科技部補助專題研究計畫成果報告 期末報告

科技部補助專題研究計畫成果報告 期末報告

研究長春鹼化療藥物對愛寧達之抗藥性肺癌細胞所引起的死亡 機制

計 畫 類 別 ： 個別型計畫

計 畫 編 號 ： MOST 104-2320-B-040-003- 執 行 期 間 ： 104年08月01日至105年07月31日 執 行 單 位 ： 中山醫學大學醫學研究所

計 畫 主 持 人 ： 許國堂

計畫參與人員： 碩士級-專任助理人員：丘翎燕

碩士班研究生-兼任助理人員：許倍瑄

中　華　民　國　105　年　08　月　31　日

中 文 摘 要 ： 目前認為是因為胸苷酸合成酶(TS)蛋白質高量造成肺癌對愛寧達產 生抗藥性，可是對如何解決愛寧達產生之抗藥性並無相關的研究。

因此尋找有效的第二線化療用藥來對付具有愛寧達抗藥性之肺癌就 顯得非常需要。在癌組織中高表達的胸苷酸合成酶被認為會對愛寧 達的化療藥在治療晚期的非小細胞肺癌中的非鱗狀上皮癌產生抗藥 性。為了深入研究愛寧達產生的抗藥性機制和可能因此會對肺癌治 療的預後有重要的影響，我們使用兩株抗愛寧達藥物細胞株

A549/A400 (TP53 野生型) 和CL1/A200 (TP53-突變型)來做為此次 研究的材料。

我們首先證明了在這兩株抗愛寧達藥物細胞株中的胸苷酸合成酶 (TS)都呈現高表達，如果使用干擾胸苷酸合成酶的shRNA來抑制胸苷 酸合成酶的表達會讓抗愛寧達藥物細胞株對愛寧達產生敏感性。我 們也在細胞和動物的模式下證明得到愛寧達的抗藥性會增強上皮-間 質轉化所造成的轉移能力(EMT)，這個轉移能力是透過ZEB1這個E- cadherin 基因轉錄抑制因子來抑制上皮鈣粘蛋白(E-cadherin)和增 加纖維結合蛋白(fibronectin)的表達。當ERK1/2蛋白激酶的磷酸化 被其抑制劑(U0126)或是小干擾RNA所降低，這兩株抗愛寧達藥物細 胞的遷移和侵襲的能力就顯著的減少。

我們以前曾經證明愛寧達會利用ERK的訊息路徑來引起肺癌細胞的凋 亡，因此我們認為當經由ERK的訊息路徑無法引起肺癌細胞的凋亡而 變成抗愛寧達藥物的肺癌細胞後，這個ERK的訊息路徑反而會增加肺 癌細胞的轉移能力。同時，我們進一步使用另一類的化療藥敏畢瘤 (vinblastine)以及敏克瘤(vincristine)來有效抑制愛寧達的抗藥 性。我們的研究結果可以建議在面臨愛寧達的抗藥性時，使用長春 花生物鹼類的化療藥物可能是有效緩解愛寧達抗藥性的方法，並且 這方法不會因為TP53是否為野生型或突變型而有所影響。更重要的 意義是長春花生物鹼類的化療藥物可以降低ERK蛋白激酶被磷酸化

，所以會控制抗愛寧達藥物細胞的遷移和侵襲的能力。這一發現提 供了新的認識來克服愛寧達抗藥性引起的癌轉移。

我們感謝國科會、科技部的審查委員對我們長期的鼓勵和支持，此 申請書的目標皆已完成並且投稿到Oncogene且已經被接受和發表 (Title: The ERK-ZEB1 pathway mediates

epithelial–mesenchymal transition in pemetrexed resistant lung cancer cells with suppression by vinca alkaloids)。

Oncogene advance online publication, June 6, 2016;

doi:10.1038/onc.2016.195 (IF=7.932 ONCOLOGY R/C=15/213=7.04%).

