建構適用於基因傳遞的螢光劑-質體接合物

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

建構適用於基因傳遞的螢光劑-質體接合物(第 2 年) 研究成果報告(完整版)

計 畫 類 別 ： 個別型

計 畫 編 號 ： NSC 95-2221-E-011-003-MY2

執 行 期 間 ： 96 年 08 月 01 日至 97 年 07 月 31 日 執 行 單 位 ： 國立臺灣科技大學化學工程系

計 畫 主 持 人 ： 曾文祺

計畫參與人員： 碩士班研究生-兼任助理人員：莊智元 碩士班研究生-兼任助理人員：張家健 碩士班研究生-兼任助理人員：林皓譽 碩士班研究生-兼任助理人員：劉晉亨 博士班研究生-兼任助理人員：唐建翔 博士班研究生-兼任助理人員：蘇玲鈺

處 理 方 式 ： 本計畫涉及專利或其他智慧財產權，2 年後可公開查詢

中 華 民 國 97 年 10 月 31 日

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫 5 成 果 報 告

□期中進度報告

建構適用於基因傳遞的螢光劑-質體接合物

計畫類別：

5

執行期間： 95 年 08 月 01 日至 97 年 07 月 31 日

計畫主持人：曾文祺 共同主持人：

計畫參與人員： 唐建翔 蘇玲鈺 莊智元 張家健 林皓譽 劉晉亨

成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：□精簡報告

5

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份

□國際合作研究計畫國外研究報告書一份

處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、列管計畫及 下列情形者外，得立即公開查詢

5

5

執行單位：臺灣科技大學化學工程學系

中 華 民 國 97 年 10 月 30 日

2

摘要 ... 3

前言 ... 5

實驗步驟 ... 6

質體的製備 ... 6

carboxytetramethylrhodamine 與 N-BOC- 1,6-diaminohexane 接支反應 ... 6

N-bromosuccimide 與質體核酸反應 ... 6

carboxytetramethylrhodamine-diaminohexane 標記 DNA ... 6

動物細胞培養 ... 6

螢光標記 DNA 的傳遞量測 ... 6

結果與討論 ... 7

NBS 濃度對 DNA 的影響 ... 7

N-BOC-1,6-diaminohexane 與 5(6)-carboxytetramethylrhodamine 接支反應 ... 7

DNA 與 5(6)-carboxytetramethylrhodamine 接支反應 ... 8

DNA—螢光劑化合物螢光特性的測定 ... 9

酸鹼值對 DNA—螢光劑化合物螢光特性的影響 ... 11

DNA 與 fluorescein 接枝反應 ... 12

DNA—螢光劑化合物間螢光能量傳遞 ... 13

利用 DNA—螢光劑化合物進行細胞轉染 ... 15

結論 ... 15

參考文獻 ... 16

計畫成果自評 ... 17

摘要

螢光劑—質體接合物，可應用於細胞內的追蹤觀察，利於提供對非病毒型載體轉染機制更深入的暸解。

溴代丁二醯亞胺可與核酸中鳥糞核糖反應。結果顯示溴代丁二醯亞胺在過高濃度時，容易將DNA全部分 解；但在適當濃度下，確實可修飾DNA。進一步與羅丹明螢光劑或螢光異硫氰酸鹽反應後，可形成螢光 劑—質體接合物。此接合物具螢光特性，以電泳檢測時，與未修飾的質體特性相近。當分別帶有羅丹明 螢光劑與螢光異硫氰酸鹽的接合物混合之後，可偵測帶螢光劑之間的螢光能量傳遞。以含有這些螢光劑 的DNA接合物轉染細胞後，在流式細胞儀上可定量細胞的螢光強度。

關鍵詞: 基因 傳遞 質體 螢光劑

Abstract

Fluorophore-plasmid conjugates can be used in cellular trafficking to provide the understandings of the mechanisms of transfection mediated by non-viral vectors. N-bromosuccimide (NBS) was used to modify the guanosine of nucleic acid. The results showed that DNA tends to be degraded at high NBS concentrations and can be modified at an optimal concentration. The modified DNA was further reacted with either fluorescein or tetrarhodamine, which carried a spacer of six carbons. This conjugate exhibited fluorescence characteristics and had the properties very similar to the unmodified plasmid when examined by electrophoresis. When the conjugates with fluorescein and with tetrarhodamine were mixed together, the fluorescence energy transfer between the two fluorophores could be detected. When CHO cells were transfected with the complexes containing the fluorophore-plasmid conjugate, the cellular fluorescence could be measured quantitatively by flow cytometry.

