結核分枝桿菌PncA蛋白突變的特性; Characterization of the mutation region of the Mycobacterium tuberculosis PncA protein
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(2) 致謝 本論文能順利完成首先感謝我的指導老師陳昭賢博士的耐心教導， 不僅僅是在兩年的研究所中提供課業及實驗方面的協助外，還給我生活 上的建議以及管理實驗室的寶貴經驗。在實驗與研究方面，老師在實驗 上的知識與技巧對我的研究有所助益，對於我遭遇到的困境都能給予指 導和幫助，管理實驗室讓我學習到如何與人說話以及管理實驗室的器材 和耗材。另外，在我著手論文時，能夠抱著耐心提供我意見並修改我的 論文，讓論文更完整而嚴謹。 同時也要感謝實驗室中的所有人。林老師家的研究生與楊老師家的 研究生幫助我解決一些實驗上的難題。碩士班崑銘學長、學弟闕締嘉與 大學部的李由和許景翔，給予我在實驗上的幫助也是深表感謝。除了在 實驗上的幫助外，在實驗室的生活點滴、言不及義的閒扯、趕作業的革 命情感，因為有你們的陪伴與砥礪，讓兩年的實驗室生活變得多采多姿。 感謝口試委員提供不同的建議與指導，使這論文更趨近於完善。最 後要感謝家人，提供金錢及愛心幫助我度過研究所的這段時間，你們的 支持是我繼續念下去的動力來源。. . I . .
(3) 中文摘要 對結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，TB)的治療及防制而 言，抗藥性的問題是一大隱憂，在結核病的治療藥物中，以rifampin (RMP) 及isoniazide (INH)的抗藥性最令人困擾，結核分枝桿菌中，對RMP及INH 具有抗藥性則稱之為多重抗藥性菌株(MDR-TB)，MDR-TB往往導致治療 的難度、結核病發病率及死亡率的增加。在RMP及INH的合併藥物中， pyrazinamide (PZA)是一種常被使用的一線有效藥物。在先前的研究中， 已針對台灣西部近五年結核分枝桿菌抗藥性做分析，篩選出許多具有多 重抗藥性菌株，本研究從中挑出78株MDR-TB，進一步分析PZA的抗藥 性，以MGIT method來進行藥物感受性實驗，使用PZA的標準濃度為25-50 μg/mL，結果發現在這些MDR-TB中有62.82% (49/78)是對PZA有抗藥 性。由一些文獻資料中得知，PZA的代謝與pncA基因所表現的蛋白有關， PncA酵素蛋白會將PZA會轉變成為pyrazinoic acid，進而抑制結核菌中 fatty acid 的合成，臨床上大部份PZA有抗藥性的結核分枝菌，是由於pncA 基因突變所致。 本研究從對PZA有抗藥性的MDR-TB菌株中，取33株與標準菌株 H37Rv做序列比對，發現基因突變率為69.7% (23/33)。由於突變點不同， 造成蛋白活性有所不同，變異在胺基酸V7F、Y34變終止碼或H57D等位 置，會使活性喪失；突變在胺基酸L4W、R140C或C72R等位置，會使活. . II . .
(4) 性降低；而變異在胺基酸S32R位置則對活性沒有影響，這些抗藥性菌株 突變的區域集中在1-8、58-77、139-155等位置。利用資料庫搜尋，發現 有三個具有功能的胺基酸區域，包括催化位(Asp8、Lys96、Cys138)、金 屬結合位(Asp49、His51、His71)及cis-peptide 結合位 (Ala134、Ile133)。 因此蛋白和金屬離子有關，故EDTA和不同的金屬離子會影響其活性。模 擬其蛋白結構，其具有其4個α-helix和6個β-sheet的二級結構，胺基酸變異 會導致靠近金屬結合位的結構鬆散，突變點在胺基酸37或76位置，除了 會使靠近金屬結合位的結構鬆散外，還會在第一個α-helix多一個turn；同 時突變多個胺基酸位置，會導致結構明顯的改變，如菌株78R缺少了一個 α-helix。推測此蛋白因分子量小，所以大部分突變會影響其蛋白特性，如： 折疊及結構的改變。在不同的位置上發生突變會影響活性和結構，在同 一位置上突變成不同的胺基酸也會使活性有所差異。PncA蛋白也會受到 EDTA及二價金屬離子的影響。. . III . .
(5) Abstract Speaking of treat and provide against tuberculosis, antiniotic issue is terrible. Rifampim (RMP) and isonoazide (INH) make one puzzle in anti-yubeculosis drug. It is called Multi-drug resistant tuberculosis (MDR-TB) that isoniazid and rifampicin is resistant.and MDR-TB often causes the difficulty of treatment, incidence rate increasing and mortality rate increasing. pyrazinamide (PZA) is effective first-line drug and usually synergy with RMP and INH.It is the former research of M. tuberculosis In the recent five years in western Taiwan, and it screens many MDR-TB strain. It pick up 78 strain in this study, and it further analysis PZA-resistance. Using MGIT method is PZA. susceptibility. test. and. standard. concentration. 25-50. μg/mL.. PZA-resistance is 62.82% (49/78) in MDR-TB strain. Through literature review, it is correlation mode of PZA and PncA protein. Pyrazinamide is converted to pyrazinoic acid (POA) by PncA protein and POA inhibits fatty acid synthesis (FAS-I). It is majority of PZA-resistance that pncA gene mutation cause in clinical tuberculosis.. Choosing 33 strain and reference strain H37Rv compare to the sequence and rate of pncA gene mutation is 69.7% (23/33). Because the mutant of pncA gene is different, the activity of PncA protein is diverse. Mutation of position 7, 34, or 57 etc is loss activity; Mutation of position 4, 72, 140 etc decrease activity; mutation of position 32 don’t effect the activity. This study is found to focus on the region of the PncA, 1-8, 58-77, 139-155. it find functional region that is catalytic site (Asp8、Lys96、Cys138) , metal binding site (Asp49、His51、His71) and cs-peptide bond (Ala134、Ile133)after . IV . .