中 文 關 鍵 詞 ： 愛寧達抗藥性Pemetrexed resistance; 胸苷酸合成酶Thymidylate synthase; 上皮-間質轉化Epithelial–mesenchymal transition;

ERK蛋白激酶; E-cadherin 基因轉錄抑制因子ZEB1; 長春花生物鹼 Vinca alkaloids

英 文 摘 要 ： Recently, high thymidylate synthase (TS) expression has been demonstrated as major factor for pemetrexed

resistance. Therefore, a clear characterization of the mechanisms to overcome pemetrexed-resistance is required.

High thymidylate synthase (TS) level in cancer tissue is

considered to result in resistance to pemetrexed therapy for advanced stages of nonsquamous non-small cell lung cancers. To further investigate the mechanism of pemetrexed resistance and potential prognostic outcomes in lung

cancer, we established pemetrexed-resistant lung

adenocarcinoma cell sublines from CL1 harboring a mutated TP53 gene (R248W) and A549 harboring wild type TP53. We found the TS expression is upregulated in both pemetrexed- resistant sublines and the reduced TS level achieved

through shRNA inhibition resulted in higher pemetrexed sensitivity. We also demonstrated that the acquisitions of pemetrexed resistance enhances epithelial–mesenchymal transition (EMT) in vivo with a mice animal model and in vitro with CL1 and A549 sublines, which was associated with upregulation of ZEB1 which, in turn, downregulates E-

cadherin and upregulates fibronectin. When ERK1/2 phosphorylation was reduced by an inhibitor (U0126) or siRNA inhibition, both pemetrexed-resistant sublines

reduced their migration and invasion abilities. Therefore, the ERK-mediated pathways induce apoptosis with pemetrexed treatment, and may in turn mediate EMT when cancer cells are resistant to pemetrexed. We further demonstrated that the growth of pemetrexed-resistant tumors could be

inhibited by vinblastine in vivo and vincristine in vitro.

Our data indicate that pemetrexed resistance could be

relieved by non-cross-resistant chemotherapeutic drugs such as vinca alkaloids and might be independent to TP53 status.

Furthermore, the phosphorylation of ERK was reduced by vincristine. This finding provides a new insight for overcoming pemetrexed resistance and metastasis by application of vinca alkaloids.

With the kindness support from NSC and MOST, we have completed the proposed investigations and the manuscript has been submitted with the title of (The ERK-ZEB1 pathway mediates epithelial–mesenchymal transition in pemetrexed resistant lung cancer cells with suppression by vinca alkaloids) which has been accepted and published in Oncogene advance online publication, June 6, 2016;

doi:10.1038/onc.2016.195 (IF=7.932 ONCOLOGY R/C=15/213=7.04%).

英 文 關 鍵 詞 ： Pemetrexed resistance; Thymidylate synthase;

Epithelial–mesenchymal transition; ERK; ZEB1; Vinca alkaloids

科技部補助專題研究計畫成果報告

（□期中進度報告/V 期末報告）

（計畫名稱）

計畫類別：V 個別型計畫 □整合型計畫 計畫編號：MOST 104-2320-B-040-003－

執行期間： 2015 年 08 月 01 日至 2016 年 07 月 31 日 執行機構及系所：中山醫學大學醫學研究所

計畫主持人：許國堂 共同主持人：

計畫參與人員：

本計畫除繳交成果報告外，另含下列出國報告，共 __0_ 份：

□執行國際合作與移地研究心得報告

□出席國際學術會議心得報告

□出國參訪及考察心得報告

中 華 民 國 105 年 09 月 01 日

附件一

2

研究計畫中文摘要：

上皮-間質轉化 Epithelial–mesenchymal transition; ERK 蛋白激酶; E-cadherin 基因轉錄抑制因子 ZEB1;