Keyword: gene, delivery, plasmid, fluorophore

前言

基因療法所使用的載體可分為兩大類：非病毒載體與病毒載體。病毒型載體僅管擁有高效率的特 點，然而在臨床上的應用具有潛在的毒性，是其一大隱憂。相對病毒型載體而言，非病毒型載體安全無 慮，且製備相當簡易。然而在臨床試驗上，非病毒型載體的效率一般均低於病毒型載體 若能提昇其效 率，將有助於擴展非病毒型載體在基因療法上的應用[1,2]。

藉由瞭解轉染的機制，來設計新型的非病毒型載體，或改善目前非病毒型載體的效率，可避免因利 用嘗試錯誤法所需較長的時間及較多的人力。細胞轉染機制的瞭解，可透過追蹤載體進入細胞內之後，

其相對位置與時間之間的關係。觀測追蹤載體在細胞中的活動，大多以螢光顯微鏡為主。然而，現今一 般用來偵測核酸的螢光劑並不適合用於偵測載體之用。因為這類的核酸螢光染劑，依靠在插入核酸雙股 螺旋的鹼基夾層中之後方產生螢光。然而，一旦核酸形成載體合體之後，核酸受到正電的作用產生凝聚，

會將核酸螢光染劑由鹼基夾層中擠壓排出。導致核酸螢光染劑與核酸各自分別進入細胞內，無法提供追 蹤偵測之用。因此，惟有將螢光染劑以化學鍵結於核酸之上，方能有效地利用螢光，來偵測細胞內的外 來核酸。

對核酸進行化學標記向來不易，特別是雙股螺旋呈現封閉環型的質體核酸。相對而言，單股線型的 核酸，在其3’及5’端均有較易進行反應的官能基，可供化學反應之作用。尤其是僅具有數十個鹼基的單 股螺旋線型核酸，更易於進行化學反應﹔甚至於核酸合成時，便可將已帶有螢光劑的鹼基加進線型核酸 中。目前應用於基因表現的質體核酸，為環型結構，與線型核酸不同，本身並不具有裸露在3’及5’端的 官能基。

目前常用於標記質體核酸的方法約有下列數種：

z 模仿標記具有數十個鹼基的線型核酸的方式，先以去氧核糖核酸酶(DNase I)將環型的質體核酸造成 缺口，接著利用聚合酵素(polymerase I)將已帶有螢光劑的鹼基加進缺口中[3]。再經純化將酵素及未 反應的螢光鹼基去除，便可得具有螢光特性的質體核酸。此一方法雖然已有商品化的套組產品，但 受限於帶有螢光劑鹼基及所使用酵素的高昂價格，每個套組僅供標記少量的核酸，使得每次所進行 標記的單位成本非常高。

z 先設計可與質體核酸上一小部份鹼基互補的PNA(peptide nucleic acid)，再利用胜肽固態合成的方 法，合成帶有螢光劑的PNA。將適量帶有螢光劑的PNA 與質體核酸混合後，即可藉由鹼基互補的 關係，製備成具有螢光特性的質體核酸，無需進一步的回收、純化[4,5]。對螢光標記質體核酸而言，

此一方法最為簡約、直接，而且對核酸構型的改變最少。但是合成帶有螢光劑PNA的多重步驟及價 格高昂的PNA單體，限制此一方法的廣泛使用。

z 直接對質體核酸做修飾的做法，可以在核酸螢光染劑插入核酸雙股螺旋的鹼基夾層中之後，再利用 光化學反應進行鍵結，最後分離、純化即可得具螢光特性的質體核酸。目前核酸螢光染劑可與核酸 進行光化學反應產生鍵結的並不多，常用的是psolaren 及ethidium monoazide (EMA) [6]。psolaren 由 於需要以紫外光雷射進行激發，假如欲利用一般藍光或綠光雷射進行激發，須再於psolaren 上鍵結 另一可供在可見光雷射下使用的螢光染劑，造成化學反應步驟較為複雜。至於使用EMA 核酸螢光 染劑標記質體核酸，步驟相對簡易許多。僅需在EMA 和DNA 充分混合後，經光照進行反應，再將 未反應的EMA 移除即可。

