以液態及固態發酵進行蛹蟲草機能性成分之研究 蔡銘璡、謝建元 ; 張德明
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摘 要
蛹蟲草(Cordyceps militaris)又稱蛹草、蠶蛹蟲草、北冬蟲夏草、北方蟲草或東北蟲草，是寄生於多種昆蟲蛹體上形成的一種 假菌核。天然的蛹蟲草含有許多機能性成分，且具有滋補強身、補肺益腎之功，因此有「國寶」之稱。由於天然蟲草採集 不易，與冬蟲夏草同樣具有類似生理活性的蛹蟲草，便具有相當大的應用潛力。 本研究主要是探討液態及固態培養方式，
進行蛹蟲草機能性成分之研究，藉由不同培養條件，來探討多醣、蟲草素、腺?的含量多寡。結果顯示碳源以使用蔗糖為 較佳；以1 % C.S.P.(Corn Steep powder)為較佳的氮源；使用棉花塞(瓶塞半徑約16 mm，重約4.5 g)當作瓶塞，其菌體生長量 及多醣產量均較其他瓶塞好。胞外蟲草素及腺?產量，以棉花塞換成橡皮塞較高；而添加其他油脂及不同界面活性劑都有 對菌體生長有所增加，其中以1% 花生油有較高的胞外蟲草素產量，1% 橄欖油有較高胞內腺?量，1% Tween20有較高的胞 外腺?及胞內蟲草素產量。在固態培養，以棉花塞為瓶塞、麥芽糖為碳源最佳；添加物則以1% Tween80有較好的菌體生長 量。
關鍵詞 : 蛹蟲草、胞外多醣、蟲草素、腺?
目錄
目錄 頁次 封面內頁 簽名頁 授權書………iii 中文摘要………
………iv 英文摘要………v 誌謝………
………vii 目錄………viii 圖目錄………
………xiii 第一章 前言………1 第二章 文獻回顧……
………2 2.1蛹蟲草的簡介………..2 2.2蛹蟲草的成分………
………..3 2.2.1一般化學成分……….3 2.2.2蟲草素（cordycepin）…………
………...3 2.2.3腺?（adenosine）……….4 2.2.4多醣組成……….5 2.2.5甘露醇(mannitol)……….………...5 2.2.6胺基酸組成……….6 2.2.7脂肪酸組成
……….7 2.3蛹蟲草藥理療效………...7 2.3.1抗腫瘤作用………
……….7 2.3.2抗氧化自由基作用……….8 2.3.3鎮靜作用………
……….8 2.3.4抗病原微生物作用……….8 2.4液態發酵………...9 2.4.1液態培養的特點……….9 2.4.2液態培養的優點……….9 2.4.3人工培養蟲 草屬之發展………...10 2.5固態發酵……….11 2.5.1固態發酵的特點………
………...11 2.5.2固態培養的優缺點………...11 2.6天然冬蟲夏草藥材與發酵蟲草菌絲體之藥 理比較….12 2.7影響蛹蟲草菌培養的因子……….12 2.7.1碳源………...13 2.7.2氮源………...13 2.7.3無機鹽類………...14 2.7.4溫度………
………...15 2.7.5通氣量………...14 2.7.6 pH值………
……….15 2.7.7其他添加物………...15 2.8二次代謝物………
……….16 第三章 材料與方法………...19 3.1實驗材料………
…….19 3.1.1試驗菌株(strain)………19 3.1.2試驗藥品………19 3.1.2.1培養基
……….. 20 3.1.2.2分析藥品……….. 20 3.1.3實驗儀器……….
….. 20 3.2基礎培養………... 21 3.2.1平板培養………. 21 3.2.2液態菌 源培養………. 21 3.3實驗方法……….. 22 3.3.1液態搖瓶培養………
……….22 3.3.1.1不同碳源對蛹蟲草的影響………...22 3.3.1.2不同氮源對蛹蟲草的影響………….