長春花生物鹼 Vinca alkaloids

研究長春鹼化療藥物對愛寧達之抗藥性肺癌細胞所引起的死亡機制

目前認為是因為胸苷酸合成酶(TS)蛋白質高量造成肺癌對愛寧達產生抗藥性，可是對如何解決愛 寧達產生之抗藥性並無相關的研究。因此尋找有效的第二線化療用藥來對付具有愛寧達抗藥性之肺癌 就顯得非常需要。在癌組織中高表達的胸苷酸合成酶被認為會對愛寧達的化療藥在治療晚期的非小細 胞肺癌中的非鱗狀上皮癌產生抗藥性。為了深入研究愛寧達產生的抗藥性機制和可能因此會對肺癌治 療的預後有重要的影響，我們使用兩株抗愛寧達藥物細胞株 A549/A400 (TP53 野生型) 和 CL1/A200 (TP53-突變型)來做為此次研究的材料。

我們首先證明了在這兩株抗愛寧達藥物細胞株中的胸苷酸合成酶(TS)都呈現高表達，如果使用干 擾胸苷酸合成酶的 shRNA 來抑制胸苷酸合成酶的表達會讓抗愛寧達藥物細胞株對愛寧達產生敏感 性。我們也在細胞和動物的模式下證明得到愛寧達的抗藥性會增強上皮-間質轉化所造成的轉移能力 (EMT)，這個轉移能力是透過 ZEB1 這個 E-cadherin 基因轉錄抑制因子來抑制上皮鈣粘蛋白(E-cadherin) 和增加纖維結合蛋白(fibronectin)的表達。當 ERK1/2 蛋白激酶的磷酸化被其抑制劑(U0126)或是小干擾 RNA 所降低，這兩株抗愛寧達藥物細胞的遷移和侵襲的能力就顯著的減少。

我們以前曾經證明愛寧達會利用 ERK 的訊息路徑來引起肺癌細胞的凋亡，因此我們認為當經由 ERK 的訊息路徑無法引起肺癌細胞的凋亡而變成抗愛寧達藥物的肺癌細胞後，這個 ERK 的訊息路徑 反而會增加肺癌細胞的轉移能力。同時，我們進一步使用另一類的化療藥敏畢瘤(vinblastine)以及敏克 瘤(vincristine)來有效抑制愛寧達的抗藥性。我們的研究結果可以建議在面臨愛寧達的抗藥性時，使用 長春花生物鹼類的化療藥物可能是有效緩解愛寧達抗藥性的方法，並且這方法不會因為 TP53 是否為野 生型或突變型而有所影響。更重要的意義是長春花生物鹼類的化療藥物可以降低 ERK 蛋白激酶被磷酸 化，所以會控制抗愛寧達藥物細胞的遷移和侵襲的能力。這一發現提供了新的認識來克服愛寧達抗藥 性引起的癌轉移。

我們感謝國科會、科技部的審查委員對我們長期的鼓勵和支持，此申請書的目標皆已完成並且投 稿到 Oncogene 且已經被接受和發表 (Title: The ERK-ZEB1 pathway mediates epithelial–mesenchymal transition in pemetrexed resistant lung cancer cells with suppression by vinca alkaloids)。Oncogene advance online publication, June 6, 2016; doi:10.1038/onc.2016.195 (IF=7.932 ONCOLOGY

R/C=15/213=7.04%).

研究計畫英文摘要：

關鍵詞: Pemetrexed resistance; Thymidylate synthase; Epithelial–mesenchymal transition; ERK; ZEB1;

Vinca alkaloids

Recently, high thymidylate synthase (TS) expression has been demonstrated as major factor for pemetrexed resistance. Therefore, a clear characterization of the mechanisms to overcome pemetrexed-resistance is required. High thymidylate synthase (TS) level in cancer tissue is considered to result in resistance to pemetrexed therapy for advanced stages of nonsquamous non-small cell lung cancers.