然而，EMA的螢光強度微弱，不利於在螢光顯微鏡下觀察，本計畫利用N-bromosuccimide與核酸中 鳥糞核糖(guanosine)反應。再將carboxytetramethyl -rhodamine 鍵結於DNA之上。

6

實驗步驟

質體的製備

以CMV 為起動子(promoter)，帶有紅色螢光蛋白基因的質體，將以calcium-heat shock 的方式送入 大腸桿菌宿主中，然後以LB 培養基在37 ^oC 下養殖。在大腸桿菌中大量繁殖的質體，將以本實驗室已 建立的純化程序，利用Q-Sepharose 離子交換樹脂回收、純化[7]。

carboxytetramethylrhodamine 與 N-BOC- 1,6-diaminohexane 接支反應

5mg的carboxytetramethylrhodamine溶於1.9ml DMF中，再加入dicychlohexyl carbodiimide (DCC) 2.6mg 及N-hydroxy succinimide(NHS) 1.337mg。於室溫下攪拌反應12小時後，加入5.21 l  N-BOC-1,6- diaminohexane，繼續於室溫下再攪拌反應12小時。之後加入10ml ether，沈澱產物，再以ethyl acetate萃 取。

N-bromosuccimide 與質體核酸反應

100 微克(μg)帶有紅色螢光蛋白基因的質體與不同濃度( 1, 2, 4, 8 mM)的N-bromosuccimide反應，

分別在反應開始後 10、15 分鐘取樣。然後在含0.8% 瓊脂糖膠體電泳上，與未反應的質體比較，以確 認與環氧氯丙烷反應後的質體之構型是否產生據烈變化。反應結束後，將質體以P-60 gel 管柱，利用離 心移除未反應的NBS，純化所得的質體留待與螢光劑反應。

carboxytetramethylrhodamine-diaminohexane 標記 DNA

carboxytetramethylrhodamine-diaminohexane 與25微克(µg)NBS修飾過的質體在1M sodium bicarbonate(pH9.6) 中於室溫下反應12hr。之後，利用P-60 gel 管柱純化。

動物細胞培養

在實驗中使用的細胞為中國大頰鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary cell；CHO 細胞），所使用的培 養液為Dulbecco’s Modified Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM）並加入10 %的胎牛血清。細胞 以T-75 flask培養在37 ℃，5 % CO2恆溫培養箱中。

螢光標記 DNA 的傳遞量測

利用聚乙烯亞胺與DNA依照N/P比值為9，所形成的複合物對中國大頰鼠卵巢細胞進行轉染，並且 利用流式細胞儀來偵測DNA在細胞上的傳遞效率。以每平方分104的細胞數目培養12~16 小時後，加入 聚乙烯亞胺與DNA所形成的複合物，於37 ℃，5 % CO2進行轉染6小時。之後，以流式細胞儀來得知細 胞的DNA螢光強度。

結果與討論

NBS 濃度對 DNA 的影響

NBS與DNA的反應如下圖如示:

HN

N N

N H₂N

R O

Guanine Residue

8

+

N Br O

O

N-Bromosuccinimide 8-Bromo-guanine Active Intermediate HN

N N

N H₂N

R O

Br

HN

N N

N H₂N

R O

spacer dye

當DNA與NBS反應後，利用電泳分析。發現以8mM、4 mM N-bromosuccimide處理過之DNA，由膠 上無觀察到明顯的band。而以2mM、1 mM N-bromosuccimide處理過之DNA，由膠上位置判斷，可能是 被切成linear form bromine-activated DNA在NBS與DNA冰浴10min，尚能維持linear form。但反應時間增 加到24小時，明顯可看出DNA已全被切成小片段。若反應溫度提高或反應時間增長，DNA會繼續被切成 小片段。

lane1:1ug DNA

lane2:以 8mM bromosuccinimide 冰浴 15min 之 1µg DNA lane3:以 4mM bromosuccinimide 冰浴 15min 之 1µg DNA lane4:以 2mM bromosuccinimide 冰浴 15min 之 1µg DNA lane5:以 1mM bromosuccinimide 冰浴 15min 之 1µg DNA lane6:以 8mM bromosuccinimide 冰浴 10min 之 1µg DNA

