外，功能性健康食品日漸蓬勃發展。傳統上雞蛋為人們日常重要營養補充來源，具有高營養價值及價格低廉之特性，但雞蛋中膽固醇普遍含量較高 (平均 200-300 mg/egg) (丁及張 2007)，過多食用有可能影響心血管健康。近年來，研究如何調控及降低雞蛋中膽固醇含量；及利用雞蛋作為載體，承載各種人類有興趣或缺乏之營養物質，成為研究保健食品營養重要題目之一。雞蛋中因含有各種豐富維他命、微量元素、蛋白質等營養物質，尤其以富含卵磷脂為其特點，卵磷脂生理活性，除可促進膽固醇排泄，也是人體合成神經傳導物質乙醯膽鹼的主要原料 (吳等 2001)。

中草藥具多途徑、多效性及多組織目標特性，中藥方劑因根據特有的傳統木ヽ火ヽ土ヽ金ヽ水五行邏輯理論及「君、臣、佐、使」配伍用藥理論辯證施治，

普遍認為缺乏科學理論。使用時可單方或複方，近代研究天然物化學發現每一單方中草藥具有多種的生理活性物質及藥效，但生理活性與藥理功能較為單純，如為複方處方則為多種中藥組合，生理活性物質及藥效應更多效性。分析中藥複方間之交互作用除了以傳統中醫理論方法外，近來如何使用現代科學統計試驗方法分析複方，一直為研究人員致力的主題之一。

本試驗研究係使用中草藥複方添加於蛋雞飼料中，希望能合理顯著降低雞蛋蛋黃中膽固醇與提高卵磷脂 (phosphatidylcholine, PCh) 含量，利用正交 T 值法分析中藥複方中主要功效中藥與輔助功效中藥之關係。試驗設計將 6 種中草藥利用正交 T 值表及 2 水平劑量 (添加與不添加) 分配為 12 組，每組 10 隻，

每日 1 次 1 ％劑量添加於飼料中；5 週試驗結束後採集雞蛋及採血，檢測蛋重ヽ雞蛋蛋黃中膽固醇、卵磷脂、三酸甘油酯及血清中膽固醇、三酸甘油酯含量，

動物健康生長狀況安全性指標則為檢測血清中 alanine aminotransferase (ALT) 、 aspartate aminotransferase (AST) 及 creatinine。雞蛋內中草藥藥物殘留檢測，則使用 HPLC 分別檢測全複方中草藥ヽ添加全複方及未添加中草藥之雞蛋，檢測分析雞蛋中是否有中草藥殘留問題。並採集肝臟組織，經肉眼病理觀察及組織病理切片以 H&E 化學染色，鏡檢觀察肝臟細部脈管組織及肝細胞型態，檢查肝臟是否有發生中草藥中毒造成之病理變化。同時檢測中草藥 DPPH 自由基清除率，

藉以了解全複方及各單味中草藥之自由基清除能力。

1

(17)

第一章文獻回顧

第一節雞蛋生產與蛋雞飼養

一、雞蛋組成成分

雞蛋成分大致由蛋殼、蛋白和蛋黃組成，雞蛋各組成成分如表 1-1 所示 (Kovacs-Nolan et al. 2005; 李 2002; 趙等 2006)。

(一) 蛋殼成分

蛋殼從內至外由 2 層蛋殼膜、蛋殼及蛋白質透明薄膜組成，內外蛋殼膜為角質蛋白纖維交織而成，外膜空隙較大，內膜較緻密，細菌不易侵入。蛋殼主要由碳酸鈣形成，含少量碳酸鎂、磷酸鹽、檸檬酸鹽、鉀及鈉等元素。

(二) 蛋白成分

蛋白為半流動膠狀物質，分為濃蛋白及稀蛋白，由多種醣蛋白質及蛋白質營養成分組成。卵清蛋白質具有可提供胚胎發育。卵轉鐵蛋白質可將鐵質轉送至胚胎。類卵粘蛋白質含糖成分較高具有抑制胰蛋白酵素。卵粘蛋白質為不溶性纖維酸性蛋白質，表現濃蛋白凝膠性質。抗生物素蛋白質與生物素結合，使生物素失活性。溶菌酶對細菌細胞壁有溶解活性，可水解多醣類，具化學防禦功能，阻止細菌通過蛋殼進入蛋內。

(三) 蛋黃成分

蛋黃為雞蛋營養成分最多部分，富含蛋白質、脂質、礦物質、維生素及水份等養分，蛋白質主要有卵黃蛋白質、卵黃高磷蛋白、卵黃球蛋白、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白。脂質以三酸甘油酯及磷脂質 (卵磷脂、腦磷脂及鞘磷脂) 為主。

二、蛋雞產蛋生理機制與內分泌激素關係

禽類產蛋機制過程大致為濾泡細胞發育，卵黃形成，蛋清形成，蛋殼形成。

卵巢濾泡細胞發育受內分泌系統影響，不同發育時期受不同激素影響。其中主要為濾泡刺激素 (follicle-stimulating hormone, FSH) 及黃體刺激素 (luteinizing hormone, LH)，FSH 經 protein kinases A (PKA) 及 protein kinase C (PKC) 信號途徑促使濾泡逐漸發育成熟，而 LH 促進類固醇激素合成和分泌，促使成熟濾泡排卵。濾泡發育至某階段 FSH 能使濾泡細胞內顆粒細胞產生 LH 受體，誘導 LH 分泌，共同促進濾泡細胞成熟，同時刺激成熟濾泡內顆粒細胞雌激素在體內變化趨勢與黃體刺激素變化一致，在產蛋期間維持高濃度，隨產蛋期逐漸一起下降，至停產期降至最低。雞蛋形成過程如圖 1-1 (阮等 2010；俞 1964；曹等 2012；劉 1990； Liu et al. 2010)。雞蛋卵黃之合成主要先由卵黃前體主要由極低密度脂蛋白 y (very low density lipoprotein y, VLDLy) 及卵黃蛋白由極低密

2

(18)

表 1-1. 雞蛋各組成成份 (Kovacs Nolan et al. 2005; 李 2002; 趙等 2006) Table 1-1. Compositions of the egg

Egg weight

(g)

Egg shell

(%)

Egg white (%)

Egg yolk (%)

Water (%)

Protein (%)

Fat (%)

Carbohydrate

(%)

Ash (%)

Energy

(KJ) 58 12.3 55.8 31.9 73.6 12.8 11.8 1.0 0.8 400

3

(19)

圖 1-1. 雞蛋形成過程 (阮等 2010；俞 1964；曹等 2012；劉 1990) Fig 1-1. Egg formation process

卵巢濾泡細胞發育受雌激素等內分泌調控

濾泡細胞發育成熟

脂類逐漸沉澱於發育中濾泡細胞內形成蛋黃

輸卵管澎大部、峽部分泌蛋清蛋白質及內外蛋膜包覆

子宮部殼腺分泌鈣

形成雞蛋

肝臟受雌激素刺激生合成 VLDLy 和 VTG，組成卵黃前體運輸至卵巢

4

(20)