To further investigate the mechanism of pemetrexed resistance and potential prognostic outcomes in lung cancer, we established pemetrexed-resistant lung adenocarcinoma cell sublines from CL1 harboring a mutated TP53 gene (R248W) and A549 harboring wild type TP53. We found the TS expression is upregulated in both pemetrexed-resistant sublines and the reduced TS level achieved through shRNA inhibition resulted in higher pemetrexed sensitivity. We also demonstrated that the acquisitions of pemetrexed resistance enhances epithelial–mesenchymal transition (EMT) in vivo with a mice animal model and in vitro with CL1 and A549 sublines, which was associated with upregulation of ZEB1 which, in turn, downregulates E-cadherin and upregulates fibronectin. When ERK1/2 phosphorylation was reduced by an inhibitor (U0126) or siRNA inhibition, both pemetrexed-resistant sublines reduced their migration and invasion abilities. Therefore, the ERK-mediated pathways induce apoptosis with pemetrexed treatment, and may in turn mediate EMT when cancer cells are resistant to pemetrexed. We further demonstrated that the growth of pemetrexed-resistant tumors could be inhibited by vinblastine in vivo and vincristine in vitro. Our data indicate that pemetrexed resistance could be relieved by non-cross-resistant chemotherapeutic drugs such as vinca alkaloids and might be independent to TP53 status. Furthermore, the phosphorylation of ERK was reduced by vincristine. This finding provides a new insight for overcoming pemetrexed resistance and metastasis by application of vinca alkaloids.

With the kindness support from NSC and MOST, we have completed the proposed investigations and the manuscript has been submitted with the title of (The ERK-ZEB1 pathway mediates

epithelial–mesenchymal transition in pemetrexed resistant lung cancer cells with suppression by vinca alkaloids) which has been accepted and published in Oncogene advance online publication, June 6, 2016;

doi:10.1038/onc.2016.195 (IF=7.932 ONCOLOGY R/C=15/213=7.04%).

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科技部補助專題研究計畫成果自評表

請就研究內容與原計畫相符程度、達成預期目標情況、研究成果之學術或應用價 值（簡要敘述成果所代表之意義、價值、影響或進一步發展之可能性） 、是否適 合在學術期刊發表或申請專利、主要發現（簡要敘述成果是否具有政策應用參考 價值及具影響公共利益之重大發現）或其他有關價值等，作一綜合評估。

1. 請就研究內容與原計畫相符程度、達成預期目標情況作一綜合評估 V 達成目標

說明：此年度計畫內容與上年度之計畫具有連續性，因此合併發表在期刊上。

2. 研究成果在學術期刊發表或申請專利等情形(請於其他欄註明專利及技轉之 證號、合約、申請及洽談等詳細資訊)

論 文 ： v 已 發 表

doi:10.1038/onc.2016.195

專利：□已獲得□申請中 v 無 技轉： v 無

3. 請依學術成就、技術創新、社會影響等方面，評估研究成果之學術或應用價 值（以 500 字為限）。

我們以前曾經證明愛寧達會利用 ERK 的訊息路徑來引起肺癌細胞的凋亡，因此我們認為當經 由 ERK 的訊息路徑無法引起肺癌細胞的凋亡而變成抗愛寧達藥物的肺癌細胞後，這個 ERK 的訊息路徑反而會增加肺癌細胞的轉移能力。同時，我們進一步使用另一類的化療藥敏畢瘤 (vinblastine)以及敏克瘤(vincristine)來有效抑制愛寧達的抗藥性。我們的研究結果可以提供建 議在面臨愛寧達的抗藥性時，使用長春花生物鹼類的化療藥物可能是有效緩解愛寧達抗藥性 的方法，並且這方法不會因為 TP53 是否為野生型或突變型而有所影響。更重要的意義是長春 花生物鹼類的化療藥物可以降低 ERK 蛋白激酶被磷酸化，所以會控制抗愛寧達藥物細胞的遷 移和侵襲的能力。這一發現提供了新的認識來克服愛寧達抗藥性引起的肺癌轉移。