N-BOC-1,6-diaminohexane 與 5(6)-carboxytetramethylrhodamine 接支反應

N-BOC-1,6-diaminohexane與5(6)-carboxytetramethylrhodamine接支反應如下圖所示:

NH2-spacer-dye

8

O N

N CH₃

CH₃ CH₃

CH₃

O O OH

O

+

NH

NH₂ O

O H₃C

CH₃

CH₃

5(6)-carboxytetramethylrhodamine N-BOC-1,6-diaminohexane

O N

N CH3

CH3

CH3

CH3

O O O

O NH NH

(CH₃)₃C O O

O N

N CH3

CH3

CH3

CH3

O O O

O NH₂ NH

反應後的產物，以TLC分析後，可發現tetramethylrhodamine的螢光特性並未被破壞。反應前後，由 於加入1,6-diaminohexane為spacer改變了tetramethylrhodamine的極性，影響其在TLC上移動的速率及位 置。

mobile phase : methanol/acetonitrile=9:1 Lane1 : 5(6)carboxytetramethylrhotamine

Lane2 : 合成產物以 ethyl acetate wash 之下層液

Lane3 : 合成產物以 ethyl acetate wash 後，與 TFA 反應 DNA 與 5(6)-carboxytetramethylrhodamine 接支反應

進一步將NBS活化後的DNA solution以P-6 Gel column純化，所得的DNA與上述帶有spacer的 5(6)-carboxytetramethylrhodamine-diaminohexane依表所列進行反應，之後將反應產物經由透析純化。

DNA (1µg/µL)

1M sodium bicarbonate

pH9.6

N-bromosuccimide (2mg/ml)

N-bromosuccimide

final conc.(mM) Dye(mg) Dye/NBS

100 µL 100 µL 356 µL 8 4 200X

100 µL 100 µL 356 µL 16 4 100X

100 µL 100 µL 178 µL 4 1 100X

100 µL 100 µL 267 µL 1 2 50X

TFA

100 µL 100 µL 89 µL 2 1 200X 當產物利用電泳分析後，可見DNA被線性化，同時具有螢光特性。其中可發現不同的NBS與帶有 spacer的tetramethylrhodamine之間的比例，亦影響標記後DNA的螢光亮度。

Lane1:non modified DNA Lane2:(NBS/dye)8/4 Lane3:(NBS/dye)16/4 Lane4:(NBS/dye)4/1 Lane5:(NBS/dye)16/2 Lane6:(NBS/dye)2/1

將合成後，帶有螢光劑的DNA經由UV/Vis光譜測定DNA上所帶螢光劑的量。假設DNA在紫外光 260nm下的吸光與螢光劑在可見光526nm下的吸收，互不干擾影響。因此，在260nm下可測得DNA的濃 度，而在526nm測得tetramethylrhodamine的濃度。由下表結果可得知，在不同比例的NBS與帶有spacer 的tetramethylrhodamine反應後，DNA上所帶的螢光基團的量幾乎是一定值，不因反應物間不同比例而造 成不同的變化。

由於利用電泳所測得的結果，和經由UV/Vis光譜所測定DNA上所含螢光基團的結果，並不一致。

因此，進一步利用螢光光譜儀測量DNA接上螢光基團後，整個分子螢光特性的變化。

DNA—螢光劑化合物螢光特性的測定

首先，利用可見光光譜量測DNA上螢光基團的吸收值。發現不同反應物比例雖然得到相近的接支 率，然而螢光基團的吸收光譜却隨著反應物量的不同而有所變化。部份DNA—螢光劑化合物呈現两個不

Bromine- activated

TAMRA-NH (CH2)6NH2

反應量

OD260 DNA conc.