度脂蛋白 y (very low density lipoprotein y, VLDLy) 及卵黃蛋白(vitellogenin, VTG) 組合形成，卵黃前體經微血管通過發育中濾泡上各種基底膜，由濾泡上極低密度脂蛋白受體 (very low density lipoprotein receptor, VLDLR) 介導胞噬作用轉運進入卵母細胞。濾泡上基底膜為選擇性過濾膜，卵黃前體因顆粒較小可通過，而飼糧經小腸等組織消化吸收合成之大顆粒之脂肪及脂蛋白則無法通過，一些維生素ヽ免疫球蛋白等營養物質則可從血液中被吸收進入卵母細胞而進入卵黃中。經試驗證實使用放射性同位素 C¹⁴ 標記血液中 VLDL 含量與蛋黃中 VLDL 含量無關。蛋黃中膽固醇含量與載脂蛋白顆粒中膽固醇含量有關，而不是由血漿中膽固醇含量決定的 (Bacon 1986)。

三、蛋雞產蛋基本營養需求

產蛋是複雜生理過程，受外界各項因素影響，如品種、飼養管理、疾病、雞隻生長期和飼料中各營養成分含量。在雞蛋生產上，每顆雞蛋含約 273～420 KJ，

蛋雞維持每公斤體重代謝能約需 460 KJ。通常每產一顆蛋約需蛋白質 13～15 g，

基本上產蛋率 70％時應飼餵 17％蛋白質的飼料，產蛋率每提高 10％，飼料中蛋白質水平應大約提高 1％。產蛋必需胺基酸需求有 methionine, lysine, tryptophan, arginine, histidine 等，飼料胺基酸的含量於產蛋效率一般為 0.55～

0.88。鈣質是產蛋最重要礦物質，影響產蛋率。飼料中鈣利用率約 50～60％，

每產 1 顆蛋需要約 3～4 g 鈣，鈣需求量取決於產蛋率、雞隻體型大小、禽舍溫度、採食量、蛋雞年齡及品種。植物飼料中磷來源大多以植酸磷 (phytic acid phosphorus) 形式存在，但因家禽消化系統缺乏植酸酶 (phytase) 故利用率低 (30

％)，腸道代謝時主要以有效磷 (available phosphorous) 為主。有研究 0.3％的有效磷與 4.0％的鈣可使蛋雞獲得最大產蛋量和最佳蛋殼質量，3.5％鈣和 0.55％總磷可使來航雞 (leghorn) 有最高孵化率。一般來說蛋雞總磷需求約 0.6

％，飼糧鈣 3～4％，鈣磷比約 5～6：1。產蛋時微量元素需求: 約鐵 50 mg/kg，

銅 3 mg/kg，錳 25 mg/kg，鋅 50 mg/kg，硒 0.1 mg/kg，碘 0.3 mg/kg (Zimmerman 1997)。維生素需求詳如表 1-2 所示。

四、影響蛋雞產蛋率因素

影響蛋雞產蛋率條件，主要分為飼養管理因素與飼糧營養因素。

(一) 飼養管理方面，以光照時間及強度為主，動物體皮膚內含無活性之維生素 D3 激素原 (7-dehydrocholesterol) 經紫外線照射後轉變 cholecalciferol，經肝臟羥基化反應生成 25-Hydroxy D3 (calciferol) ，再經腎臟進一步羥基化變為 1,25-(OH)2 cholecalciferol，而調節鈣、磷代謝，使血液中鈣、磷之間趨於最適比例，増進小腸、腎臟及骨骼吸收鈣質，加速鈣質在蛋殼中沉積。蛋雞飼養環境理想光照時間大約為 16 至 17 小時，光照強度約為 2 瓦/平方公尺，光源高度 2 公尺。(二) 在飼糧營養方面，能量為蛋雞維持生命及生產繁殖性能，能量攝入量可影響蛋重，能量不足，會導致雞蛋變小，如長期不足，產蛋量會下降。飼

5

(21)

表 1-2. 產蛋雞維生素需求表 (Zimmerman 1997) Table 1-2. Laying hens vitamin requestments

Components (unit) Contents Vitamin A (IU/g) 4000 Vitamin D3 (IU/g) 500 Vitamin E ( IU/g) 5

Vitamin K (IU/g) 0.5 Vitamin B1 (mg/kg) 0.8 Vitamin B2 (mg/kg) 2.2 Vitamin B6 (mg/kg) 3 Vitamin B12 (mg/kg) 0.003 Propanoic acid (mg/kg) 2.2

Biotin (mg/kg) 0.1

Choline (mg/kg) 500 Folic acid (mg/kg) 0.25

6

(22)

糧中蛋白質及胺基酸，在蛋雞方面除為維持及生長外，主要影響產蛋量及蛋重。

由於蛋殼成分主要為碳酸鈣，飼糧中鈣、磷含量或比例影響雞隻腸道吸收至鉅，

蛋雞缺鈣，不僅導致骨骼結構發生異常，礦質化障礙，產蛋率下降及軟殼蛋發生增加。維生素 A 缺乏，易使產蛋率下降，薄殼蛋易碎蛋增加。維生素 C 可降低糖皮質激素，提高雞隻對熱應激之能力。維生素 E 為蛋雞必須維生素，能夠調節腦下垂體前葉分泌促性腺激素，因而影響繁殖性能，缺乏時，卵巢機能下降。

在微量元素，影響蛋禽生產性能，錳、鋅、硒、鉻最為重要 (Ward 2003; 黃 1993)。

五、飼料營養成份對雞蛋品質的影響

雞蛋品質包括蛋種、蛋殼質量、蛋殼顏色、蛋形指數等外部品質及蛋黃高度、

蛋黃顏色、蛋黃膜強度、化學成分等內部品質。生產者與消費者一般比較注意雞蛋重量、蛋殼品質、蛋黃顏色與化學成分特性。因近年來研究低膽固醇雞蛋因素，

許多試驗證實利用飼料中添加各種試驗物質如紅麴、 Cu²^＋、殼聚精、大蒜素ヽ有機络等能調控雞蛋膽固醇含量 (Pesti and Bakalli 1998; Wang and Pan 2003)。衍生利用魚油、油菜籽油、亞麻仁油添加飼糧中，提高蛋黃中 n-3 脂肪酸及 n-3 與 n-6 脂肪酸之比例。後續人們研究如何提升高品質保健食品，提高雞蛋中各種維生素；飼糧中維生素含量對雞蛋中維生素含量影響極大，維生素由飼糧中轉移至蛋中效率依次為：維生素 A (60％～80％)＞核黃素、泛酸、生物素、維生素 B12 (40％～50％)＞維生素 D3、維生素 E (15％～25％)＞維生素 K、維生素 B1 和葉酸 (5％～10％)。另外蛋雞飼料中添加 2％～10％海帶提取物，可產生高碘雞蛋。目前還有高硒蛋、高鋅蛋及高鐵蛋等產品 (高及張 2004)。

(一) 飼料營養成分對蛋重的影響

飼料營養成分影響蛋重主要是能量、蛋白質水平等。蛋白質水平過低，蛋白質代謝功能降低，不但影響蛋重，同時也會影響產蛋率。能量供應充足有利於體內蛋白質代謝，因而增加蛋重，不足時蛋重減輕。另外因亞麻油酸是雞體內必需胺基酸之一，參與脂肪合成代謝作用，可影響蛋黃形成之質量和重量 (March and Macmillan 1990; 呙 1997)

(二) 飼料營養成分對蛋殼質量的影響

鈣為蛋殼主要成分，蛋雞飼料中鈣質不足，蛋殼的厚度及強度均會降低，一般而言，補鈣時顆粒較大者，吸收效果較好。磷與鈣代謝有關，但含量過高會降低蛋殼品質。同時維生素 D 與鈣磷代謝有關，故也會影響蛋殼品質，含量不足時蛋殼強度與厚度會下降。

