第二章 研究方法
第三節 實驗方法
二、 抗酸菌鑑定
本實驗中的抗酸菌鑑定是將MGIT管中培養呈現陽性結果檢體 取出後進一步進行菌種鑑定，一般可利用為傳統生化鑑定方法(34)、 分子生物學鑑定方法(35)(32)(33)及M. tuberculosis分泌性蛋白檢測法(24)(27) 等三種。抗酸菌培養的結果若為陽性需以Acid fast stain確認其為真陽 性(即有抗酸菌生長)，記錄在顯微鏡檢下所觀察到的型態後再進行菌 種鑑定，基本上M. tuberculosis之鑑定要先確定Mycobacterium的生長 速度，最佳生長溫度，以及色素形成之特性。傳統生化學鑑定方法 需先將MGIT管中菌落次培養於L-J slant中，典型的M. tuberculosis為 表面粗糙的淡黃色(buff)菌落，生長速率屬於為需超過七天才生長的
慢速生長菌，在暗視野環境中培養並不產生色素屬於非產色菌，於 L-J slant培養基上菌落型態表現粗糙，淡黃臘狀，為鑑定上重要特 徵，在抗酸性染色後的顯微鏡檢中為紅色菌體，呈現如繩索狀。
M. tuberculosis 生化試驗 nitrate 還原試驗為 (+) ， niacin 試驗為
(+)(32)，菌落外觀及顯微鏡下索狀型態，M. tuberculosis在L-J medium 中培養生長後呈現粗糙、淡黃臘狀且菌落聚集的型態，將液體培養
以大致區分屬於那一種分枝桿菌，以作為分枝桿菌鑑定之輔助，判 讀內容分為粗糙，平滑，圓形，扁平，是否產色等。M. tuberculosis 於Lowenstein Jensen(L-J)斜面培養基上菌落型態表現粗糙，淡黃臘 狀，為鑑定上重要特徵。純化後菌體接種於Middlebrook 7H11 培養 基5~10天後，在低倍顯微鏡下觀察是鳥巢式、繩索狀的菌落。但25 天後則為組糙、臘狀、淡黃的外表。
(3) 細菌體的型態
(42)將長出的分枝桿菌透過抗酸染色及1000×顯微鏡觀察，可以依菌
體的型態做粗略的區分那一種分枝桿菌。細菌型態會呈現蛇索狀 (serpentine cording)、短桿狀、點狀、柵狀。
(4) 分子生物學方法確認
(45)目前M. tuberculosis分子生物學鑑定最常使用的引子為IS6110片 段，本片段為TB complex特有的片段，因此目前針對TB complex的
分子生物學檢測幾乎都是以此片段做為引子首選(29)(35)(32)(33)。實驗中 若發現有生化反應不典型時會輔以本方法進行確認。
DNA抽取步驟為：先依照一般抗酸菌檢體前處理程序進行去消 化及去污染的動作，取出ProbeTec sample tube貼上標籤後置於鐵架 上，將搖勻之buffer 1 懸空倒至空白玻璃真空採血管中，吸取1000 µl
之buffer 1，加至預先準備好的sample tube中，以vortex強力震盪 ()NALC-NaOH處理後之檢體沉渣5秒，打開裝檢體之離心管，以 aerosol-resistant tip吸取500 µl之檢體（若檢體量不足可加入適量之 PBS混合均勻後再吸取），加入準備好之sample tube中，將sample tube
置於震盪器上混合5秒，將sample tube在生物安全操作台內放入 aerosol containing rotor中，並旋上rotor的蓋子。將rotor放至超高速離 心機中，12,200 X g 離心3分鐘，取出sample tubes，並避免離心管內
之上清液與沉澱混合，打開管蓋，將上清液倒入廢液桶內，並以手 指輕彈管子以倒除剩餘上清液。將sample tubes放至專用oven中，溫 度115℃，60分鐘以殺死活菌。sample lysis：將超音波震盪水槽(BD ProbeTec ET sonic bath)預熱至65 +/- 5 C，並確定水槽內的水位是否 在MAX 和 MIN之間，取出oven中之sample tube，放入裝standard rotor 的離心機內，離心10秒鐘，加入CTB wash buffer 2 100 µl，旋 緊Sample Tube蓋子，強力震盪每一檢體5秒鐘。離心管放回試管架上 時，將管子依架上凹槽壓入，放進超音波震盪水槽60分鐘。sample neutralization：sample tube放入裝standard rotor 的離心機內，離心10 秒鐘，吸取600 l 的CTB lysis buffer 3到檢體離心管內。
sample priming：取出priming reagent cup放至加熱盤中，加入抽 好DNA的檢體150 ml至priming reagent cup，加熱75℃，20分鐘，同
時將amplification reagent cup放至54℃加熱盤中預熱，20分鐘後將 priming reagent cup中檢體抽取100 ml加至amplification cup中，以膠 膜封蓋，即可放至BD ProbeTecTM ET儀器中進行分析。分析時間60 分鐘，完成後儀器自動報告為陽性或陰性，陽性結果即表示檢體中 含有M. tuberculosis complex DNA(45)。