4. 主要發現

本研究 具有政策應用參考價值： v 否 □是，建議提供機關_______

(勾選「是」者，請列舉建議可提供施政參考之業務主管機關) 本研究具影響公共利益之重大發現：v 否 □是

附件二

科技部補助專題研究計畫成果彙整表

計畫主持人：

許國堂

MOST 104-2320-B-040-003-

計畫名稱：研究長春鹼化療藥物對愛寧達之抗藥性肺癌細胞所引起的死亡機制

成果項目 量化 單位

質化

（說明：各成果項目請附佐 證資料或細項說明，如期刊 名稱、年份、卷期、起訖頁 數、證號...等）

期刊論文 0 請附期刊資訊。

研討會論文 1 篇 第二十一屆台灣癌症聯合

學術年會壁報論文 B1-020 2016-05-14 to 05-15

專書 本 請附專書資訊。

專書論文 章 請附專書論文資訊。

技術報告 篇

學術性論文

其他 篇

申請中 請附佐證資料，如申請案

發明專利 號。

已獲得 請附佐證資料，如獲證案

號。

專利權

新型/設計專利 商標權

營業秘密

積體電路電路布局權 著作權

品種權 智慧財產權

及成果

其他

件

件數 件

國 內

技術移轉 收入 千元

1. 依「科技部科學技術研 究發展成果歸屬及運用 辦法」第 2 條規定，研 發成果收入係指執行研 究發展之單位因管理及 運用研發成果所獲得之 授權金、權利金、價金、

股權或其他權益。

2. 請註明合約金額。

期刊論文 1

Oncogene, advance online publication, June 6, 2016;

doi:10.1038/onc.2016.195 (IF=7.932 ONCOLOGY R/C=15/213=7.04%).

研討會論文

篇 國

外 學術性論文

附件四

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專書論文 章 請附專書論文資訊。

技術報告 篇

其他 篇

申請中 請附佐證資料，如申請案

發明專利 號。

已獲得 請附佐證資料，如獲證案

號。

專利權

新型/設計專利 商標權

營業秘密

積體電路電路布局權 著作權

品種權 智慧財產權

及成果

其他

件

件數 件

技術移轉 收入 千元

1. 依「科技部科學技術研 究發展成果歸屬及運用 辦法」第 2 條規定，研 發成果收入係指執行研 究發展之單位因管理及 運用研發成果所獲得之 授權金、權利金、價金、

股權或其他權益。

2. 請註明合約金額。

大專生 0

碩士生 1

博士生 1

博士後研究員 1

本國籍

專任助理 1

大專生 0

碩士生 0

博士生 0

博士後研究員 0

參 與 計 畫 人

力 ^非本國籍

專任助理 0

人次

其他成果

(無法以量化表達之成果如辦理學術活動、獲得獎項、

重要國際合作、研究成果國際影響力及其他協助產業 技術發展之具體效益事項等，請以文字敘述填列。)

科技部補助計畫衍生研發成果推廣資料表

日期:2016/08/31

科技部補助計畫

計畫名稱: 研究長春鹼化療藥物對愛寧達之抗藥性肺癌細胞所引起的死亡機制 計畫主持人: 許國堂

計畫編號: 104-2320-B-040-003- 學門領域: 藥理及毒理

無研發成果推廣資料

104年度專題研究計畫成果彙整表

計畫主持人：許國堂 計畫編號：104-2320-B-040-003- 計畫名稱：研究長春鹼化療藥物對愛寧達之抗藥性肺癌細胞所引起的死亡機制

成果項目 量化 單位

質化

（說明：各成果項目請附佐證資料或細 項說明，如期刊名稱、年份、卷期、起 訖頁數、證號...等） 　　　　　　　

國 內

學術性論文

期刊論文 0

研討會論文 1 篇

第二十一屆台灣癌症聯合學術年會 2016-05-14 to 2016-05-15壁報編號B1- 020(愛寧達的肺癌抗藥細胞經由ERK- ZEB1訊息路徑加強其上皮-間質的轉變可 以被長春花生物鹼抑制)