(三) 飼料營養成分對蛋黃顏色的影響

主要受飼料中色素含量影響，玉米中玉米黃素對蛋黃者色效果較佳。添加葉黃素也可有相同效果，因葉黃素溶於脂類，在腸道中與脂肪一起被吸收。在飼糧

7

(23)

中加抗氧化劑維生素 E，可防止色素氧化，提高色素對蛋黃著色。添加不飽和脂肪酸時效果更好。

(四) 飼料營養成分對雞蛋風味的影響

雞蛋風味受飼料中氣味物質有關。三甲胺 (trimethylamine, TMA)、魚粉及辣椒等均會影響蛋黃風味 (高及張 2004)。

8

(24)

第二節蛋雞膽固醇與卵磷脂相關生合成代謝

一、膽固醇化學結構與代謝產物生理活性

膽固醇，化學式 C₂₇H46O，不溶於水。廣泛存在於動物體的細胞膜中，為構成細胞膜重要組成成分，維持體內各組織器官細胞正常生理功能 (圖 1-2)。肝臟中膽固醇經膽管排入小腸與食物中脂肪混合，將大顆粒脂肪變成小顆粒，使其易於與小腸中消化酶作用；大部分膽酸被重吸收入血液中，其餘膽酸隨糞便排泄體外。同時也是合成維生素 D、腎上腺皮質激素、雄性激素及雌性激素等重要類固醇賀爾蒙的前驅物質，參與體內醣類、蛋白質、脂肪、水、電解質及礦物質等代謝。在血液中主要與脂蛋白結合形成低密度脂蛋白 (low-density lipoprotein) 及高密度脂蛋白 (high-density lipoprotein) 存在，膽固醇代謝轉化途徑如圖 1-3 所示。

二、血脂形成及降低途徑機制

血脂泛指血液中所含脂類總稱，大致包括膽固醇、三酸甘油酯、類脂質及脂蛋白等級。血液中含量受年齡、飲食成分、遺傳、脂質代謝功能和疾病等許多因素。脂蛋白中蛋白質為載脂蛋白 (apolipoprotein, Apo)，因載脂蛋白的質及量不同，，載脂蛋白是決定脂蛋白結構、功能及代謝中心。脂蛋白含 VLDL、LDL 及 HDL。VLDL 在哺乳類動物肝臟中合成富含三酸甘油酯 (80％～90％)，是體內轉運合成內源性三酸甘油酯，主要載脂蛋白有 AⅠ、AⅡ、B₄₈、B₁₀₀、CⅠ、CⅡ、C

Ⅲ 和 E 等。VLDL 血液中轉變為 IDLヽLDLヽHDL 分別富含不同比例膽固醇，

為將肝臟合成之膽固醇轉運到各組織主要形式，主要載脂蛋白為 AⅠ、AⅡ、CⅠ

ヽ B₁₀₀ヽB₄₈等。HDL 含蛋白質最高 (約 45％～55％)，能夠將各組織中膽固醇經卵磷脂膽固醇脂醯基轉移酶（lecithin-cholesterollacyltransferase, LCAT）途徑逆向轉送回肝臟進行代謝後排除於體外 (張等 2004)。

目前降血脂主要機制途徑方法有

(一) 提高 LPL 和卵磷脂膽固醇醯基轉移酶的活性，增加 HDL 含量，促進脂質分解代謝，抑制脂質合成轉運及動脈壁上的沉積。

(二) 抑制肝臟內膽固醇合成速率限制酶如 HMG-CoA reductase。

(三) 促進體內膽固醇轉化成膽酸之酵素活性如 7α-hydroxylase，進而加速排泄腸道及抑制腸道內膽固醇吸收作用 (圖 1-4)。

(四) 加強抗氧化作用來降脂，自由基濃度過高易引發脂質過氧化自由基反應，

造成膜脂質破壞，體內 HDL cholesterol (HDL-C)ヽLDL cholesterol (LDL-C) 脂質代謝混亂，膽固醇等脂質無法順利排除，透過清除體內多餘自由基可達到降血脂的目的(Hermier 1997; 張等 2004)。

三ヽ蛋雞膽固醇生合成途徑

9

(25)

產蛋母雞膽固醇生合成代謝途徑大致與哺乳類動物相同。蛋雞卵巢及肝臟是膽固醇主要合成位置，但肝臟是蛋黃中膽固醇合成速度與生成量最多的器官，在細胞內質網及細胞質內進行。肝臟或其他組織器官膽固醇合成代謝途徑主由 2 分子乙醯輔酶 A (acetyl-CoA) 經硫解酶 (thiolase) 合成 1 分子乙醯乙醯輔酶 A (acetoacetyl-CoA) 後再與 1 分子乙醯輔酶 A (acetyl-CoA) 經 HMG CoA 合成酶 (HMG CoA synthetase) 反應結合產生 HMG-CoA 後，HMG-CoA 經 HMG CoA 還原酶 (HMG CoA reductase) 作用後，續轉變為 mevalonate 及 isopentenyl/

geranyl/farnesyl pyrophosphates，而 HMG CoA 還原酶是主要合成速率限制步驟，

決定膽固醇之生合成速度與產量，也是調控體內膽固醇含量之主要關鍵步驟，再形成鯊烯 (squalene)，經 squalene monooxygenase 催化環化反應形成羊毛脂醇 (lanosterol)，之後以 NADPH 為輔因子進行 19 個步驟，最後轉變生合成膽固醇，

膽固醇生合成代謝途徑如圖 1-5 所示 (Liscurn 2002)。

四、蛋黃中膽固醇來源途徑

蛋雞體內膽固醇主要來自外源性食物吸收和內源性生合成。飼料中游離性膽固醇可為被腸道吸收腸道，而膽固醇酯必須在腸道中被酯水解酶水解為游離膽固醇後才可被吸收，被吸收的膽固醇在小腸黏膜細胞中又重新酯化，生成膽固醇酯，

與脂蛋白組合成乳糜微粒由淋巴系統進入血液中。膽固醇內源性主要合成位置是卵巢及肝臟，肝臟則是蛋黃中膽固醇及脂質合成最大部份的主要來源蛋黃中之膽固醇多以非酯化形式存在，在當膽固醇在肝中被合成之後，主要會與載脂蛋白 B100 (apolipoprotein B100) 組成形式經 VLDLy 由血液運輸到卵母細胞，供應卵黃足夠膽固醇，雞蛋中膽固醇主要來源途徑如圖 1-6 所示 (汪及佟 2002)。在雞蛋中膽固醇主要係由血液中極低密度脂蛋白 y (very low density lipoprotein y, VL DLy) 運輸，蛋雞由於產蛋時需要大量脂質，因此不像其他哺乳動物或蛋雞分泌的極低密度脂蛋白 (very low densitylipoprotein, VLDL) 會受到脂蛋白脂解 (lipo proitein lipase, LPL) 予以降解成中密度脂蛋白 (intermediate density lipoprotein, I DL) 和低密度脂蛋白 (low density lipoprotein, LDL)，最主要係因在 VLDLy 中有一個脫輔基脂蛋 apoVLDL-II 其可抑制 LPL 水解。在卵母細胞上經過卵母細胞卵黃生成素受體 (oocyte vitellogensis receptor, OVR) 的胞飲作用，被生長中卵母細胞吸收，而使膽固醇進入蛋黃中 (Grummer and Carroll 1988; 張及張 2005;