(6) researching in database. It suggests that protein relate to metal ion. The experiment discover the activity of pncA protein is influenced by EDTA or divalent metal ion. Structure simulation of pncA protein own secondary structure of four α-helix and 6β-sheet. Mutation of position 37 (E37→G) make close structure transform loose structure after gene mutation approaching the metal binding site and add turn in first α-helix. Furthermore mutation of many amino acid can cause structure to change obviously (No.78 is loss fourthα-helix.). It suggest the low molecular weight of protein. Major mutation can influence characterize of the protein (example: folding or structure change). Mutation in different position or different amino acid in the same position can effect the activity. Activity of PncA protein is influenced by EDTA or divalent metal ion.. . V . .
(7) 目錄 致謝··································································································I 中文摘要···························································································II Abstract ························································································· IV 目錄······························································································· VI 表目錄····························································································· X 第一章 前言 ······················································································ 1 第一節 研究背景 ······································································ 5 一、分枝桿菌(Mycobacterium)·············································· 5 二、M . tuberculosis 的傳染與致病機轉 ·································· 6 三、原發性結核 ································································ 7 四、續發性結核 ································································ 9 五、抗藥性結核 ·······························································10 六、多重抗藥性結核(MDR-TB) ···········································11 七、M. tuberculosis 的藥物治療 ···········································13 八、Pyrazinamide (PZA) ···················································14 九、藥物機轉 ··································································17 十、pncA gene·································································19 第二節 研究目的 ·····································································20 第二章 研究方法 ···············································································21 . VI . .
(8) 第一節 研究設計 ·····································································21 第二節 研究材料 ·····································································21 一、藥品 ········································································21 二、MDR-TB 的篩檢 ························································22 (1) 抗酸菌培養 ···························································22 (2) 抗酸菌鑑定 ···························································24 (3) 分子生物學鑑定 ·····················································25 (4) M. tuberculosis 藥物感受性試驗 ·································26 三、PZA 的感受性試驗 ·····················································28 第三節 實驗方法 ·····································································28 一、抗酸菌培養 ·······························································28 (1)痰液檢體的接種前處理 ·············································29 (2)檢體接種培養 ·························································30 二、抗酸菌鑑定 ·······························································30 (1)生長速度試驗 ·························································31 (2) 菌落型態 ·····························································31 (3) 細菌體的型態 ·······················································32 (4) 分子生物學方法確認 ··············································32 三、M. tuberculosis 藥物感受性試驗 ·····································34 (1) agar proportion method 操作 streptomycin、isoniazid、 rifampin、ethambutol 四種抗生素及 clofazimine 單項抗生 素 ·······································································34 (2)以 BACTEC MGITTM 960 儀器進行 pyrazinamide 藥敏試驗 ··········································································35 . VII . .
(9) 四、聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction, PCR) ············36 五、DNA 電泳·································································37 六、勝任細胞製備 ····························································38 七、質體抽取 ··································································38 八、DNA 黏接反應(Ligation) ··············································39 九、轉型作用 (Transformation) ··········································39 十、快速篩檢 (Rapid screen)··············································40 十一、 表現載體的構築 ·····················································40 十二、 Histidine-Tag affinity gel ··········································40 十三、 PZase activity ························································41 (1) Whole cell suspension 活性測定 ·································41 (2) Crude extract 活性測定············································41 十四、 金屬離子 (Metal ion chelation) ··································42 十五、 疏水性群集分析 (Hydrophobic cluster analysis, HCA) ····43 第三章 ································································································· 研究結果 ·································································································45 第一節 PncA 蛋白的純化及分子量···············································45 第二節 分析定序結果 ·······························································46 第三節 PncA 蛋白活性 ·····························································46 第四節 金屬離子的影響 ····························································48. . VIII . .
(10) 第五節 Sequence alignment························································48 第六節 疏水性群集分析 (Hydrophobic cluster analysis, HCA) ···········49 第七節 模擬結構圖分析 ····························································50 第四章 討論 ·····················································································53 第五章 結論與建議 ············································································56 第一節 結論 ···········································································56 第二節 建議 ···········································································57 第六章 參考文獻 ···············································································58 附錄一 結核藥物分類········································································65 附錄二、 Reported frequency of mutations in pncA gene from different geographical areas ·········································································66 附錄三. Hydrophobic cluster analysis ····················································67. 附錄四 實驗中抗酸菌培養作業流程······················································68. . IX . .
(11) 表目錄 表 一、實驗中所使用基因位點名稱及序列 ·································· 69 表 二、在 MDR-TB 中 PZA 產生抗藥性之比例和其他文獻之比較····· 70 表 三、pncA gene 突變所佔比例和其他文獻之比較························ 71 表 四、Pzase activities of wild-type and PncA mutant proteins ············· 72. . X . .
