微晶片生化電泳分析研發（3）- 子計畫三微晶片式電泳電化學偵測器之研發

微晶片生化電泳分析研發（3）

子計畫三 微晶片式電泳電化學偵測器之研發

Development of Micro-Chip Electrophoresis System Based on Electrochemical Detection

計畫編號： NSC89-2218-E-006-069 執行期限：89/08/01 ~ 90/07/31 主持人：張憲彰 教授 成功大學醫學工程研究所 (E-mail : [email protected])

一、中文摘要

毛細管電泳具有高分離效能，樣本需求 少，分析速度快等特性，因此廣泛應用於 醫學及藥物分析等領域。在毛細管電泳偵 測系統上，由於電化學偵測法易於微小 化，且可對待測物種進行定性，定量的分 析。所以本研究的目的在於利用微機電製 程技術將電化學偵測系統整合於一毛細管 電泳晶片之上，並且對此一系統的性能進 行 評 估 。 本 系 統 利 用 神 經 傳 導 物 質 norepinephrine 做為電泳測試的樣本，在 5 mM Tris 緩衝液中以 60 V/cm 之電場分離 時，可在 277 秒偵測得氧化訊號，且樣本 分離時間與理論板數皆會隨分離電場增加 而下降。未來將對電化學毛細管電泳系統 的應用做進一步的推廣。

關鍵詞：毛細管電泳、微機電系統、電化學偵測

Abstr act: For highly separating efficiency,

in 5 mM Tris buffer solution, the oxidation current could be detected at 277 sec. The separation times and theoretical plate were decreased with increasing separation electric field. We will promote the application of this system to be available for other compounds in the future.

Keywor ds:

二、緣由與目的

毛細管電泳具有高分離效能及樣本需求量 少的優點，而適合於微量樣本的分析，因 此近年來被廣泛應用於臨床醫學及分析檢 驗等領域^[1]。一般的毛細管電泳設備包含了 注入系統，樣本分離管道（內徑約 20~ 100 µm，長約 20~ 75 cm），驅動電泳的高壓電 源（約 30 kV 及 200~ 250 µA），及樣本的 偵測系統。一般毛細管電泳(CE)法偵測是 採用 UV 光學法，即利用具光學應答性之 樣本通過偵測器時對 UV 之吸光值做定 量。然由 Beer’s law 可知吸光值正比於光徑 長，若 1 cm 以計吸光法偵測極限只可達 10^-6 M^[2]。固然 CE 法於分離之同時具濃縮 之功，但光學系統因體積龐大且價格昂 貴，較不利於整合於微小化分析系統的偵 測。電化學偵測法由於設備價格低廉且易 於微小化，而偵測極限可達到 10^-8 M ^[3]。 因此適用於整合在微毛細管電泳晶片的偵 測。此外，經由偵測電位的調整，我們可 以有效的避開樣本中干擾物質的影響。因 此近來電化學偵測法在毛細管電泳的發展

已漸漸受到重視 ^[4-6]。本研究中，我們將以 本研究室對於微電化學的操作經驗為基 礎。首先將先針對毛細管電泳電壓控制系 統及商品化電化學控制系統進行整合，並 對此系統性能進行評估。接著將嘗試以此 套系統於製作完成之電泳晶片上進行樣本 的測試進而配合自製的電化學控制系統，

以利整體性晶片設計及系統性能之研發。

三、實驗方法與設備

實驗試劑 本實驗中先後以配製於 pH 7.4

(ferrocyanide, 片山化學工業株式會社) 及 norepinephrine（Sigma Co.）做為測試樣本，

並採用 5 mM Tris （Trizma base，Sigma Co.）做為電泳電解液，以實際測試晶片之 電泳效能。鉑擬參考電極電鍍之電鍍液則 是將 H2PtCl6（購自 Sigma）溶解於 B-R 緩衝液配製而成，並加入 0.6 g/l 醋酸鉛以 加強電沈積製 Pt 擬參考電極時之穩定性。

晶片設計 為達到製程簡便與偵測電極不

1 之比例混合均勻後倒於母模上加熱使其 固化，待 PDMS 晶片固化後自母模取下，

即成為具有十字形電泳通道之晶片。晶片 之偵測電極部分，則是採用蝕刻法，將玻 片在蒸鍍機上鍍上厚度 50 nm 之鈦及 450 nm 之金薄層後，接著在玻璃晶片上依照分 離起始點距離由近至遠分別設計寬 200 µm 之接地電極、二根寬度皆為 50 µm 之工作

電極及參考電極與寬 200 µm 之輔助電 極。待晶片之電極製作完成後，將（PDMS）

通道晶片與玻璃電極晶片結合，最後完成 之晶片結構如圖一所示。

鉑擬參考電極的製備 由於金電極不適合 做為電化學偵測時之參考電極，因此需將 做為參考電極之金電極表面電鍍上一層 鉑，成為鉑擬參考電極，以改善參考電極 之電化學性能。將 5 mM H2PtCl6 溶液填充 於電泳晶片通道後，在晶片之金參考電極 上以 500 至-300 mV 之電位區間 (相對於 Ag/AgCl 參考電極) 內以 200 mV/ sec 的 掃引速度連續掃引 30 圈，使其表面電鍍上 鉑微粒後，即完成鉑擬參考電極之製作。