專書 0 本

專書論文 0 章

技術報告 0 篇

其他 0 篇

智慧財產權 及成果

專利權 發明專利 申請中 0

件

已獲得 0

新型/設計專利 0

商標權 0

營業秘密 0

積體電路電路布局權 0

著作權 0

品種權 0

其他 0

技術移轉 件數 0 件

收入 0 千元

國 外

學術性論文

期刊論文 1

篇

Oncogene advance online publication, June 6, 2016;

doi:10.1038/onc.2016.195

研討會論文 0

專書 0 本

專書論文 0 章

技術報告 0 篇

其他 0 篇

智慧財產權 及成果

專利權 發明專利 申請中 0

件

已獲得 0

新型/設計專利 0

商標權 0

營業秘密 0

積體電路電路布局權 0

著作權 0

品種權 0

其他 0

技術移轉 件數 0 件

收入 0 千元

參 與 計 畫 人 力

本國籍

大專生 0

人次

碩士生 1

博士生 1

博士後研究員 1

專任助理 1

非本國籍

大專生 0

碩士生 0

博士生 0

博士後研究員 0

專任助理 0

其他成果

（無法以量化表達之成果如辦理學術活動

、獲得獎項、重要國際合作、研究成果國 際影響力及其他協助產業技術發展之具體 效益事項等，請以文字敘述填列。）　　

無

科技部補助專題研究計畫成果自評表

請就研究內容與原計畫相符程度、達成預期目標情況、研究成果之學術或應用價 值（簡要敘述成果所代表之意義、價值、影響或進一步發展之可能性）、是否適 合在學術期刊發表或申請專利、主要發現（簡要敘述成果是否具有政策應用參考 價值及具影響公共利益之重大發現）或其他有關價值等，作一綜合評估。

1. 請就研究內容與原計畫相符程度、達成預期目標情況作一綜合評估

■達成目標

□未達成目標（請說明，以100字為限）

　　□實驗失敗 　　□因故實驗中斷 　　□其他原因 說明：

2. 研究成果在學術期刊發表或申請專利等情形（請於其他欄註明專利及技轉之證 號、合約、申請及洽談等詳細資訊）

論文：■已發表　□未發表之文稿　□撰寫中　□無 專利：□已獲得　□申請中　■無

技轉：□已技轉　□洽談中　■無 其他：（以200字為限）

Oncogene advance online publication, June 6, 2016;

doi:10.1038/onc.2016.195

3. 請依學術成就、技術創新、社會影響等方面，評估研究成果之學術或應用價值

（簡要敘述成果所代表之意義、價值、影響或進一步發展之可能性，以500字 為限）

我們以前曾經證明愛寧達會利用ERK的訊息路徑來引起肺癌細胞的凋亡，因此 我們認為當經由ERK的訊息路徑無法引起肺癌細胞的凋亡而變成抗愛寧達藥物 的肺癌細胞後，這個ERK的訊息路徑反而會增加肺癌細胞的轉移能力。同時

，我們進一步使用另一類的化療藥敏畢瘤(vinblastine)以及敏克瘤

(vincristine)來有效抑制愛寧達的抗藥性。我們的研究結果可以提供建議在 面臨愛寧達的抗藥性時，使用長春花生物鹼類的化療藥物可能是有效緩解愛寧 達抗藥性的方法，並且這方法不會因為TP53是否為野生型或突變型而有所影響

。更重要的意義是長春花生物鹼類的化療藥物可以降低ERK蛋白激酶被磷酸化

，所以會控制抗愛寧達藥物細胞的遷移和侵襲的能力。

4. 主要發現

本研究具有政策應用參考價值：■否　□是，建議提供機關

（勾選「是」者，請列舉建議可提供施政參考之業務主管機關）

本研究具影響公共利益之重大發現：□否　■是　 說明：（以150字為限）

長春花生物鹼類的化療藥物可以降低ERK蛋白激酶被磷酸化，所以會控制抗愛

寧達藥物細胞的遷移和侵襲的能力。這一發現提供了新的認識來克服愛寧達抗

藥性引起的肺癌轉移。