國立中興大學物理系 生物物理實驗 95 學年度
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實驗二十一 蛋白質電泳膠片製作(For SDS-PAGE)
實驗目的
如何製作 SDS-PAGE 的膠片
實驗原理
一般來說，膠體蛋白質電泳可簡單分為兩類：Native-Page 和 SDS-Page，這 兩者的差異性在於 SDS。因為 SDS 為一種界面活性劑，可以使蛋白質變性，除此之 外還可以將蛋白質表面均勻地變成帶負電荷。然而表面的均勻負電荷會改變「泳動 率」(泳動率=外加電壓 x 分子靜電荷密度÷分子與介質間的摩擦力)，故原本會影響 蛋白質分子的泳動率就只剩下分子量，所以可以利用 SDS-Page 大略估計變性後蛋 白質的分子量。然而%的選擇也極為重要，因為不同%的膠體，對於 SDS-Page 中的 蛋白質溶液會有不同的分離效果，如果選擇錯誤極有可能出現沒有 BAND 或是蛋白 質完全不能通過膠體的情況出現。
實驗步驟
A.儀器用具SE260 的製膠系統(包含玻璃片 x2、鋁片 x2、spacer x4、comb x2 和 gel caster) 錐型瓶
B.藥品試劑 ddH2O
1.5M Tris(pH 8.8) 0.5M Tris(pH 6.8) 30% Acryl/Bis 10% SDS 100% TEMED 10% APS 95% EtOH
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C.方法步驟
1. 先將玻璃片.鋁片.spacer.和 comb 用 95%或 100%的 EtOH 清洗乾淨,接用 無塵紙擦拭乾淨
2. 將製膠台架設完畢,然而滴入 ddH2O 確認膠台是否有架設緊密(以不漏水為 準則)
3. 製作 12% Separating gel(見附錄一)
4. 將 12% Separating gel 注入膠台內,約注入 7~8 分滿 5. 取 300μl 的 95% EtOH(或 100%)滴入膠台內,做壓膠動作 6. 蓋上保鮮膜後等待 30~45 分鐘
7. 用 ddH2O 清洗膠台,確認 EtOH 被洗淨後 8. 將膠台內的 ddH2O 擦乾
9. 製作 4% stacking gel(見附錄一) 10. 將 4% stacking gel 注入膠台內 11. 等待 15~20 分鐘
12. 將 comb 輕輕的拔除後,H2O 清洗膠片
13. 把膠片連同鋁片和玻璃片一起保存在通滿 ddH2O 的環境中
問題與討論
1. 為何玻璃、鋁片、Spacer 和 Comb 要用 95%EtOH 清洗？
2. 如果在注入膠體時產生氣泡要如何解決？氣泡對於往後實驗有何影響？
3. 為何 Separating gel 要注入八分滿，那如果交換腳色換 Stacking gel 有 何影響？
參考資料
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Separating gel (45min) 0.75mm x 2 gels
Final conc. Stock conc. 7.5% 10% 12% 15%
ddH2O ddH2O 7.28ml
(3.64x2)
6.03ml (3.02x2)
5.03ml (2.52x2)
3.53ml
%Acryl/Bis 30%Acryl/Bis
(30%T,2.6%C) 3.75ml 5.00ml 6.00ml
(3.00x2) 7.50ml (3.75x2) 0.375M Tris(pH88.8) 1.5M Tris(pH8.8) 3.75ml 3.75ml 3.75ml 3.75ml 0.1%SDS 10%SDS 150µl 150µl 150µl 150µl 0.05%TEMED 100%TEMED 7.5 µl
0.05%APS 10%APS 75µl
Volume 15.0ml
Stacking gel (15min) 0.75mm x 2gels Final conc. Stock conc 4%
ddH2O ddH2O 2.98ml
%Acryl/Bis 30%Acryl/Bis 0.67ml 0.125M Tris(pH6.8) 0.5M Tris(pH6.8) 1.25ml
0.1%SDS 10%SDS 50µl
0.1%TEMED 100%TEMED 5µl 0.1%APS 10%APS 50µl
Volume 5ml