陳及張 2003)。

五、蛋雞膽固醇脂蛋白轉運途徑

食物來源和肝臟等組織合成之膽固醇主要以脂蛋白形式通過血液轉送至蛋黃中或周邊組織。禽類脂蛋白包括 VLDL、 IDL、LDL、高密度脂蛋白 HDL 及乳糜微粒 (chylomicron, CM)。產蛋期肝臟主要合成 VLDLy、卵黃生成素 (vitellogenin, VTG) 以及 HDL；血液代謝中產生 LDL，乳糜微粒則在小腸細胞合成 (Walzem et al. 1999; Wilson and Rudel 1994; 丁及張 2007; 曹等 2012)。

10

(26)

圖 1-2. 膽固醇結構 Fig 1-2. Cholesterol structure

11

(27)

圖 1- 3. 膽固醇代謝轉化途徑 (Liscurn 2002) Fig 1-3. Cholesterol metabolic pathway

Cholesterol

Pregnenolone 7-Dehydrocholesterol 7-Hydroxycholesterol

Progesterone

Androgens Mineralocorticoids Glucocorticoids

Cholecaliferol Primary bile acids

Secondary bile acids

12

(28)

圖 1-4. 體內膽固醇經膽酸代謝及排泄途徑 (Hermier 1997; 張等 2004) Fig 1-4. Bile acid-mediated metabolism and excretion pathway

Cholesterol 7α-Hydroxycholesterol 7α-hydroxylase

Bile acids

Primary bile acids

Secondary bile acids

13

(29)

圖 1-5. 膽固醇生合成途徑 (Liscurn 2002) Fig 1-5. Cholesterol biosynthesis pathway

14

(30)

圖 1-6. 雞蛋中膽固醇來源途徑 (汪及佟 2002) Fig 1-6.The transport pathway of egg cholesterol

血液小腸

肝臟

蛋黃

卵巢主要途徑

15

(31)

六、雞蛋膽固醇代謝調控

總結目前研究降低雞蛋膽固醇方法，大致上分為遺傳性因素、營養性因素及非營養性因素。基本上為通過飼糧中添加脂肪酸、中草藥 (或提取物)、植物固醇、

礦物質及 statin 類藥物和遺傳選育等方法。

(一) 遺傳因素：

蛋雞品種、品系及年齡都可影響膽固醇含量。HMG CoA reductase 是體內膽固醇合成過程中的限速酶，apoVLDL-II 在血液中與膽固醇結合，OVR 則通過胞飲作用使脂蛋白完整轉運進入生長中卵母細胞；從這些基因找出影響膽固醇含量，進行相關分子遺傳選育 (汪等 2012)。

(二) 營養因素：

多元不飽和脂肪酸 (polyunsaturated fatty acid, PUFA) 能夠降低血清和雞蛋中膽固醇。在 42 週齡羅曼蛋雞飼料中添加 8％紅花籽油可使血清和蛋黃中膽固醇分別降低 25.17％及 29.37％。飼料纖維素也能影響雞蛋膽固醇含量，可能使腸道中膽固醇加速排泄，降低膽固醇再吸收。微量元素鉻 (chromium) 可降低 LDL-C 的合成，達到降低膽固醇 (張等 1997)。

(三) 非營養因素方面：

植物固醇因與膽固醇結構相似，添加 β-sitosterol 可使蛋中膽固醇下降。

statin 類藥物是 HMG-CoA reductase 抑制劑，lovastatin 抑制 HMG-CoA reductase 活性能有效降低蛋黃膽固醇含量 (Gylling and Miettinen 2005)。

七、卵磷脂化學結構與生理活性

卵磷脂與蛋白質及維生素並列為三大營養素，廣泛存在於動植物體內 (如大豆及蛋類)，以禽類蛋蛋黃含量最為豐富，占乾物質總重 8～10％，卵磷脂之骨架甘油 (glycerol) 3 個碳位分子鍵上連接不同脂肪酸，第 1 位碳上連接幾乎為飽和脂肪酸，第 2 位碳上通常連接油酸、亞油酸、亞麻酸及花生四烯酸等不飽和脂肪酸。功能主要為行使細胞膜的受體、識別、及細胞生長分化，卵磷脂結構如圖 1-7 所示。蛋黃中卵磷脂含量佔磷脂類總量 70％以上，蛋黃中磷脂類 (phospholipid) 組成成分如表 1-3 所示 (譚等 2006)。卵磷脂生理活性方面，有研究比較含 DHA 的蛋黃卵磷脂和含 DHA 豬腦卵磷脂餵飼 Wister 鼠，發現前者不僅能顯著調節 PE (phosphatidylethanolamine) 及 PmE (plasmenylethanolami ne) 中多不飽和脂肪酸比例，而且還能促進自發和誘導乙醯膽鹼（acetylcholine, ACh）釋放 (Moriyama et al. 1996)，Ach 含量增加能促進大腦中神經細胞間傳遞信息速度加快，提高注意力及思維能力，加強記憶力，並能改善各種神經官能症(吳等 2001)。同時卵磷脂是構成細胞膜的重要組成成分，隨年齡增長清除自由基能力下降，過多自由基與不飽和脂肪酸作用形成丙二醛 (malondialdehyde, MDA)，再與蛋白質胺基結合而使脂質與蛋白質交聯形成脂褐素 (lipofuscin)，損傷神經元的代謝傳遞功能；而卵磷脂具備清除自由基能力，可修復損傷之細胞膜，

故其具有延緩衰老功能。卵磷脂中之膽鹼對脂肪有親和力，若體內膽鹼不足，會

16

(32)

圖 1-7. 卵磷脂結構

Fig 1-7. Phosphatidylcholine structure

17

(33)

表 1-3. 蛋黃磷脂類組成成分 (譚等 2006) Table 1-3. Phospholipid composition of egg yolk

Items Contents (%)

Phosphatidylcholine 73.0 Phosphatidylethanolamine 15.0 Phosphatidylinositol 0.5

Sphingomyelin 2.5

Lysophosphatidylcholine 5.8 Lysophosphatidylethanolamine 2.1

Others 1.1

18

(34)

影響脂肪代謝造成脂肪肝，同時可降低血清膽固醇。再則具有乳化分解血脂作用，

清除過氧化物，減少脂肪在血管中滯留時間，增進血液循環，防治動脈粥狀硬化及心、腦血管疾病。卵磷脂不足時可使胰島腺機能下降，胰島素分泌不足，無法有效將葡萄糖運送至細胞中使用，每日攝取足量卵磷脂有助糖尿病的恢復。並且卵磷脂可將多餘膽固醇分解、消化及吸收，而使膽汁中膽固醇保持液體狀態，避免膽結石發生 (吳等 2001)。有研究顯示於天竺鼠飼料中添加 7.5％蛋黃卵磷脂，

餵飼 6 週，可增加血清中 HDL-C 含量 177％而膽固醇含量不會增加 (Cohn et al. 2008)。

八、蛋雞卵磷脂生合成代謝途徑

體內卵磷脂生合成主要以肝臟中最活耀，合成所需之甘油及脂肪酸主要為糖類代謝產物，組成所需之不飽和脂肪酸、磷酸鹽、膽鹼、絲氨酸及肌醇多為食物中或體內合成獲得。食源性卵磷脂於腸道細胞中由磷脂酶 A2 (phospholipase A2) 作用於卵磷脂分子的 C2 脂鍵上分解為溶血卵磷脂 (lysophosphatidylcholine)，再分解為甘油、膽鹼及磷酸鹽後被吸收，由肝門靜脈血液系統進入肝臟。肝臟中膽鹼或乙醇胺在 choline kinase 作用下生成磷酸膽鹼 (phosphocholine) 或磷酸乙醇胺 (phosphoethanolamine)，與經轉胞苷酶 1 或 2 (phosphate cytidylyl transferase 1 或 phosphate cytidylyltransferase 2) 催化下之胞苷三磷酸 (cytidine triphosphate, CTP) 作用生成胞苷二磷酸膽鹼 (cytidine diphosphate choline, CDP-choline) 或胞苷二磷酸乙醇胺 (cytidine diphosphate ethanolamine, CDP-ethanolamine) ，在 diacylglycerol cholinephosphotransferase 作用下與 1,2-diacylglycerol 反應 (同時為肝臟轉化生合成三酸甘油酯關鍵步驟)，最後形成 cytidine monophosphate 與 phosphatidylethanolamine 或 phosphatidylcholine。在肝臟細胞內質網內合成後之卵磷酯，經高基氏體分泌至血液中。卵磷脂生合成另外一途徑為在腸道細胞分解之 lysophosphatidylcholine，經醯基化 (acylation reaction) 後再重新合成卵磷脂，

