GQ SDS-Page

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國立中興大學物理系生物物理實驗 95 學年度

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實驗二十 SDS-Page

實驗目的

利用 SDS-Page 分析未知蛋白質溶液中所含蛋白質成分

實驗原理

蛋白質分子所帶的淨電荷,由環境 pH 值所決定,在蛋白質分子結構中,氨基酸上的氨基及酸基個別擁有一帶電基團,然而界定蛋白質分子帶的淨電荷,即由此氨基及酸基的解離所決定,如果當環境 pH 值高過 pI 值時,蛋白質分子帶負電,那當 pH 值大於pI 值則相反;製膠時,上膠的 Stacking gel,pH 值就滴定在 6.8,而下膠的 Separating gel,pH 值則滴定成 8.8,這些 pH 值上的差異性,在電泳過程中扮演非常重要腳色,當 Sample 滴入膠片且加上電場後,Running buffer 中的 Glycine(其 pI=6.8)在 Stacking gel 中為中性不帶電,帶負電的氯離子,因外加電壓而快速向下移動,Glycine 和氯離子之間產生離子空乏區,此區域會被 Sample 取代(形成 band),當 Glycine 緩慢離開 Stacking gel,之前和氯離子形成的離子空乏區瞬時瓦解,而 Sample 也離開 Stacking gel,到達 Separating gel,蛋白質分子開始以其分子量、電荷等因素泳動;

實驗步驟

A.儀器用具

SE260 乾浴機搖擺機電源供應器 4℃冰箱抽風櫃染色盒保鮮盒

B.藥品試劑

Sample

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6X Sample buffer 5X Running buffer

先前製作的 SDS-Page 膠片 Protein Marcker(Low MW Range) Comassie stain solution

Destain I Destaan II

C.方法步驟

1. 將乾浴機開機,設定溫度為 95 度

2. 取 50µl sample 加入 10µl 6X Sample buffer,均勻混合 3. 取 90ml Running buffer 加入 350ml ddH2O,均勻混合 4. 當乾浴機達到 95 度後,將步驟 2 的溶液,乾浴 5 分鐘 5. 把先前準備的 SDS-Page 膠片和 SE260 組合完畢

6. 將步驟 3 的溶液倒入 SE260 中(依照 SE260 使用手冊中所提供的體積為準) 7. 當步驟 4 完成後,取 12~15µl 的溶液和 Protein Marcker(Low MW Range) 注入膠片中的 well

8. 將電源供應器和 SE260 移至 4℃冰箱中 9. 以 40mA,電壓最大,跑 85~95 分鐘

10. 然而沖洗大量清水後,將膠片取下(包括玻璃.鋁片和 spacer) 11. 把搖擺機放入抽風櫃中,同時開啟抽風櫃

12. 膠片放入染色盒中,一起移放置搖擺機上,同時也開啟搖擺機

13. 到入適量的 Comassie stain solution(蓋過膠片為主),等待約 30 分鐘~1 小時 14. 將染色盒中 Comassie stain solution 的倒掉,用清水洗淨染色盒中的殘留 15. 加入 Destin I(蓋過膠片為主),等待 10 分鐘

16. 再加入 Destin I(蓋過膠片為主),等待 10 分鐘 17. 加入 Desting II(蓋過膠片為主),等待 1~2 小時 18. 將染色盒中的 Desting II 倒掉且清洗乾淨

19. 在保鮮盒中加入 8 分滿的 dd H2O,把洗靜的膠片放入保存於 4℃冰箱中

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問題與討論

1. 為何 sample buffer 和 running buffer 都不配置成 1X 的?

2. 染色時為什麼要放在抽風櫃中?

3. 步驟 4 中為何要乾浴 Sample?如果不加熱直接做會有什麼結果?

4. 若電流不是用 40mA,而是過高或過低有什麼情況出現?

參考資料

附錄一

1. 6X Sample buffer: 3.5ml 1M Tris 1g SDS 3.5ml 87% Glycerol

0.6ml 100% β-Mercaptoethanol 0.012g Bromophenol blue

2. 5X Running buffer: 15g Tris 72g Glycine 5g SDS

3. Comassie stain solution: 1.25g Comassie Blue R250 200ml Methanol

140mg Glacial acetic acid 4. Destain I: 200ml 100% Methanol

35ml Acetic acid

5. Destain II: 25ml 100% Methanol 35ml Acetic acid