(µg/ul)

UV 光譜 max.

Abs.

526nm 之 Abs.

測量時 TAMRA-DN A(or guanine)

含量

TAMRA-NH(

CH2)6NH2-D NA 中 dye 的

conc.(mole)

DNA(or guanine) : TAMRA-NH(

CH2)6NH2

9.6712E-13 2374.5640 1 8mM 4mg 0.0006 0.003 524nm/0.21287 0.20898

1.1364E-09

2.2965E-09 1:

2.0209

1.3701E-11 172.5169

2 16mM 4mg 0.0085 0.0425 524nm/0.21593 0.21509

1.6098E-08 2.3636E-09 1:

0.1468

532nm/0.19679 8.7041E-12 240.1178

3 4mM 1mg 0.0054 0.027

492nm/0.2691

0.19019

1.0227E-08

2.0900E-09 1:

0.2044

528nm/0.2195 8.7041E-12 276.9075

4 16mM 2mg 0.0054 0.027

492nm/0.2209 0.21933

1.0227E-08 2.4102E-09 1:

0.2357

532nm/0.25005 1.0477E-11 253.2155

5 2mM 1mg 0.0065 0.0325

492nm/0.32161

0.24142

1.2311E-08

2.6530E-09 1:

0.2155

526nm/0.37854 2.1921E-11 189.7594

6 2mM 0.8mg 0.0136 0.068

564nm/0.35454 0.37854

2.5758E-08 4.1598E-09 1:

0.1615

10

同但相近波長的雙吸收峰。比較之下，發現所合成的DNA—螢光劑化合物，均在548nm之下有吸收峰。

進一步探討這些DNA—螢光劑化合物，在548nm激發波長下的螢光強度表現。

當利用螢光分光度計，在548nm激發波長下，量測DNA—螢光劑化合物的螢光強度。發現不同的反 應物比例呈現不同的螢光強度，而當濃度減半時，螢光強度亦隨之減半。顯示DNA—螢光劑化合物上的 螢光基團，並不會因為區域螢光濃度過高產生quench的現象。當光電管電壓可高時，部份DNA—螢光劑 化合物的螢光強度，超出儀器所能偵測的範圍。顯示螢光基團的接支數足以產生可供偵測的訊號。利用 8mM NBS修飾接枝的DNA其螢光強度，相較利用2mM NBS修飾接枝的DNA螢光強度來得低，部份原因 可能由於高濃度NBS易使DNA斷裂，反而造成較少量的DNA可與帶有spacer的螢光基團反應。此外，當 DNA—螢光劑化合物與聚乙烯亞胺形成複合體後，DNA—螢光劑化合物的螢光強度在形成複合體前後，

有明顯的差異。經由聚乙烯亞胺包覆後，DNA的螢光強度不減反增，約為原來未包覆前120%至150%。

大多DNA—螢光劑化合物的螢光強度，在形成載體複合體後，由於DNA被凝結成較緊密的分子構形，常 導致其上的螢光基團聚集，造成quench的現象而使螢光強度降低。然而聚乙烯亞胺却有助於提升DNA—

螢光劑化合物的螢光強度，因此進一步探討螢光劑是否因為接枝的化學反應，導致其螢光強度易受對周 遭環境質子濃度的影響。

Ex:548nm Em:575nm Ex:548nm Em:582nm

intensity intensity content

PMT 600 PMT 700 PMT 800 PMT 600 PMT 700 PMT 800

n m

4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0 7 0 0

Abs.

0 .0 4 0 .0 6 0 .0 8 0 .1 0 0 .1 2 0 .1 4 0 .1 6 0 .1 8 0 .2 0 0 .2 2

n m

4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0 7 0 0

Abs.

0 .0 4 0 .0 6 0 .0 8 0 .1 0 0 .1 2 0 .1 4 0 .1 6 0 .1 8 0 .2 0 0 .2 2 0 .2 4

n m

4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0 7 0 0

Abs.

0 .0 0 0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5 0 .2 0 0 .2 5 0 .3 0

n m

4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0 7 0 0

Abs.

