國立中興大學物理系 生物物理實驗 95 學年度
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實驗四 生長曲線測量
實驗目的
利用菌液的單一波長吸光值來了解其生長情況。
實驗原理
在生物學中，若是要利用某種生物來進行任何實驗，就必須先了解此種生 物的生長特性。如要在實驗中取得狀況較佳，且生長均一的菌，則必須要取得 正處於對數生長期的菌：此時每個細胞的生長速度以及構成接近相同。在不同 的培養基，通風條件，溫度等等，生長曲線多少會有點差異。概括而論，細菌 於液態培養液的生長過程包含了 lag phase(遲滯期)， exponential/ log phase(對 數期)， stationary phase(停滯期)， 和 death phase(死亡期)等四個階段。起始的 遲滯期為一成長緩慢的時段，此時主要為細菌對新鮮培養液的適應期。接著為 快速成長的對數期，顧名思義可知於此期間，細菌成長速度正比於其總個數，
亦即以指數倍率的方式增加。由於培養一所含的養分有限，因而在細菌個數急 劇成長一段時間後，速度會漸趨平緩而進入所謂的停滯期。此時細菌的數目因 複製率與死亡率的平衡，而達一穩定值。最後因養份的逐漸耗盡，細菌新生複 製速率漸低於死亡率，其總個數將以近四隊數衰減方式下降。
通常培養液內細菌數目的測量，以量測液體之混濁度(turbidity)為準。ㄧ般 而論，此混濁度的測定，可以樣品於波長660nm 處的吸光值(OD 值)來決定。
實驗步驟
A.儀器用具spectrophotometer hemocytometer 顯微鏡
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恆溫培養箱
酒精燈或無菌操作台 接種環或滅菌過的牙籤
B.藥品試劑
大腸桿菌E. coli LB 培養液
C.方法步驟
1. 取出實驗一所培養的過夜菌液，以 1/100 的比例加入第一天所製作之 LB 培養 液20ml 中(加入 200µl 菌液)。混合均勻後，取出 1ml 菌液於微量離心管中，其 餘的菌液置入培養箱內。
2. 接種一個小時後，每隔一個小時測量一次 OD600(意即在波長 600nm 時的光譜吸 收值，Abs，對照樣品為未接種之 LB 培養液)。每次測量時取出 1ml 菌液，依 序製作1/100 及 1/10000 的稀釋液，以新鮮 LB 培養液(每組輪流替換)作為對照 組，分別測量其光譜吸收值。
3. 吸取測量之菌液滴於 hemocytometer 上，於顯微鏡下計算菌數。
4. 以時間為橫軸，縱軸分別取 log(OD600)及 log(菌數)，繪出菌株生長曲線圖。
結果與分析
若菌種狀況不錯, 一般來說經過 6~8 小時後大腸桿菌就會進入生長平緩期. 但若 菌種狀況較差, 有可能會需要多幾個小時才會達到平緩期.
使用細胞計數器做菌數計算時, 最好採取單一標準, 比如在方格中壓到右下兩 條線的不計算, 壓到左上兩條線的則計算在內. 5x5 宮格中, 可只取五格, 分別是四 個角落以及中央.
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問題與討論
1. 培養歷程中, 最先經歷的是遲滯期. 試問為何會有遲滯期的發生?
2. 試著計算你此次所培養的細菌, 每代分裂時間大約為多少? 寫下你的算式. 7 提示: 慎選生長期.
附錄
測量細胞數量的方式(Methods for Measuring Cell Mass )
決定細胞數量的方式可區分為直接量測與間接量測兩種方式。直接測量的方法 有:
1. 物理量測法:直接量取細菌乾掉後的質量或體積。
2. 化學量測法:直接測讀其所含化學總量，如總蛋白質或 DNA 含量等方式。
間接測量的方法有:
1. 化學活性測量:如氧或二氧化碳濃度變化(消耗率或產生率)的量測。
2. 濁度(turbidity)測量:有許多種不同的方式皆可測量濁度，而光散射實驗為常 用的方式。粒子性物體(如細菌等)對光的散射(scattering)量，會正比於其粒 子個數，因而量測懸浮樣品的吸光值(OD 值)，將正比於其總值量(或總個數)。
經適當的校正後，可換算出所欲量測的正確值。光學測量法為ㄧ簡易且非壞性 的量測，不過其靈敏度侷限於每立方公分不超過 107細菌個數。
實際細菌個數的測量亦有數種方式，然而ㄧ般較直接的方法為置於顯微鏡 下，直接數其個數。