(12) 圖目錄 圖 一、估計結核病在全世界的發生率 ..................................................... 73 圖 二、pyrazinamide 和其抗藥性的機轉 .................................................. 74 圖 三、PZA 的結構和其結構類似物 ........................................................ 75 圖 四、圖解 INH、PZA 和 RMP 的在 M tuberculosis 細胞壁作用位置 76 圖 五、PncA 蛋白會使 PZA 轉變成 POA ................................................ 77 圖 六、質體 pQE30-pncA 之構築.............................................................. 78 圖 七、以 pncA1 及 pncA2 為引子利用 PCR 增幅 M. tuberculosis pncA 基 因片段之凝膠電泳圖............................................................. 79 圖 八、構築質體以限制酶 BamHI 及 HindIII 切割後之凝膠電泳圖..... 80 圖 九、SDS-PAGE 分析純化 E. coli Novablue (pQE30-pncA)所表現的 PncA 蛋白 ............................................................................... 81 圖 十、利用 M. tuberculosis H37Rv PncA 蛋白和其他突變 PncA 蛋白的 的比對..................................................................................... 82 圖 十一、在 PZA 抗藥性的結核菌株上突變點的分佈圖 ....................... 83 圖 十二、依照吸光值和產物變化量作標準曲線圖................................. 84 圖 十三、依照時間和產物變化量作圖 ..................................................... 85 圖 十四、加入不同濃度 EDTA 和活性的關係＆不同的金屬離子會造成 活性之變化............................................................................. 86. . XI . .
(13) 圖 十五、利用 Mycobacterium tuberculosis PncA 蛋白和 Pyrococcus horikoshii PZase 蛋白作蛋白比對......................................... 87 圖 十六、在兩種不同蛋白利用保守的 hydrophobic residues 比對其二級 結構......................................................................................... 88 圖 十七、wide-type 和突變點多寡的模擬結構圖.................................... 89 圖 十八、wide-type 與變異在胺基酸第 76 位置的模擬結構圖.............. 90. . XII . .
(14) 第一章. 前言. 結核病是種古老的疾病，目前仍是世界各國致死率極高的慢性傳染 病之一，尤其是在未開發及開發中國家更是常見。依據世界衛生組織 (WHO)的統計估算，在 2005 年最多的新結核病例發生於東南亞區域，佔 全球發病病例的 34%，全球平均約每三人就有一人感染結核桿菌(1)(2)，其 分佈可參考圖一(1)。雖然 1985 年起在台灣結核病已不在十大死因之列， 但在某些地區的感染率仍未見明顯下降，且台灣身處東亞，交通的便利， 人民往來密切，加上東南亞也一直是國人旅遊的熱門區域，因此，台灣 疾病管制局在 2005 年起也配合世界衛生組織針對重點疾病的防疫『STOP TB Strategy』制訂了結核病十年減半計畫 (Directly Observed Treatment, Short course，DOTs)(46)，由此可知這個古老疾病受到重視的程度。在台灣， 政府的實行要點為派都治計畫關懷員「送藥到手、服藥入口、吃完再走」 為主要實行方向。可見結核病的預防及治療，對全世界而言亦是當務之 急。 結核病是由結核分枝桿菌感染所造成的，結核菌的最大特徵是生長 緩慢，約 16 至 18 小時分裂一次，因此在培養鑑定的過程便變得格外困 難。當患者被懷疑有被感染的可能時，從接受驗痰(通常是先做痰液抹片 再以抗酸性染色判讀)到微生物培養鑑定抗藥性的結果出來，往往需要花 上一個月以上，甚至更久的時間，因此疾病的傳播便在這段防疫的空窗. . 1 . .
(15) 期出現很大的挑戰。依據疾病管制局的資料顯示，在台灣可以發現在許 多山地鄉或較鄉村的地區感染率顯然高於都市區域(43)，這與個人衛生習 慣、醫療資源及其他衛生教育或許有很大的關係。傳統上國人常有服藥 不確實的狀況發生，因此當發現有感染結核病的狀況發生時，便可能因 為未確實服藥而使得結核菌產生抗藥性的狀況也更加嚴重，也因此在疾 病管制局的十年減半都治計畫中的策略便顯得十分重要，而從疾病管制 局的統計數字來看，以往台灣結核病病患每年新增一萬五千人以上，但 在政府實施都治計畫關懷員「送藥到手、服藥入口、吃完再走」三年後， 每年新增人數已從 2005 年的一萬六千四百七十二人降到 2006 年的一萬 五千三百七十八人， 2007 年降為一萬四千五百五十四人，每年以百分之 七以上幅度下降，除了發生率逐年下降外，三年的結核病死亡率也以每 年百分之十幅度下降，成效頗佳。(43) 結核桿菌藥物感受性試驗(Drug Susceptibility Testing, DST)的結果是 提供治療的重要參考，世界衛生組織在 1969 年就已經公佈結核病藥物感 受性試驗的參考標準步驟，而台灣疾病管制局也有擬訂有結核病診治指 引及結核菌檢驗手冊，提供做為臨床醫師診斷及臨床檢驗實驗室的參考 指引，也因此使得近年來結核菌的抗藥性受到更大的重視。依據台灣疾 病管制局統計，台灣有百分之一結核病患者罹患較難以治療的多重抗藥 性結核病(Multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)(44)， MDR 患者中的. . 2 . .