0 .0 2 0 .0 4 0 .0 6 0 .0 8 0 .1 0 0 .1 2 0 .1 4 0 .1 6 0 .1 8 0 .2 0 0 .2 2 0 .2 4

n m

4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0 7 0 0

Abs.

0 .0 0 0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5 0 .2 0 0 .2 5 0 .3 0 0 .3 5

n m

4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0 7 0 0

Abs.

0 .0 0 0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5 0 .2 0 0 .2 5 0 .3 0 0 .3 5 0 .4 0

8/4 16/2

2/1 16/4

4/1 2/0.8

HEPES buffer 0.30437 1.16987 4.26183 4µg TAMRA-NH(CH2)6NH2-DNA

(2mM bromine-activated)

2ml HEPES

buffer 178.628 709.749 198.268 709.610 4µg TAMRA-NH(CH2)6NH2-DNA

(2mM bromine-activated)

4ml HEPES

buffer 84.4126 339.519 995.791 94.4391 378.732 1000@

4µg TAMRA-NH(CH2)6NH2-DNA (2mM bromine-activated)/BPEI 25k(N/P=9) particle

2ml HEPES

buffer 210.179 847.203 234.213 940.645 4µg TAMRA-NH(CH2)6NH2-DNA

(8mM bromine-activated)

2ml HEPES

buffer 49.7313 193.061 695.183 54.6742 211.113 757.757 4µg TAMRA-NH(CH2)6NH2-DNA

(8mM bromine-activated)/BPEI 25k(N/P=9) particle

2ml HEPES

buffer 75.9524 307.637 985.216 83.135 337.613 1000@

酸鹼值對 DNA—螢光劑化合物螢光特性的影響

DNA—螢光劑化合物的水溶液先以HCl將pH值調降至約1左右，接著利用1N的NaOH逐漸調昇pH 值。分別在兩個不同PMT的電壓下，測量其螢光強度。結果發現在pH值在1至10之間DNA—螢光劑化合 物的螢光強度，均維持在原始未調整pH前的80% 以上。然而當pH值回調至7時，螢光強度亦無法回復與 未調整pH前的螢光強度相同。由pH對螢光強度變化觀察得知，DNA—螢光劑化合物上的螢光基團 TAMRA，對pH的依存性並不高，不易因pH的變化而產生遽烈的螢光強度變化。

測量 TAMRA-NH(CH2)6NH2-DNA 在不同 pH 下螢光的變化。

intensity added 1N

NaOH volume(µl)

pH PMT 600 PMT 700

0 7.4 239.2400 959.8140 100% 100%

0 ~1 190.758 772.081 80% 80%

5 ~4 200.319 809.699 84% 84%

10 4~5 203.069 824.000 85% 86%

15 ~6 213.531 862.799 89% 90%

20 6~7 217.446 874.264 91% 91%

25 ~7 218.545 884.652 91% 92%

30 7~8 209.296 842.505 87% 88%

35 ~8 208.362 841.886 87% 88%

40 ~8 215.364 875.300 90% 91%

45 8~9 220.232 889.896 92% 93%

50 8~9 215.422 873.309 90% 91%

55 8~9 199.448 815.928 83% 85%

60 ~9 200.965 815.302 84% 85%

65 ~9 199.388 809.838 83% 84%

70 9~10 199.388 818.029 83% 85%

75 ~10 202.211 817.979 85% 85%

12

DNA 與 fluorescein 接枝反應

透過類似TAMRA接枝，將fluorescein接枝於經由NBS修飾過的DNA之上。首先fluorescein先與 N-BOC-1,6-diaminohexane反應，之後Boc保護基以TFA移除後，再與NBS修飾過的DNA作用，最後以P-6 column純化。純化後的DNA以電泳檢測其DNA完整性與螢光特性。由電泳上可見些微的DNA被直線化 不再以supercoiled的型態存在，造成在電泳膠上產生較為模糊的帶狀螢光。

1 2 3 4 Lane 1: 5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA (NBS/dye=8mM/1mg)

Lane 2: 5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA (NBS/dye=8mM/2mg) Lane 3: 5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA (NBS/dye=8mM/4mg) Lane 4: 5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA (NBS/dye=8mM/8mg)

O

HO O

O O OH

OH

O

HO O

O O

OH O NH

NH O C(CH₃)₃ O

O

HO O

O O

OH O NH

NH2

NH

NH₂ O

O H3C

CH₃

CH3

+

5-carboxyfluoresce i

N-BOC-1,6-diaminohe

TFA

550 600 650 700 0

100 200 300 400 500 600 700

Wavelength (nm)

Intensity (a.u.)