…...22 3.3.1.3不同通氣量對蛹蟲草的影響………22 3.3.1.4添加不同油脂對蛹蟲草的影響……..………..23 3.3.1.5添加不同界面活性劑對蛹蟲草的影響...23 3.3.2固態培養……….24 3.3.2.1不同碳源對 蛹蟲草的影響……..………..24 3.3.2.2不同通氣量對蛹蟲草的影響………24 3.3.2.3添加不同油脂對蛹蟲草的影 響…..…………..24 3.3.2.4添加不同界面活性劑對蛹蟲草的影響...25 3.4分析方法………
…...25 3.4.1發酵液pH值測定………..25 3.4.2菌絲體濃度測定…………..……….26 3.4.2.1液 態培養菌體乾重測定………...26 3.4.2.2固態培養菌絲菌體濃度測定…………...…….26 3.4.2.3菌體濃度測定─葡 萄糖胺比色法………....…26 3.4.3蛹蟲草醱醱液殘醣量測定………..….27 3.4.4蛹蟲草多醣體測定………
……..….28 3.4.4.1蛹蟲草胞外多醣分析………28 3.4.4.2蛹蟲草胞內多醣分析………..……..28
3.4.4.3酚硫酸法………..………..28 3.4.4.4標準曲線製作步驟………..…………..29 3.4.5 HPLC分析 腺?、蟲草素………..29 3.4.5.1菌絲體胞內蟲草素及腺?含量分析……..…..30 3.4.5.2醱酵液胞外蟲草素及腺?含 量…..…………..30 3.4.5.3蟲草素及腺?標準品之配製…………..……..30 第四章 結果與討論……….. ……….32 4.1不同碳源對蛹蟲草液態培養之影響………...32 4.2不同氮源對蛹蟲草液態培養之影響……… …….36 4.3不同通氣量對蛹蟲草液態培養的影響……..………...39 4.3.1不同通氣量對蛹蟲草菌體生長及多醣生成的 影響… ………...39 4.3.2不同通氣量對蛹蟲草蟲草素及腺?含量之 影響……… …………..40 4.4不同油脂對蛹蟲草液態培養的影響………...49 4.4.1不同油脂對蛹蟲草菌體生長及多醣生成的影響 ………..49 4.4.2不同油脂對蛹蟲草蟲草素及腺?含量之影響...50 4.5不同界面活性劑對蛹 蟲草液態培養的影響………….59 4.5.1不同界面活性劑對蛹蟲草菌體生長及多醣生成的 影響……… ……...…...59 4.5.2不同界面活性劑對蛹蟲草蟲草素及腺?含量之 影響………...60 4.6不同碳 源對蛹蟲草固態培養菌絲體生成的影響...…..69 4.7不同通氣量對蛹蟲草固態培養菌絲體生成的影響...69 4.8不同油脂對蛹 蟲草固態培養菌絲體生成的影響…...70 4.9不同界面活性劑對蛹蟲草固態培養菌絲體生成的 影響……… ………..…..70 第五章 結論………...……75 參考文獻……… ………...78 附錄一 C.S.P.主要成分一覽表………....86 附錄二 蟲草素之HPLC 層析圖………...87 附錄三 腺?之HPLC層析圖………...…88 附錄四 多醣濃度 標準檢量線………...………89 附錄五 蟲草素標準品校正曲線………...…90 附錄六 腺?標準品校正曲線………...………91 附錄七 葡萄糖胺在液態培養時的時間變化圖………...……92
附錄八 論文口試會議記錄………...…93 圖目錄 圖2.1蟲草素(Cordycepin)結構式……… ……….……17 圖2.2腺?(Adenosine)結構式………...17 圖4.1不同碳源對蛹蟲草C.militaris培養第七 天菌體生長之影響………..34 圖4.2不同碳源對蛹蟲草C. militaris培養第九天菌 體生長之影響………..35 圖4.3不同氮源對蛹蟲草C. militaris培養第七天菌體生 長之影響………..37 圖4.4不同氮源對蛹蟲草C. militaris培養第九天菌體生長之 影響………..38 圖4.5 不同通氣量對蛹蟲草C .militaris培養第七天菌體生長之影 響………..41 圖4.6 不同通氣量對蛹蟲草C. militaris培養第九天菌體生長之影響 ………..42 圖4.7 不同通氣量對蛹蟲草C. militaris培養第七天發酵液中蟲草 素及 腺?