(16) 百分之五是廣泛抗藥性結核病 (Extremely drug-resistent tuberculosis， XDR-TB)，目前難以有效醫治，死亡率仍高，目前台灣感染 MDR 的比率 約為 3.8%(34)，與其他已開發國家比較是屬於偏高的狀況。依據先前實驗 MDR-TB 比率 3.7% (177/4819)接近疾病管制局的統計，所以台灣現今治 療結核病除了使用 isoniazid (INH)、rifampicin(RMP)、ethambutol (EMB) 和 streptomycin (SM)外，也都會合併使用台灣目前少用，同屬於第一線治 療藥物 Pyrazinamide (PZA)。 本實驗檢體來源為 MDR-TB 的菌株，利用 MGIT method 對 MDR-TB 作 PZA 的感受性試驗。挑出 56 株 MDR 菌株，PZA 的標準濃度為 25-50 μg/mL，結果發現在這些 MDR-TB 中有 66.1 % (37/56)是對 PZA 有抗藥 性，在分析對 PZA 有抗藥性的結核菌中 pncA gene 產生突變佔 69.7% (23/33)。 由文獻中得知，PZA 化學結構類似 nicotinamide，PZA 的代謝機轉 (3). (如圖二，在後面章節會詳述)與 pncA gene 所表現的蛋白有關，PncA. protein (又稱 pyrazinamidase/nicotinamidase)會將 PZA 轉變成為 pyrazinoic acid (POA)，POA 會抑制結核菌中 fatty acid 的合成，可對抗 semi-dormant tubercle bacilli，而且和其他藥物不同的是他必須要在酸性環境下才有作 用 (pH 約為 5)。臨床上部份 PZA 抗藥性的結核分枝菌，是由於其 pncA gene 突變所致。. . 3 . .
(17) 此研究探討 M. tuberculosis 的 pncA gene 與 PZA 在的關係，並探討其 功能區的影響，並依照功能區影響 PncA protein 的活性。利用 NCBI 資料 庫發現有金屬結合位，由不同的金屬離子測定，知其對於 PncA 蛋白有不 同程度的影響. . 4 . .
(18) 第一節 研究背景 一、分枝桿菌(Mycobacterium) 在 Mycobacterium 中可對人類直接產生疾病的有 M. tuberculosis 產 生 結 核 病 (tuberculosis) 及 Mycobacterium leprae 引 起 痳 瘋 (Leprosy)。目前痲瘋的感染已近乎絕跡，但結核分枝桿菌的感染卻 有增加的趨勢。所以針對 M. tuberculosis 的檢驗便愈形重要在 Mycobacterium 中 主 要 分 為 M. tuberculosis 及 Non tuberculosis Myconacterium 二類，M. tuberculosis 早在 1882 年即被 Robert Koch 發現提出，整個基因體定序則在 1998 年完成(4) M. tuberculosis 屬於革蘭氏陽性菌，長約 1-10um，寬 0.2~0.7μ m，外觀為略彎曲的細長桿菌，無鞭毛、無芽胞、無莢膜，有時呈 現多形性，如近乎球形或長鏈狀。細胞壁富於脂質而會妨礙色素的 通過，因而不易染色。但 Mycobacterium 一旦染色，不易被強酸脫 色，故又稱抗酸菌(acid-fast bacilli)。M. tuberculosis 為生長緩慢的絕 對需氧菌，培養最佳溫度為 37°C，適宜的酸鹼度為 pH6.4-7.0。M. tuberculosis 的分裂速度很慢，約每 20 小時分裂一次。構成 M. tuberculosis 性狀特徵的成分是脂質，佔乾燥菌體重量之 40%。細胞 壁成份具增強免疫反應能力特性等生物活性，脂質約佔 60%。結核 菌對外界抵抗力甚強，在陰暗處 M. tuberculosis 可生存 2~3 個月不. . 5 . .
(19) 死，若是日光直接照射或用 5% 石碳酸處理 M. tuberculosis，仍需 24 小時以上方可將其殺滅 M. tuberculosis 的培養常用 Lowenstein-Jensen Slant (L-J slant)， 成份中含有孔雀綠 (Malachite Green) 可以抑制其他雜菌的生長。在 37°C 的環境下約 20 小時分裂一次，培養 2-3 週後可見菌落生長， 約 4~8 週後才可見到明顯的生長菌落。由於分枝桿菌的生長週期 長、陽性檢出率低、不易標準化等缺點，致使常規細菌學檢查方法 不具時效性，無法充分滿足臨床診斷的需要。近來也有以 Middlebrook 7H9 為 base 的液體培養基之全自動分枝桿菌培養鑑定 儀協助抗酸菌的培養偵測，可做為分枝桿菌快速培養與鑑定藥物試 驗的國際標準方法(25). 二、M . tuberculosis的傳染與致病機轉 M. tuberculosis 的傳染主要是以飛沬傳染(droplet)為主。當帶菌 者吐痰或藉由在公共場所講話、咳嗽、唱歌或大聲談笑時產生的飛 沫而排出 M. tuberculosis 菌體，飛沫在塵埃中乾燥後，殘核飛揚飄浮 在空中，直徑小於 5 ul 的飛沫殘核(droplet nuclei)便可經由呼吸道到 達正常的肺組織中而造成感染。然而結核病傳染的另一特徵是感染 很難發生，因為 M. tuberculosis 並不易到達肺的末梢部位。因此傳染 最常發生在較親近且較長時間的接觸者或家人(44)。 . 6 . .
(20) 感染結核菌者只有約 10-20%會發病，其餘的人都平安無事渡過 一生，因此「感染與發病不同」是必須要了解的常識。WHO 認為胸 部 X 光診斷的信賴度不高，因而將結核個案定義如下：(1)疑似結核 個案為呈現暗示結核病症狀與病徵之任何人，尤其是超過三週長期 咳嗽；(2)結核病個案經由細菌學檢驗證實或由醫師診斷之病人（任 何給藥治療的病人都要記錄為個案，用藥試試看絕不可作為診斷的 方法）；(3)確診結核個案為 M. tuberculosis 培養陽性之病人（在不能 例行培養 M. tuberculosis 之國家，痰液抹片 acid fast stain 結果兩次陽 性者，亦可考慮為「確診」個案）。結核病的臨床表徵為咳嗽超過 3 週以上、發燒、貧血、夜間盜汗、體重減輕等，並無特別具有特異 性的表徵出現。結核病患者也常見有感冒、糖尿病、癌症等疾病， 因此臨床症狀不易分辨，而需進一步以實驗室方法鑑定後確診(44)。 M. tuberculosis感染人體後會導致發病，主要有三個因素：(1)M. tuberculosis本身的致病力；(2)患者免疫過敏反應能力之強弱；(3)組 織破壞與乾酪性壞死之致病機轉。M. tuberculosis可入侵任何器官， 但主要還是以肺部為主，非感染肺部的結核病稱之為肺外結核。. 三、原發性結核(44) 當 M. tuberculosis 進入人體被吸收後，在感染部位被嗜中性白血 球及肺泡巨噬細胞吞噬而造成滲出性病灶，就是初次感染病灶。人 . 7 . .