583.97 , 217.363 A

D

E

550 600 650 700

100 200 300 400

Wavelength (nm)

Intensity (a.u.)

583.97 , 217.363 B

A

C

550 600 650 700

50 100 150 200 250 300 350

Wavelength (nm)

Intensity (a.u.)

583.97 , 290.335

583.97 , 217.363 C A

B

E

D

DNA—螢光劑化合物間螢光能量傳遞

利用以EMA標記的DNA為基準，取相近螢光強度之5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA與混合EMA混合後，

觀測是否發生fluorescence energy transfer效應。並同時固定EMA標記DNA的量改變

5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA的量，量測fluorescence energy transfer的變化。當帶有螢光標記的DNA混合之 後，可發現EMA的螢光強度受到來自fluorescein的螢光激發而增強。並隨著混合物中fluorescein標記DNA 的量的增加，EMA的螢光強度亦隨之增強。而且當利用含有DOTAP的微脂粒或聚乙烯亞胺，與此一帶 有螢光標記DNA的混合物，形成載體複合物之後。發現EMA因fluorescence energy transfer而產生的螢光 強度並未呈現大幅度的變化。可見在DNA被DOTAP或聚乙烯亞胺凝結後，DNA上接枝的螢光基團產生 聚集，並未造成quench的現象而使螢光強度降低。這些結果顯示DNA上的螢光基團接枝數目，並未高到 會導致區域濃度過高而產生quench，但可以產生足夠強度的螢光訊號以供偵測。

A 4 µg EMA-DNA + 0.01 µg 5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA B 4 µg EMA-DNA + 0.01 µg 5-CF-NH(CH₂)₆NH₂-DNA

complexed with DOTAP(charge ratio 1:3)

C 4 µg EMA-DNA + 0.01 µg 5-CF-NH(CH₂)₆NH₂-DNA complexed with BPEI25k(N/P=9)

D 4ug EMA-DNA

A 4 µg EMA-DNA + 0.005 µg 5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA

B

4 µg EMA-DNA + 0.005 µg

5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA complexed with DOTAP(charge ratio 1:3)

C

4 µg EMA-DNA + 0.005 µg

5-CF-NH(CH₂)₆NH₂-DNA complexed with BPEI25k (N/P=9)

D 4 µg EMA-DNA

A 4 µg EMA-DNA + 0.02 µg 5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA B 4 µg EMA-DNA + 0.02 µg 5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA

complexed with DOTAP(charge ratio 1:3)

C 4 µg EMA-DNA + 0.02 µg 5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA D 0.02 µg 5-CF-NH(CH₂)₆NH₂-DNA

E 4 µg EMA-DNA

14

550 600 650 700

0 200 400 600 800

Wavelength (nm)

Intensity (a.u.)

575.97 , 228.860 570.00 , 483.774

550 600 650 700

0 200 400 600 800

Wavelength (nm)

Intensity (a.u.)

575.97 , 228.860 574.02 , 310.064

550 600 650 700

0 100 200 300 400 500 600

Wavelength (nm)

Intensity (a.u.)