經組裝成 CM 及 VLDL，結合載脂蛋白 (liproprotein) 後經淋巴系統運送至血液中，卵磷脂生合成代謝路徑詳如圖 1-8 (Hawke 1959; Krishnan Rajalekshmy 2010;

Kushwaha and Jensen 1975; Mackay et al. 1997)。

九、提高雞蛋卵磷酯含量調控

試驗研究提高雞蛋中卵磷脂含量，飼糧中大豆磷脂和膽鹼單獨添加或混和添加，對雞蛋中總磷脂質 (phospholipid, PL) 及卵磷脂含量均能顯著提昇；尤其以 1

％大豆磷脂加 500 mg/kg 膽鹼提高幅度最大 (孫 2010)。大豆磷脂成分主要為卵磷脂 (23％) 和磷脂醯乙醇胺 (20％)，大豆磷脂在雞蛋中磷脂質與卵磷脂含量可能是透過其代謝物膽鹼生合成，當蛋雞食入大豆磷脂後，在體內分解出膽鹼成分，膽鹼進入雞體後一部份會參與脂肪代謝，而另一部分則至 CDP-Choline 途徑來合成卵磷脂，經轉送最終沉積於蛋黃中，因而增加蛋黃中卵磷脂含量。蛋雞卵磷脂合成除可膽鹼經 CDP-Choline 途徑外，也可利用磷脂醯乙醇胺甲基轉移

19

(35)

圖 1-8. 卵磷脂生合成路徑 (Hawke 1959; Krishnan Rajalekshmy 2010;

Kushwaha and Jensen 1975; Mackay et al. 1997)

Fig 1-8. Phosphatidylcholine biosynthesis metabolic pathway Choline

Phosphocholine

CDP-Choline

Liver

Phosphatidylcholine

1,2-diacylglycerol

Cytidine monophosphate

Small Intestinal

Cell Lyso-PC Phosphatidylcholine

Choline, Glycerol, Phosphate Phosphatidyl-

Choline

Acylation reaction

From Portal vein

To liver

Glycerol-3 -phosphate

Glycerol Glucose

choline kinase

20

(36)

途徑合成，有研究指出飼料添加可提供甲基之甜菜鹼與膽鹼，可發揮升卵磷脂效果 (Cohn et al. 2008; Jiang et al. 2001; Krishnan Rajalekshmy 2010)。

十、蛋雞卵磷脂與三酸甘油酯生合成代謝途徑關係

卵磷脂與三酸甘油酯生合成途徑於生成二酸甘油酯 (diacylglcerol) 前為相同途徑，如在 diacylglcerol acyltransferase 反應下加上脂肪酸時則為產生三酸甘油酯；但在加入 CDP-choline 經 1,2-diacylglycerol phosphocholin transferase 作用下，二酸甘油酯與 CDP-Choline 連接則生合成 phosphatidylcholine，肝臟卵磷脂與三酸甘油酯生合成關係詳如圖 1-9 所示 (Budowski et al. 1961; Coleman 2004; Husbands 1970; Vance and Vance 2004)。

十一、雞蛋中卵磷脂運載途徑

雞蛋中卵磷脂運載途徑 VLDLy 與 VTG 為主運載途徑。雛禽時肝臟生合成 VLDL，產蛋期在雌激素調控作用下生合成膽固醇後與細胞內膽固醇酯、卵磷脂及其他脂質與脂蛋白 Apo B₁₀₀ 結合，產生 VLDLy 分泌進入血液。禽類之 VLDLy 脂蛋白因含大量 ApoVLDL-Ⅱ，為 LPL 抑制劑，VLDLy 中之三酸甘油酯不會被組織中微血管內皮細胞上 LPL 降解，即無法轉變成 IDL 和 LDL 轉運代謝，故膽固醇等脂質可由 VLDLy 經血液載運至卵巢卵母細胞，卵母細胞上 OVR 之胞飲作用，吸收沉積形成蛋黃，蛋黃中 95％膽固醇由此途徑形成；蛋黃中膽固醇另一主要來源是卵黃原蛋白 (vitellogenin) ，提供其他 4％膽固醇。

因飼料因素，蛋雞由外源性食物攝入膽固醇量較低，大部分為雞隻體內肝臟及其他組織自行合成，每日內源性合成膽固醇量約 300 mg ，而其中約 200 mg 經血行途徑由脂蛋白轉運至蛋黃中，蛋雞膽固醇及卵磷脂等脂質脂蛋白運送途徑詳如圖 1-10 所示 (Musa et al. 2010; Schneider et al. 1990)。

21

(37)

圖 1-9. 肝臟卵磷脂與三酸甘油酯生合成關係圖 (Budowski et al.

1961; Coleman 2004; Husbands 1970; Vance and Vance 2004) Fig 1-9. Relationship between liver phosphatidylcholine and triglyceride

biosynthesis Glucose

Dihydroxyacetone phosphate

Glycerol-3 -phosphate

Phosphatidic acid Diacylglycerol

Triglyceride

Glycerol

2-Monoacylglyceride

Acyl-coA

CoA glycerol kinase

Acyl-CoA transferase

phophatase diacylglcerol

acyltransferase

Intestinal epithelial cell only

CoA ＋ Fatty acid

Acyl-CoA synthase

Choline Phosphocholine CDP-Choline Phosphatidylcholine

CDP-choline 1,2-diacylglycerol

phosphocholine transferase

22

(38)

圖 1-10. 蛋雞膽固醇、卵磷脂及脂質脂蛋白運送途徑 (Walzem et al. 1999) Fig 1-10. Cholesterol, phosphatidylcholine, and lipid lipoprotein transportation

s of laying hen

23

(39)

第三節降血脂中草藥方劑研究

一、中草藥方劑研究方法

目前中藥複方試驗研究方法，如全方研究、拆方研究、中藥複方藥效研究及中藥複方化學成分研究等。由於研究中藥複方理論基礎不同，由於中藥複方藥效是全體之作用，因此首先要進行全方研究，有助於藥效與臨床療效之間的相關性。

例如黃芩湯全組方對乙酸造成小鼠扭體反應有明顯抑制作用，而該複方中黃芩、

芍藥、甘草、大棗單獨使用則無此療效。而中藥複方拆方研究大致上可分為 2 種途徑，一是根據中醫傳統理論按不同治法或君臣佐使拆方研究，二是依據數學統計方法角度，對配方特性予以量化探討。方法大致如下