(21) 體內的免疫反應在菌體侵入後會啟動而促使巨噬細胞進行吞噬作 用，但 M. tuberculosis 在巨噬細胞內並不被殺滅，反而會進行暫時性 胞內寄生並增殖。巨噬細胞破裂時會散出細菌，或隨巨噬細胞經由 血液和淋巴液散佈於宿主體內其他組織器官。當許多的巨噬細胞聚 集於病灶處，會形成特殊的肉芽腫組織，此稱之為結核(tubercle)， 這便是原發性結核(primary tuberculosis)。原發肺結核在肺部之進行 通常依四種方式：(1)肺部感染；(2)肺門淋巴腺病變；(3)肋膜腔積 水 ；(4)栗粒狀結核(44)。 原發性結核亦可以單獨一種或合併多種方式表現。原發性感染 通常會持續數星期，在初期時 M. tuberculosis 生長快速且極易傳播， 當患者的免疫系統漸漸發展出細胞性免疫，使病菌的增殖速度減 緩，經常造成無病狀的原發性；但在兒童、老年人或免疫缺損的人(如 愛滋病患者)易引起有症狀的原發性結核症。當結核病變發生退行而 病灶變小時，感染即進入潛伏期，亦即感染持續存在，但不引起疾 病，潛伏性感染可在免疫力下降時重新活動，也可以潛伏一生。. . 8 . .
(22) 四、續發性結核(44) 許多患者在原發性結核休眠一段時期後，可能由於營養不良、 酗酒、生活壓力、緊張、老化或帶菌者的免疫力降低等因素，而造 成 結 核 病 的 再 活 化 ， 此 種 狀 況 稱 為 續 發 性 結 核 症 (secondary tuberculosis)，續發性結核症患者的細胞免疫結果會對宿主造成傷 害，而引發遲發型的過敏性反應，使結核組織壞死、纖維化及鈣化， 此為續發性肺結核的特徵。病發時，乾酪樣病灶會被液化，形成之 空腔可提供 M. tuberculosis 快速繁殖的地方。大量的 M. tuberculosis 可經由支氣管，擴散至肺的其他部分，並藉由痰或飛沫傳染給其他 人，成為開放性結核病人。一般肺結核患者常有之症狀為衰弱、倦 怠、體重減輕、低度發燒、夜間盜汗、慢性咳嗽及咳血。若因續發 性感染壞疽軟化，腐蝕了肺部組織，M. tuberculosis 會因此而進入血 流及淋巴，隨著便會散布到肺的其他部位或其他器官，而形成小的 粟粒結核(即類似肉芽腫)，並在全身擴散，包括腎臟、心臟、骨骼及 腦組織等最為常見，稱為粟粒狀結核症 (miliary tuberculosis) ，亦即 肺外結核病(extrapulmonary tuberculosis)。此時若未及時用藥物控 制，死亡率會特別高。. . 9 . .
(23) 五、抗藥性結核(44) 近年來結核病的防治一直都是台灣公衛政策的重要議題之一， 台灣地區施行全國結核病防治計畫（National Tuberculosis program, NTP）已經超過五十年，疾病盛行率和死亡率已有明顯的下降，同 時也由於治療方法的演進，不僅治療時間可縮短至六個月，且治療 成功率可高於95%，而復發率小於5%，只要配合療程，肺結核已不 再是令人為之色變的可怕疾病。但由於抗藥性M. tuberculosis的產 生，使得肺結核的治療，再度充滿許多困難。M. tuberculosis對抗結 核藥物產生抗藥性的原因是由於染色體上的基因產生突變所致。在 自然狀態下，產生此種突變的機率極低：如isoniazid約為10-6 ， rifampin約為10-8。同時，基因對不同藥物產生抗藥性的突變機會為 互不相干的獨立事件；亦即要同時對isoniazid及rifampin產生抗藥 性，須總菌量達1014才有機會發生；但空洞性病灶的菌量約僅為108， 故病患若接受規則的至少含有isoniazid及rifampin的化學藥物治療， 並不易因治療失敗而產生抗藥性菌株。但若接受不適當的藥物治 療，則可能造成自然存在的少數抗藥性M. tuberculosis經由藥物篩選 而大量繁殖，導致抗藥性的產生。在結核病化學藥物治療的時代， 影響結核病治療成功與否的重要因素，已不再是休息、療養、飲食、 氣候或疾病嚴重程度，乃取決於處方藥物組合是否適當、治療期間. . 10 . .