四、結果與討論

(1) 鉑擬參考電極的性能驗證 為評估製作 完成之鉑擬參考電極之電化學性質，分別 以電鍍前之金電極與電鍍後之鉑擬參考電 極做為參考電極於晶片中量測其循環伏安 圖，以評估做為參考電極之可靠性。在通 道中填充溶於 PBS 之 50 mM Fe(CN)64-溶 液，以循環伏安法於-500 mV 至 800 mV 之 電位區間用 100 mV/sec 的速度連續掃引十 圈。以電鍍前後之電極做為參考電極的測 試結果分別如圖二及圖三所示，在利用兩 不同參考電極於晶片環境之測試體系時，

所測得之 Fe(CN)64-氧化與還原電位分別在 100 mV 及-50 mV。然而，以電鍍前之金電 極做為參考電極時，氧化及還原電位各出 現 50 mV 及 100 mV 的電位飄移，但是以 電鍍完畢之鉑擬參考電極取代後，氧化及 還原電位之飄移可減少至 30 mV 以下。顯 示在晶片環境中，金電極電鍍上鉑微粒後

明顯改善了做為電化學參考電極時之可靠 度，使此一鉑擬參考電極可符合電泳晶片 系統中電化學偵測所需之參考電極需求。

(2) 電泳晶片的樣本測試 在晶片電泳性能 的測試上，研究中將 5 mM Tris 緩衝液填充 於晶片通道內以做為電泳介質，並採用 10 mM norepinephrine 做為測試樣本實際進行 電泳測試。首先在樣本儲存槽中施加 100 V 電壓使樣本於橫向之注入通道內移動 60 秒，同時於緩衝液儲存槽中施加 80 V 電壓 以防止樣本溢流至分離通道中。待樣本移 動至通道十字交叉處後，改變電場施加方 向，以 340 V 電壓(約相當於 60 V/cm )使樣 本在縱向之分離通道中進行樣本分離 420 秒，同時在樣本儲存槽及樣本廢液槽中施 加 290 V 電壓防止多於樣本由注入通道擴 散至分離通道中。電化學訊號的偵測則是 將測電極連接至 BAS 100W 電化學工作站 進行偵測。測試之結果如圖四所示，樣本 開始進行分離後 277 秒可測得約 280 nA 之 氧化電流訊號，且由偵測結果中未發現有 多於樣本溢流至分離通道中干擾測試，可 驗證系統設計適合應用於電化學毛細管電 泳系統。

(3)電泳分離條件的探討 為探討晶片之電 泳分離性質，研究中分別以 55 V/cm、 60 V/cm、 65 V/cm、 70 V/cm、 75 V/cm、 80 V/cm 之電廠強度進行 norepinephrine 之樣 本分離測試，並由測得之分離訊號計算樣 本到達時間與分離之理論板數，以探討不 同電泳條件下之分離效能。電泳時間與分 離電場的關係如圖五所示，結果中發現 norepinephrine 之分離時間與分離電場強度 之間大致呈現二次方之遞減關係，而二者 間之相關係數約為 0.95，顯示當電場強度 增加時，norepinephrine 在通道內的移動速 度也會隨著增加。另一方面，分離電場強

度和理論板數的關係結果如圖六所示，由 結果中可發現 norepinephrine 在晶片通道內 分離之理論板數與電場強度之間亦存在二 次方之遞減關係，而兩者間之相關係數約 為 0.9。本研究針對電化學偵測之毛細管電 泳系統設計一電泳晶片，並由神經傳導物 質 norepinephrine 之電泳測試對此晶片之性 能進行探討，未來將對電化學偵測之毛細 管電泳系統的應用做進一步的推廣。

五、參考文獻

[1] Frank-Michael Matysik, Potentialities of electrochemical detection in conjunction with non-aqueous capillary electrophoresis.

Electrochimica Acta, 43(1998)3475-3482.

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Chim. Acta. 305(1995)114-120.

圖二 以金電極做為參考電極在晶片 通道之 Fe(CN)64-

循環伏安圖

圖三 以鉑擬參考電極做參考電極在 晶片通道之 Fe(CN)64-循環伏安 圖

圖四 以 60 V/cm 之電場強度進行之 10 mM norepinephrine 的電泳測試結果

樣本注入 樣本分離

圖五 電泳分離電場與理論板數關係圖 y = 6E+12x^-3.2682

R² = 0.904

2E+6 4E+6 6E+6 8E+6 10E+6 12E+6

50 55 60 65 70 75 80 85

分離電場 (V/cm) 理

論 板 數

圖六 分離電場強度與分離時間關係圖

y = 2E+06x^-2.1569 R² = 0.9487

150 200 250 300 350 400 450

50 55 60 65 70 75 80 85

電場強度(V/cm)

分離時間(秒)

圖一 製作完成之電泳晶片俯視圖。

樣本儲存槽 緩衝液儲

存槽 樣本廢液槽

緩衝液廢 液槽 電泳通道 偵測電極