(一) 單味藥研究法：中藥複方中單味藥與全複方個別比較，找出主作用藥物，

並了解各味藥間協同、拮抗作用。

(二) 藥對研究法：主要研究配伍規律。

(三) 藥物組間關係研究法：按複方中藥物功效及性味關係分類比較。

(四) 拆藥分析法：個別將複方中單方拆方研究。

(五) 聚類分析法：依類別分類比較。

(六) 正交設計分析法：可分析複方主、次藥物關係。

(七) 正交 T 值法：按正交設計原理改進，適合研究較複雜、多味藥之中藥複方。

(八) 均勻設計分析法：實驗次數及分組較為複雜。化學成分研究法包括原藥配伍及有效成分配伍，由於複方化學成分複雜性，有效成分配伍藥理作用研究較為困難，故應先研究複方各藥間化學成分定性定量關係 (許等 2005)。

二、中草藥降血脂機制

中藥降脂主要有 4 個途徑 (鄭 1996；王及周 1999)

(一) 抑制外源脂質吸收:如何首烏、決明子等中含蒽醌類化合物，可促進腸道蠕動，減少膽固醇吸收：何首烏所含卵磷脂能與膽固醇結合，可阻止腸道吸收，減少膽固醇、類脂質沉積滯留 (劉等 1991)；蒲黃內含植物固醇在腸道競爭抑制食物中膽固醇吸收。

(二) 抑制肝臟內源性脂質合成:即抑制膽固醇合成途徑中重要環節：如澤瀉中三萜類成分可減少合成膽固醇原料 Acetyl CoA 生成 (吳 1980)。當歸及其阿魏酸能與甲羥戊酸-5-焦磷酸 (mevalonate-5-pyrophosphate) 競爭，抑制大鼠肝臟甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧酶 (mevalonate pyrophosphate decarboxylase, MVD)，進而抑制膽固醇合成 (張等 1995)。

(三) 促進脂質轉運和排泄，調節脂質代謝，如人參皂苷可促進膽固醇轉化、分解和排泄；茶葉等均可升高 HDL-C 或 ApoA1，促進體內脂質的轉運和排泄。

24

(40)

(四) 影響體內脂質代謝作用，如透過磷脂的乳化作用，不飽和脂肪酸促進膽固醇代謝功能，或增加血清 LCAT 活性，促進 HDL3-C 向 HDL2-C 轉變，加速消除血清中膽固醇 (李 1995)。

三、中草藥降脂作用傳統理論及中草藥

中醫多數學者在臨床上認為脂血症屬於中醫痰濁、血瘀、胸痺、眩暈、肥胖范籌。其產生與肝脾腎三臟有關，病機為臟腑之氣虛衰，飲食肥甘等形成虛邪實證，以正虛為本，痰瘀為標，屬本虛標實之症，極為氣治血瘀、水濕痰濁或痰瘀互結等病理產物壅塞脈道，常見肝腎污虛、脾虛痰濕、氣滯血瘀等病症，治療上多用補益肝腎、健脾化濕、活血化瘀、清熱通便及消食化痰藥。如常見有補益肝腎之何首烏、靈芝、刺五加等，健脾理氣有人參、甘草、山楂等，活血化瘀有當歸、黨參、虎杖、川芎等，清熱解毒有黃芩、黃連、柴胡、菊花等。袪濕化瘀藥有澤瀉、月見草等 (彭 2005；樓 2002)。

四、中藥主要降血脂成份

目前中藥降血脂質藥物研究主要分有降膽固醇為主之中藥，如山楂、澤瀉、

何首烏、淫羊藿、當歸、黨參、刺五加、荷葉、陳皮及半夏等。降三酸甘油酯之中藥有甘草、刺五加、黃連及黃芩等。同時降膽固醇及三酸甘油酯的有大黃、決明子、葛根、銀杏及大蒜等。功效多屬補肝腎、健脾益氣、活血化瘀及消食化痰利水藥。中藥中有效成分經試驗及臨床研究發現皂苷類可促進脂質轉運和排泄及調節脂質代謝，對高血脂症動物血清總膽固醇 (total cholesterol, TC)、TG、LDL 有顯著降低作用，如人參、刺五加、柴胡等。蒽醌類以蓼科植物居多，如大黃、

何首烏、虎杖等。黃酮類降血脂主要通過抗氧化作用達成，對高血脂有顯著預防和治療作用，如山楂等。生物鹼類具有多種生理活性，如荷葉生物鹼飼餵高脂症小鼠，其血清膽固醇含量有明顯降低。蛋白質類主要指一些活性蛋白質、活性肽、

氨基酸等特殊生物活性物質，如決明子，因這類蛋白質中含有與膽酸相結合成份，

而抑制膽固醇的吸收和沉積。多糖類降脂機理與蛋白質類似，可降低高脂血症動物中 TC、TG，同時提高 HDL-C。不飽合脂肪酸:能與膽固醇結合生成溶點低、

易于轉運、代謝和排泄的脂質，改變膽固醇體內分佈，減少血管壁脂質沉積。多酚類降脂機理與黃酮類似，通過抗氧化作用與清除自由基來達成 (庄 2009；張等 2004；劉及田 2002)。

五、中草藥應用蛋雞飼料之相關研究

選用 5 種中藥 (黨參、黃耆、刺五加、當歸、淫羊藿) 按一定比例混合作為飼料預混料，實驗混合飼料餵飼蛋雞，顯著降低雞蛋的軟蛋、破蛋、畸形蛋 率 (p< 0.05；p< 0.01)。所產雞蛋卵磷脂、鐵、硒含量升高，膽固醇含量降低 (p<

0.05)。重金屬含量低，無抗生素殘留 (汪等 2004)。再由人參、黃耆、刺五加、

何首烏、淫羊藿等中藥按一定比例混合於飼料中，實驗結果顯示產蛋率、蛋重、

25

(41)

料蛋比無明顯差異，而破蛋率、軟殼蛋率、畸形蛋率試驗組明顯低於對照組 (p

﹤0.05) (張 2007)。

六、本試驗中草藥之降膽固醇相關研究

本試驗中草藥降脂配伍原則。基本上方劑中當歸功效為活血化瘀；何首烏、

淫羊藿為補益肝腎，益精血；黃耆、黨參、刺五加為益氣、健脾、固本。全方劑整體功效上為補益肝腎、益氣健脾，以達到降脂清濁作用 (馬及楊 2005；彭 2005；楊 2009)。

(一) 黃耆：為豆科 (Leguminosae) 多年生草本植物，種類有膜莢黃耆 {Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.} 或蒙古黃耆 {Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.var. mongholicus (Bge.)hsiao}。春、秋二季採挖根部，去鬚根，曬乾。生用或 蜜灸用。性味歸經：甘，微溫；歸脾、肺經。功效為補氣升陽，益氣固表，利水消腫，托瘡生肌。能增加 LPL 和 LCAT，促進 VLDL 降解和膽固醇轉移，進而調節 LDL 接受器加速膽固醇之排泄。研究證實黃耆多糖腹腔注射可降低動脈粥樣硬化家兔血清總膽固醇、三酸甘油酯、 MDA、內皮縮血管肽 (endothelin, ET) 含量，保護血管內皮細胞 (Wu et al. 2005)。

(二) 黨參：為桔梗科 (Campanulaceae) 多年生草本植物，種類有素花黨參或川黨參。秋季採挖根部，洗淨，曬乾。切厚片，生用。性味歸經：甘、平。歸脾、肺經。功效為益氣，生津，養血。可提高脂肪分解酶活性。黨參總皂苷能降低高脂血症大鼠 TC、三酸甘油酯、低密度脂蛋白膽固醇 (low density lipoprotein cholesterol-C, LDL-C) 含量,提高一氧化氮 (NO) 和高密度脂蛋白膽固醇 (hight density lipoprotein cholesterol, HDL-C) 含量和 HDL-C/TC 比值 (劉及秦 2002；