(24) 是否足夠及病人是否按規服藥。1990 年代，鑑於世界各國逐漸忽視 結核病問題導致治療失敗、抗藥性結核病流行、及全球性的結核病 回升趨勢，世界衛生組織鼓吹各國積極推動DOTs，以標準治療方式， 直接監督治療，「送藥到手，服藥入口，吞了再走」。抗藥性結核菌 逐漸增多的今日，結核病的治療絕不是依標準治療方式處方給藥就 了事，而必須隨時注意病人的治療順服性，保証有效的藥物進入病 人體內發揮了藥效，才可能在最短的時間內治癒結核病，早日消滅 傳染源，也才可能防止抗藥性結核菌的持續增加。M. tuberculosis的 藥物感受性試驗，主要有三個目的：(1)決定最初的用藥選擇；(2)確 定抗藥性的發生，而選擇進一步的用藥；(3)估計社區內抗藥性原發 與後天的感染率。M. tuberculosis藥物感受性試驗，必須對於所有病 人，初次分離到的菌株都需要做。而且，當病人接受治療後三個月 仍呈現陽性培養結果，或臨床證據顯示治療反應失敗，則藥物感受 性試驗便需要重覆進行(44)。為了確保在最快時間內得知抗藥性的偵 測，快速的藥物感受性試驗需與快速的培養及鑑定結果配合，以做 為提供臨床即時治療的良好依據。. 六、多重抗藥性結核(MDR-TB) 經培養確認為 M. tuberculosis 感染並進行藥物敏感性試驗後發 現至少同時對 isoniazid(以 2μg/ml 為判斷標準)及 rifampin(以 1μ . 11 . .
(25) g/ml 為判斷標準)二種第一線藥物具有抗藥性時，此種狀況稱之為 MDR-TB。若更嚴重進一步對任何 fluoroquinolone 藥物有抗藥性，且 對於 3 種注射型的抗結核病二線藥物（capreomycin, kanamycin, amikacin）中至少 1 種出現抗藥性者，就會成為所謂廣泛抗藥性結核 菌(Extensively drug resistant tuberculosis, XDR-TB)， XDR-TB 的出現 無異使結核病防治上更加困難，治療上比 MDR-TB 更為棘手，一旦 被感染，其治療成功率有可能會降至 50%以下。 造成多重抗藥結核病的原因很多，根據美國 National Jewish Center 統計，80%的多重抗藥病人在治療過程中出現錯誤，平均每 個病人發生 3.93 個。在醫師處方中常見可能導致抗藥性結核的狀況 如：(1)針對活動性結核病人施行預防治療。(2)未依標準處方及劑量 開立結核藥物。(3)未注意到病人服藥順服度不佳，或雖知道但未採 取行動。(4)未注意到病人已經罹患抗藥結核病。 (5)在失敗的處方每 次新增 1 種藥物。(6)過度信賴 streptomycin 及 fluoroquinolone ，誤 以為已使用 2 種新藥，卻忽略了 streptomycin 無法在 18-24 個月的 療程中全程使用，以及 streptomycin 可能與 isoniazid 共同出現抗藥 的問題。 與病人有關的狀況如：(1)服藥順從度差，導致續發性多重抗藥 菌株的產生。(2)因藥物副作用導致不規則服藥。(3)遭原發性多重抗. . 12 . .
(26) 藥菌株感染。(4)遭 NTM 感染。(5)因肺生理結構扭曲所導致的生理 性抗藥（Physiological resistance）。. 七、M. tuberculosis的藥物治療 Waksman 於 1944 年發現了鏈黴素(streptomycin)後，開啟了結 核病化學藥物治療的新紀元。1949 年發現合併使用多種抗結核藥物 來治療結核病的重要性，否則極容易發生 M. tuberculosis 續發抗藥性 而導致治療失敗。1952 年發現 isoniazid。1956 年，證明在有效抗 結核藥物治療之下，結核病人居家治療並不會增加家人受到感染的 機會，傳統花費頗高的療養院療法於是漸漸淡出流行。1962 年發現 每週 2 至 3 次間歇治療可達到同樣的治療效果。1972 年發現含有 rifampin 及 isoniazid 之合併治療，可在 1 年以內即治癒結核病，短 程治療已蔚為結核病治療的主流(25)。目前第一線用於結核病治療的 藥物介紹如下： isoniazid：本藥物的藥理作用為干擾結核菌脂質及核酸的合成，對快 速增殖的結核桿菌特別有效，能殺死細胞內外生長繁殖的結核菌， CNS 穿透力良好，具有安全、便宜、易於投藥等優點，是目前使用 最廣泛的抗結核藥物之一，如圖四。 rifampin ： 本 藥 物 的 藥 理 作 用 為 可 抑 制 M. tuberculosis RNA polymerase的活性，具殺菌能力且對吞噬細胞(macrophage)具有良好 . 13 . .
(27) 的穿透力，可殺死細胞內的桿菌，如圖四。 ethambutol：本藥物的藥理作用為可抑制結核菌蛋白質的合成和破壞 細菌的代謝，因而阻斷細菌的增殖。可避免M. tuberculosis產生抗藥 性，為目前抗結核藥物中最常用的抑菌劑。 streptomycin：本藥物的藥理作用為對細胞外的鹼性病灶中之M. tuberculosis具殺菌性，適用於間歇性治療。 pyrazinamide：為Nicotinamide類似物(analogs)，對巨噬細胞內酸性 (pH5.5)環境中生長緩慢的結核菌最具殺菌力，組織穿透力佳，具滅 菌功能 (sterilizing activity)，故能減少結核病的復發率，為現代短程 化療方案中的主要藥物之一，但對M. bovis及部份非結核分枝桿菌則 沒有作用，如圖四。 目前在台灣針對 Mycobacterium 的相關檢驗及研究都已有相當 深入的探討，但近年來由於微生物基因研究方法的不斷進步，使得 我們得以更進一步探討微生物產生的各種變異，加上目前抗藥性問 題給衛生防疫所帶來的困擾，使得我們希望透過區域性的菌株流行 病學、臨床檢驗技術及基因探討能夠在這一類難以培養菌株的臨床 診斷上提供一個參考的平台，而促使我們針對 MDR-TB 進行各方面 更深入探討的動力來源。 八、Pyrazinamide (PZA) . 14 . .