的影響………..43 圖4.8不同通氣量對蛹蟲草C. militaris培養第九天發酵液中蟲草 素及腺? 的影響……….………..44 圖4.9不同通氣量對蛹蟲草C. militaris培養第七天菌絲體中蟲草 素及腺?的 影響………..45 圖4.10不同通氣量對蛹蟲草C. militaris培養第九天菌絲體中蟲草 素及腺?的影 響……….46 圖4.11不同通氣量對蛹蟲草C. militaris培養第七天胞外蟲草素及腺?之HPLC層析 圖……….………..47 圖4.12 不同通氣量對蛹蟲草C. militaris培養第七天胞內蟲草素及腺?之HPLC層析圖 ………..………..48 圖4.13不同油脂對蛹蟲草C. militaris培養第七天菌體生長之影 響………...……… ………...51 圖4.14不同油脂對蛹蟲草C. militaris培養第九天菌體生長之影響………..… ………....52 圖4.15不同油脂對蛹蟲草C. militaris培養第七天發酵液中蟲草素及腺?的影響……… …..………53 圖4.16不同油脂對蛹蟲草C. militaris培養第九天發酵液中蟲草素及腺?的影響………..……… ………54 圖4.17不同油脂對蛹蟲草C. militaris培養第七天菌絲體中蟲草素及腺?的影響……….… ……….55 圖4.18不同油脂對蛹蟲草C. militaris培養第九天菌絲體中蟲草素及腺?的影響……….……… ……….56 圖4.19 不同油脂對蛹蟲草C. militaris培養第七天胞外蟲草素及腺?之HPLC層析圖………..……… ……….57 圖4.20 不同油脂對蛹蟲草C. militaris培養第七天胞內蟲草素及腺?之HPLC層析圖……….…… …………..58 圖4.21不同界面活性劑對蛹蟲草C. militaris培養第七天菌體生長之影響……….……… ……….61 圖4.22不同界面活性劑對蛹蟲草C. militaris培養第九天菌體生長之影響………..……… ……62 圖4.23不同界面活性劑對蛹蟲草C. militaris培養第七天發酵液中蟲草素及腺?的影響………..……… …63 圖4.24不同界面活性劑對蛹蟲草C. militaris培養第九天發酵液中蟲草素及腺?的影響………..……… …64 圖4.25不同界面活性劑對蛹蟲草C. militaris培養第七天菌絲體中蟲草素及腺?的影響…………..……… …65 圖4.26不同界面活性劑對蛹蟲草C. militaris培養第九天菌絲體中蟲草素及腺?的影響…………..……… …66 圖4.27 不同界面活性劑對蛹蟲草C. militaris培養第七天胞外蟲草素及腺?之HPLC層析圖………...……… …67 圖4.28 不同界面活性劑對蛹蟲草C. militaris培養第七天胞內蟲草素及腺?之HPLC層析圖………...……… …68 圖4.29 不同碳源對蛹蟲草C. militaris固態培養菌絲體生成的影響………..………71
圖4.30 不同通氣量對蛹蟲草C. militaris固態培養菌絲體生成的影響………..………72
圖4.31 不同油脂對蛹蟲草C. militaris固態培養菌絲體生成的影響……….……….73
圖4.32 不同界面活性劑對蛹蟲草C. militaris固態培養菌絲體生成的影響……….……….74 參考文獻
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