聶等 2002)。

(三) 刺五加：屬於五加科 (Araliaceae)。正式學名為 Eleutherococcus senticosus (Ruper.et Maxim.)Maxim。性味歸經：辛、微苦、微溫。歸脾、腎、心經。功效 為補中、益精、強意志、祛風濕、壯筋骨、活血去瘀、健胃利尿等功能。內含皂苷可抑制胰脂肪酶活性，降低脂肪水解，抑制腸道對膽固醇之吸收。刺五加葉總皂苷腹腔注射能明顯降低實驗性高脂血症大鼠血清中三酸甘油酯、TC、LDL-C、

血栓素 A2 (thromboxane A2, TXA2) 與血清過氧化脂質 (lipid peroxide, LPO) 含量，並能明顯提高 HDL-C、前列腺素 I2 (prostaglandin I2, PGI2) 及超氧化物岐化酶 (superoxidase dismutase, SOD) 活性，亦能使 TC/HDL-C 及 LDL-C/HDL-C 比值明顯降低，PGI2/TXA2 比值明顯升高，肝臟脂肪沉積明顯減輕 (張及楊 2002；睢等 2004)。

26

(42)

(四) 當歸：為傘形科 (Umbelliferae) 多年生草本植物當歸 (Angelica sinen (oliv.) Diels) 的乾燥根，切片生用或酒炒用。性味歸經：甘、辛、溫；入肝、脾、心經。

功效為補血調經，活血止痛，潤腸通便。內含谷固醇 (sitosterol) 可競爭性地降低膽固醇腸管吸收。研究驗證當歸中阿魏酸 (ferulic acid) 可改善藥物誘變大鼠學習記憶障礙，其作用機制與促進乙醯膽鹼神經系統及腦血流量有關 (Hsieh et al.

2002; Sri Balasubashini et al. 2003)。

(五) 淫羊藿：為小檗科 (Berberidaceae) 植物，種類有淫羊藿 (Epimedium brevi cornum Maxim.)、箭葉淫羊藿 (Epimedium sagittatum(Sieb.et Zucc)Maxim)、柔毛 淫羊藿 (Epimedium pubescens Maxin) 等的乾燥莖葉，切段生用。性味歸經：辛、

溫；入肝、腎經。功效為補腎壯陽，強筋健骨，袪風除濕。內含黃酮類可降低脂蛋白及膽固醇成份。實驗性高脂血症家兔灌胃淫羊藿煎劑，降低 β-脂蛋白、總膽固醇及三酸甘油酯 (De Naeyer et al. 2005; Wu et al. 2003; 樓 2002)。

(六) 何首烏：為蓼科 (Polygonaceae) 多年生草本植物何首烏 (Polygonum multiflorum Thunb.) 的乾燥塊根。生用或制用。曬乾未經炮制的為生首烏。加黑 豆汁反覆蒸曬而成為制首烏。性味歸經：甘、苦、澀、微溫；入肝、腎經。補肝腎，易精血，通便瀉下，解瘡毒。內含蒽醌類可促進胃腸運動，減少膽固醇吸收 (庄 2009)。何首烏中二苯乙烯苷 (polygonum multiflorum stilbeneglycoside) 灌服可減少高膽固醇新西蘭兔動脈粥樣硬化的發生；能夠調控血漿中膽固醇、三酸甘油酯、LDL、VLDL (Yang et al. 2005; 王等 2005)。

27

(43)

第四節中草藥抗氧化能力與降膽固醇之關聯性與檢測體外自由

基清除作用方法

天然產物抗氧化能力已逐漸受到食品及製藥界相關研究人員注意，目前研究發現人類多種疾病 (癌症ヽ糖尿病ヽ心血管疾病等)都與含過多含氧自由基 (free radical) 如 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)ヽO₂^- ヽOH 和 O2 等對人體造成氧化傷害有關，過多的自由基會攻擊體內蛋白質ヽ脂質ヽDNA 等胞器，破壞細胞，干擾正常代謝功能。而抗氧化劑可通過清除人體內自由基，還原氧化物質，

終止自由基鏈鎖反應，進而達到防禦機體作用。依現有法規廣泛運用於食品添加物抗氧化劑如丁基羥基甲氧苯 (butylated hydroxylanisole, BHA)ヽ二丁基羥基甲苯 (butylated hydroxytoluene, BHT) 等因本身即為致癌劑，可合法添加但長期使用有食用安全等疑慮。於是嘗試研究從中草藥中尋找安全之天然抗氧化劑為深具開發之研究主題。目前研究認為中草藥成份中之酚酸類 (phenolic acids)ヽ黃酮類 (flavonoids)ヽ多糖 (polysaccharides)ヽ皂苷 (saponin) 和單寧 (tannin) 等成份為主要天然抗氧化劑。同時有研究顯示維生素 CヽE 抗氧化劑，可降低血脂 HDL -C 及 LDL-C 之脂質氧化作用與增強膽固醇酯移轉至肝臟活性，可促進體內膽固醇酯排泄，降低膽固醇等血脂含量 (Hillstrom et al. 2003 ; Arrol et al. 2000)；與動脈粥狀硬化 (atherosclerosis) 關係，則因當血液中 LDL-C 遭受自由基ヽ毒物等物質攻擊時，LDL-C 結構型態改變與吞噬細胞 (macrophage) 上之 macrophage scavenger receptor class A (SR-A) 結合形成 foam cell 轉移堆積於血管壁上形成動脈粥狀硬化斑塊 (atheromatous plaque)，但當有抗氧化劑保護時，由 LDL-C 轉變成 foam cell 減少，同時吞噬細胞上之 macrophage scavenger receptor class B ( SR-B) 與 HDL-C 結合，促進吞噬細胞中膽固醇轉移至 HDL-C 中，借由 LCAT 途徑排泄膽固醇，進而降低體內膽固醇含量。(De winther et al. 2000)，但抗氧化劑清除自由基能力強弱範圍與降膽固醇含量高低之間關係則不清楚。

(一) 酚酸類 (phenolic acids) :由於酚酸分子穩定性較低，當與體內自由基相遇，

酚酸類分子 OH 基會提供 1 個氫原子，形成穩定的酚酸自由基，進而降低氧化連鎖反應速度。

(二) 黃酮類 (flavonoids) :抗氧化作用主經還原作用提供電子而清除自由基，提高超氧歧化酶 (superoxide dismutase , SOD) 和谷胱甘肽過氧化物酶 (glutathione peroxidase, GSH-Px) 活性，抑制 H2O2生成；對金屬離子結合，降低金屬離子催化反應，間接達到抗氧化作用；以酚羥基與自由基去氫反應，形成穩定半醌自由基，中斷氧化連鎖反應完成抗氧化作用。

28

(44)

(三) 多醣 (polysaccharides):抗氧化機轉為促進 DNA 複製與合成，調節糖ヽ核酸ヽ脂質與蛋白質代謝，提高 SOD 活性，清除脂質過氧化酶 (lipid peroxidase, LPO) 和 malondialdehyde (MDA)，抑制 monoamine oxidase B (MAO-B)活性。

(四) 皂苷 (saponin) :抗氧化作用是延緩衰老，抗動脈粥狀硬化，抗缺血再灌注損傷作用等共同作用達成 (沈等 2011)。

(五) 單寧 (tannin) :分子中酚羥基具強還原性，對各種氧ヽ脂質及含氮自由基有較強清除力。抑制肝臟粒腺體脂質過氧化作用，降低肝及血清中過氧化合物濃度 (沈等 2011)。