(28) 1936 年首次被兩位 Dalmer 和 Walter 合成(5)；在 1952 年才被發 現 PZA 可以成為抗結核治療的藥物；但是 PZA 在第一線結核治療藥 物 被 廣 泛 使 用 則 是 在 1980 年 代. (22). 。 CAS 命 名 為. Pyrazinecarboxamide；一般別名為 pyrazinoic acid amide 或 pyrazine carboxylamide 分子式為 C5H5N3O，分子量為 123.11，熔點 188~189 ℃，溶於 chloroform，methylene chloride；微溶於 benzene；在室溫 難溶於水。以結構而言，PZA 和 INH 有一些相似的特性：第一、為 菸鹼胺(nicotinamide)的相似物(6)(7)，如圖三。第二、對 M. tuberculosis 具有專一性的殺菌力。(22) 但是此藥物在體外正常的培養環境下是無 法殺死 M. tuberculosis，又如何被發現可以用來當作結核的治療藥 物？在 1945 年，chorine 發現 nicotinamide(vitamin B3)對於 M. tuberculosis 具有抑制的活性。在 1948 年在 Lederle Laboratories of American Cyanamid 也發現此一現象。同時在 Lederle Laboratories 和 Merck laboratories 發 現 經 由 合 成 nicotinamide 的 類 似 物 ， pyrazinamide，在已感染 tuberculosis 的動物具有最好的殺菌力。研究 nicotinamide 的 類 似 物 也 得 到 了 二 種 有 效 的 抗 結 核 藥 物 ， isoniazid(INH)和 ethionamide。(3) 使用此藥物可以使原本治療結核病的療程 9 至 12 個月，縮短至 6 個月(8)(9)，但通常每天服用 PZA 高於 40mg/kg，易產生肝毒性(10). . 15 . .
(29) PZA 為重要的殺死結核菌的藥物屬第一線口服用藥(附錄一)，他 只有在酸性(pH 值約 5.0)環境下才有作用，此藥物會滲透到結核菌 內，被酵素 nicotinamidase / pyrazinamidase (PZase)代謝成 pyrazinoic acid (POA)，被一較弱的攜出幫浦或擴散出胞外，帶負電的 POA 分 子會在酸性環境下形成不帶電的分子 HPOA，HPOA 容易進到細胞 內累積，進而導致細胞損傷。並不像其他的藥物，PZA 無特定的作 用標的物(target)，而且作用在靜止期(stationary phase)的細菌比對數 期(exponential phase)的細菌來的有效。POA 也會去影響酵素 fatty acid synthesis I 的作用，進而去影響脂肪酸的合成(如圖二)，而且在膜上 發 現 POA 的 標 的 物 ， POA 對 結 核 菌 具 有 感 受 性 ， 但 是 對 於 Mycobacterium smegmatis 或其他細菌，如：E. coli，則是天生抵抗 POA 的作用(19)(20) 產生 PZA-resistence 的結核菌，其主要的原因是 pncA 基因產生 突變，導致 PncA protein(PZase)沒有活性，進而產生抗藥性(13)(14)(15)。 此藥物並不會受到其他結核藥物的影響。和 isoniazid 和 rifampicin 有很強的協同性(synergy)，所以常一起被使用，PZA 是一種基礎治 療 MDR-TB 藥物(13)。 形成 pyrazinoic acid 還可以進一步被酵素 xanthine oxidase 氧化 成 5-hydroxypyrazinoic acid。而且此藥物在血中的半衰期和治療長短. . 16 . .
(30) 無關，顯示出 PZA 不會誘發代謝它的酵素反應。PZA 誘發的毒性機 轉是未知：目前還未知是否和酵素的毒性相關，也不知道 PZA 的毒 性是由藥物本身或是其衍生物產生。在老鼠的研究中指出 PZA 抑制 許多 CYP450 isoenzymes (2B, 2C, 2E1, 3A)活性，但是在人類的肝的 微粒體，PZA 對 CYP450 isoenzyme 則無抑制的現象。(10)此藥物實際 上在體外是不具有殺菌能力而且對在病人體內快速生長的桿菌只有 前兩天的治療有效。(3) 通常被用來作為抗 PZA 的分枝桿菌為 M. bovis BCG，此菌的 pnc A 基因在第 169 個核苷酸突變，原本的 C 變成 G。(21) 使用此藥物副作用會使肝功能不良（發燒、食慾不振、身體不 適、肝腫大、腹部壓痛及黃疸等） 、尿酸值上昇、痛風發作（關節痛） 、 貧血、對光敏感、皮膚出疹、胃部不適、頭痛、肌肉痛及色素沈著 等。. 九、藥物機轉 此一 PZA 模型是基於最近的文獻所得，如圖二。PZA(前驅物) 藉由被動性的滲透或者可能是主動的運輸進到細菌體內，經由 PZase 轉變成具有殺菌力的 pyrazinoic acid(POA)，POA 在 M. tuberculosiss 內藉由被動的滲透或流出機轉(M. tuberculosis 缺乏的)到細菌體外， 如果細菌體外為酸性環境，一小部分的 POA 負電的分子在細菌體外 . 17 . .