571.94 , 566.390

575.97 , 228.860 575.97 , 358.427 574.02 , 310.064

A

B C D

E 0.005ug 5-CF-NH(CH2)₆NH₂-DNA

進一步利用TAMRA與fluorescein兩螢光基團，激發波長與放射波長之間的關係，觀測fluorescence energy transfer的效應。由於TAMRA與fluorescein 的螢光強度相對EMA而言提昇許多，另外為避免過量 螢光分子導致quench效應。在製備載體複合物時，僅使用少量的螢光標記DNA，配合未標記DNA的 DNA。由結果可發現，當形成載體複合物後，由於兩個螢光基團靠近。fluorescein的放射螢光能量被 TAMRA吸收，造成TAMRA螢光強度的提昇。以聚乙烯亞胺製備載體複合物時，TAMRA螢光強度的提 昇幅度，低於以含有DOTAP微脂粒所製備的載體複合物。這可能是由於含有DOTAP的微脂粒，比聚乙 烯亞胺，更能形成緊密的載體複合物。由於在DOTAP的作用之下，fluorescein與TAMRA兩螢光基團之間 的距離，比利用聚乙烯亞胺時來得近。因此，fluorescein所放射的螢光能量能，更有效率的被TAMRA所 吸收，造成TAMRA螢光強度大幅提。固定TAMRA標記DNA的含量，並改變fluorescein標記DNA量時。

發現TAMRA螢光強度的提昇幅度，會因fluorescein量的增加而稍變大。

5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA 與 TAMRA-NH(CH2)6NH2-DNA 混合混合後，測量 energy transfer 效應

A 3.9 µg non label DNA+0.1 µg TAMRA-NH(CH2)6NH2-DNA +0.01 µg 5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA complexed by DOTAP (charge ratio 1:3)

B

3.9 µg non label DNA+0.1 µg TAMRA-NH(CH2)6NH2-DNA +0.01 µg 5-CF-NH(CH₂)₆NH₂-DNA complexed

BPEI25k(N/P=9)

C 3.9 µg non label DNA+0.1 µg TAMRA-NH(CH2)6NH2-DNA +0.01 µg 5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA

D 0.1 µg TAMRA-NH(CH₂)₆NH₂-DNA

A 3.9 µg non label DNA+0.1 µg TAMRA-NH(CH2)6NH2-DNA +0.02 µg 5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA complexed by DOTAP

B

3.9 µg non label DNA+0.1 µg TAMRA-NH(CH2)6NH2-DNA +0.02 µg 5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA complexed by

BPEI25k(N/P=9)

C 3.9 µg non label DNA+0.1 µg TAMRA-NH(CH₂)₆NH₂-DNA +0.02 µg 5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA

D 0.02 µg 5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA E 0.1 µg TAMRA-DNA

A 3.9 µg non label DNA+0.1µg TAMRA-NH(CH2)6NH2-DNA +0.04 µg 5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA complexed by DOTAP B 3.9 µg non label DNA+0.1µg TAMRA-DNA+0.04 µg

5-CF-NH(CH₂)₆NH₂-DNA complexed by BPEI25k(N/P=9) C 3.9 µg non label DNA+0.1µg TAMRA-NH(CH2)6NH2-DNA

+0.04 µg 5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA D 0.04 µg 5-CF-NH(CH2)6NH2-DNA E 0.1 µg TAMRA-NH(CH₂)₆NH₂-DNA

利用 DNA—螢光劑化合物進行細胞轉染

進一步將 TAMRA 標記及 fluorescein 標記的 DNA，利用聚乙烯亞胺，形成載體複合物。將此載體複合 物，對中國大頰鼠卵巢細胞，進行轉染。轉染完成後，將細胞固定，利用流式細胞儀測量細胞的螢光強 度。由所測量得的細胞螢光強度分佈，在以 fluorescein 標記的 DNA 進行轉染後，可在 FL1 觀測得整個 細胞族群，往螢光強度較強的區域移動。而以 TAMRA 標記的 DNA 進行轉染後，則可在 FL3 觀測得整 個細胞族群，往螢光強度較強的區域移動。顯示利用此兩螢光基團所標記的 DNA，可應用於流式細胞儀 測量細胞的轉染效率。

FL1 control FL1 cells transfected with CF-DNA

FL3 control FL1 cells transfected with TAMRA-DNA

結論

本研究完成螢光劑-質體接合物的合成。實驗顯示此螢光劑-質體接合物，可用於偵測帶螢光劑之間的螢 光能量傳遞，並在轉染細胞後，可以流式細胞儀定量細胞的螢光強度。此接合物的螢光特性，可供探討 非病毒載體的細胞染機制之用。

16

參考文獻

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計畫成果自評

本研究完成螢光劑-質體接合物的合成，及其在非病毒載體的細胞染機制上應用探討。將準備撰寫發表 於學術期刊。