目前研究認為中藥對機體氧化傷害防禦功能主要透過 (1) 直接清除自由基，

因活性氧自由基處於激發態，如 OH 基帶有 1 個不成對電子，反應速度與毒性最大，可與任何細胞組織發生反應而造成傷害。O₂ 自由基可引起細胞 DNA 核酸斷裂ヽ醣類聚解作用及不飽和脂肪酸過氧化，造成細胞膜損傷及粒線體氧化磷酸化。(2) 增強 SODヽ過氧化氫酶 (catalase) 及 GSH-Px 活性。SOD 因含金屬離子 CuヽZnヽMnヽFe 可清除體內超氧陰離子轉變為 H₂O2，H₂O2 再經過氧化氫酶或 GSH-Px 轉變為 O₂ヽH₂O 及 GSH。(3) 抗脂質過氧化作用，自由基攻擊細胞膜上脂質，與細胞膜上磷脂類或 LDL 中之不飽和或飽和脂肪酸反應，反應產物繼續攻擊附近脂肪酸，產生連鎖反應，有些黃酮類成分可以氫鍵與細胞膜結合保護脂肪酸免於被自由基攻擊，而達抗氧化作用。(4) 減少 DNA 被自由基攻擊。(5) 抑制黃嘌呤氧化酶 (xanthine oxidase, XO) 活性，避免超氧陰離子與 H2O2。

目前較常用於評估中草藥抗氧化清除自由基能力方法有 DPPHヽ硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid, TBA)ヽFe³⁺還原/抗氧化能力法 (ferric reducing/antio xidant power, FRAP) 和生物化學發光法。(1) DPPH 法具有快速ヽ簡便ヽ易檢測等優點，已被廣泛運用於抗氧化能力檢測。DPPH 在有機溶劑中為穩定之自由基，

其結構含有 3 個苯環，氮原子上有一孤對電子，其有機溶劑成深紫色，在光譜 517 nm 處有強吸收，有自由基清除劑存在時，孤對電子被配對使其顏色變淺，

在 517 nm 處吸光度變小，其顏色變小程度與 DPPH 配對電子濃度劑量有關。

(2) 硫代巴比妥酸法，測試脂質過氧化程度，油脂氧化後生成 malondialdehyde (MDA)，1 分子丙二醛與 2 分子硫代巴比妥酸作用生成有色化合物，在吸光度 530 nm 處被大量吸收，可藉以量測脂質過氧化產物 MDA 含量(李等 2008)。(3) Fe³⁺ 還原/氧化能力法 (FRAP)，於酸性環境下 (pH 3.6 以下)，FRAP 試劑中三價鐵 (Fe³⁺)因抗氧化作用而還原成二價鐵 (Fe²⁺)，黃色之 Fe³⁺-TPTZ(tripyridyl-triaz ine) 會變為藍色 Fe²⁺-TPTZ，於吸光度 593 nm 處有最大吸光度，依據吸光度計算抗氧化物質活性大小。(4) 生物化學發光法，依據氧自由基清除作用時，一定濃度範圍內發光強度與氧自由基數量呈量效關係，發光強度與清除氧自由基能力呈負相關 (沈等 2011；食品管制局 2011)。

29

(45)

第二章實驗動機與實驗架構

第一節實驗動機與目的

為有效提高傳統雞蛋經濟價值，改善雞蛋營養成分，適度降低雞蛋蛋黃中膽固醇與提高卵磷脂含量。而目前降低雞蛋膽固醇含量之研究，多以使用降膽固醇藥物或飼料中添加各種礦物質，往往影響人體健康與造成雞蛋藥物殘留或雞隻糞尿排泄物汙染環境。本試驗希望能使用中草藥飼料添加方法餵飼蛋雞，適度降低雞蛋中膽固醇及提高卵磷脂之含量，達到有機、無藥物殘留及無汙染環境之雞蛋。

以改善雞蛋品質，促進傳統食品多樣化，長期提供高營養、低價格及安全衛生之食品來源，增進人們健康，進而預防及延緩心血管及神經退化性疾病之發生。

近代研究天然產物化學發現單方中草藥具有多種的生理活性物質及藥效，但生理活性與藥理功能仍屬單純，如為複方處方則為中藥組合，生理活性物質及藥效更為多效性。分析中藥複方間之交互作用，除了以傳統中醫理論方法外，本試驗希望能使用現代科學統計試驗方法分析複雜之中草藥複方。

正交 T 值法為根據中藥方劑特性，按正交設計原理及 F 值與 T 值的特點關係，改進簡化正交表，能拆方分析藥物之間的配伍關係，有利於分析藥物之間的協同或拮抗作用，適用於研究較多因素、較少劑量水平、較多組成藥材之中藥複方。理論上可分三步驟進行，主藥分析、輔藥交互作用分析及藥物劑量分析。

實際試驗研究分析時可針對實驗主題簡化實施 (王及劉 2001；李及汪 2008；

孫及孫 1992)。

本試驗設計採正交 T 值法參考文獻選用黃耆、黨參、刺五加、當歸、淫羊藿、何首烏 6 種中草藥，分析中草藥方劑中降膽固醇與升卵磷脂主輔功效與中藥關係。依據現有文獻資料顯示單獨使用黨參、刺五加、當歸、淫羊藿或何首烏時有降膽固醇作用，而淫羊藿或何首烏則因含卵磷脂或膽鹼而有升卵磷脂作用；

但組成複方後之降膽固醇與升卵磷脂作用是否仍具有相同作用及其主要功效藥與輔助功效藥間關係為何，目前則無相關研究探討。

繼之運用 HPLC 技術，了解本試驗中草藥脂溶性成分是否會轉移至雞蛋中，

造成中草藥藥物殘留等問題。檢測血清 ASTヽALT 與 creatinine 用以評估飼料添加中草藥後是否對蛋雞生長狀況造成影響。再則有研究顯示抗氧化劑可降低血脂 HDL-C 及 LDL-C 之脂質過氧化作用，可加速 LCAT 途徑排泄降低膽固醇含量，故進一步檢測中草藥之 DPPH 自由基清除率，檢測試驗中草藥是否具備清除 DPPH 自由基之能力。

30

(46)

第二節實驗架構

本實驗購買 12 週齡雛雞 120 隻飼養於蛋雞舍，至 17 週齡前產蛋期時隨機分為 12 組，每組 10 隻，分欄飼養，飼養產蛋率平均每組均達 8 成以上且達 35 週齡時開始實驗。各組各單一中藥依等比例劑量依正交 T 值法分組配製，

共計 12 組，除對照組無添加中藥外，其他各組於飼料中添加 1％劑量；自由飲水，光照每日約 12 小時，為期 5 週。試驗結束後犧牲採集血清與雞蛋檢測分析。檢測分析各組雞蛋重量差異性，評估安全性指標則檢測血清中 AST、ALT 及 creatinine，血清脂質膽固醇與三酸甘油酯分析檢測，蛋黃中膽固醇、卵磷脂及三酸甘油酯，實驗架構如圖 2 所示。使用 HPLC 分析全複方中草藥ヽ添加全複方中草藥雞蛋試驗組與對照組未添加中草藥雞蛋，驗證中草藥成分是否會轉移至雞蛋中。同時檢測黃耆、黨參、刺五加、當歸、淫羊藿、何首烏 6 種中草藥全複方與單味藥之 DPPH 自由基清除能力。

31