(31) 會和質子結合形成不帶電共軛酸的形式(HPOA)，此型式容易通過細 胞膜。理論上 HPOA 會重新進入細菌體內。HPOA 的進入會比 POA 流出還要快，所以 POA 會累積在細菌體內，質子化的 POA (HPOA) 會帶一質子進入細菌，而後解離成一質子(H+)和一帶負電的 POA， 質子會留在細胞內會導致細胞質酸化，一些重要的酵素會被抑制， 帶負電的 POA 會經由被動的滲透或流出機轉到細菌體外，一直重複 此循環，進而殺死 M. tuberculosis。質子化的 POA 可能會瓦解 proton motive force 質子驅動力和影響細胞膜的運送功能。在中性或鹼性的 環境下只有少部分的在細菌體內，因為超過 99.9％的 POA 以帶負電 的形式不容易通過細胞膜。 非特定的結合也可以幫助解釋 PZA 對老化的及不分裂的細菌有 較好的殺菌能力。一般藥物會結合在特定位置而打斷重要的代謝步 驟，而且總是對抗生長期的細菌效果比位於靜止期的細菌好。靜止 期細菌會降低細菌的代謝， 使流出機制功能變慢，以至於 POA 更 容易累積在細菌體內，而且細菌的膜電位會降低，使 HPOA 更容易 進入細菌體內，累積在細菌體內。發現 PZA 或 POA 可以抑制 fatty acid synthase-I (Fas-I)的作用。 INH 和 PZA 皆為抑制 M. tuberculosis 的細胞壁 mycolic acid 的合 成，但是 PZA 影響短鏈脂肪酸合成(FAS I)，INH 影響長鏈脂肪酸合. . 18 . .
(32) 成(FAS II)，RMP 抑制 M. tuberculosis RNA - polymerase 的活性。 十、pncA gene 由 561 個核苷酸所組成，轉譯出 186 個胺基酸的 PncA 酵素蛋 白，所合成之酵素可以把 PZA 轉變成 POA，如圖五。此酵素在原核 生物普遍存在。所產生 PncA protein 預測大小為 19.8 kDa，屬於 cysteine hydrolases superfamily (isochorismatase family)。由文獻得知 M. tuberculosis PncA 蛋白和 Pyrococcus horikoshii Pzase 的相似度有 37%。其蛋白結構，依據生物資訊預測(如：NCBI、ExPASy 等)具有 metal-binding site (H51, H71, D49)、active site (D8, K96, C138)和 conserved cis-peptide bond (A134, I133)。 由附錄二，從不同的地區統計 PZA 產生抗性中，同時 pncA 基 因發生突變的比例，發現突變比例幾乎都高於 70％，顯示出 pncA 基因突變是造成 M. tuberculosis 對 PZA 產生抗藥性的主要機轉。而 且突變並沒有發生在特定的區域，反而是分散在基因裡。依據文獻 所統計的結果突變比較集中於三個蛋白區域，分別是 3–17、61–85 和 132–142。PncA 酵素蛋白在這些區域很可能包含 catalytic site。. . 19 . .
(33) 第二節 研究目的 一、探討PZA在M. tuberculosis的作用。 二、探討pncA基因突變的特性 三、確定在PncA protein是否失去活性。 四、探討金屬離子對於PncA蛋白活性的影響 五、利用生物資訊的功能分析PncA蛋白結構和活性之關係. . 20 . .
(34) 第二章 研究方法 本實驗內容是以MDR-TB菌株分析PZA的感受性試驗，對於產生 pyrazinamide的抗藥性的結核菌，進一步分析其核酸及蛋白序列的差異， 是否會影響其蛋白活性與蛋白結構，和不同的金屬離子反應後是否也會 造成活性的改變。再利用生物資訊，解析其蛋白結構，觀察其結構差異， 並探討和活性之關係。. 第一節研究設計 從MDR-TB的先前研究中，利用MGIT method進行PZA藥物感受性試 驗，篩選出對於PZA有抗藥性的菌株，比對其基因的差異。利用有所差 異的基因，表現其蛋白，比較其活性差異。由資料庫搜尋，推測蛋白有 金屬結合位，因此加入不同濃度的EDTA和不同的金屬離子，觀察是否會 影響其蛋白活性。利用結構的方式是否能夠解釋期活性差異。. 第二節研究材料 一、藥品 一般無機鹽與有機溶劑均為分析級，除非特別標示，皆購自於USB 公司(USA)及Sigma chemical公司(Missouri, USA)。限制酶及其他酵素購自 TAKARA公司(Japan)。聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction, PCR) 所使用之耐熱DNA聚合酶Taq DNA polymerase購自Yeastern Biotech公 . 21 . .
(35) 司。洋菜膠(agarose)購自Sigma chemical公司(Missouri, USA)。回收純化蛋 白質之Nickel Affinity Gel 購自Sigma chemical公司(Missouri, USA)。. 二、MDR-TB的篩檢 收集台灣台中市芮弗士醫事檢驗所於2003年7月至2007年6月進 行抗酸菌培養、鑑定及藥物感受性試驗之所有臨床檢體進行分析， 以取得MDR-TB檢體做為後續相關分析檢體來源。樣本來源北起基 隆市，南至屏東縣，含括台灣西部各縣市，收集單位包含區域級醫 院、地區級醫院、診所及檢驗所等，於P2級負壓實驗室中進行抗酸 菌培養、鑑定及M. tuberculosis藥物感受性試驗。取得MDR-TB檢體 的過程主要分為抗酸菌培養、抗酸菌鑑定、M. tuberculosis藥物感受 性試驗三大類. (1) 抗酸菌培養 M. tuberculosis為Mycobacterium species中的其中一種菌，屬於抗 酸性菌，Mycobacterium species中又可分為快速生長菌及慢速生長 菌，為了避免遺漏故先培養出抗酸菌後，再將陽性樣本鑑定是否為 M. tuberculosis。 由於抗酸菌的生長特性與一般細菌不同，因此培養抗酸菌傳統 上是以L-J slant做為培養基的選擇(28)，但由於以L-J slant進行抗酸菌. . 22 . .
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