將 帶 有 A.flavithermus HY-TTH-D23 rAFGAL 基 因 的 E. coli BL21 (DE3)/pETAFGAL 培養於含 25 µg/mL ampicillin 的 LB 培養基，培養基中 額外添加 0.5% 的葡萄糖以避免菌體啟動子外漏 (promoter leak)。在 37°C、
150 rpm 條件下培養至第 5 個小時至 OD600 值約為 1.5 時，加入 isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (最終濃度為 1 mM) 誘導蛋白表現。自誘 導第 1 小時開始，每隔兩個小時取樣，記錄 OD600 值後以 12,000 xg 離心 將菌體離下後進行破菌。以綠色螢光來判斷蛋白是否順利表現，測吸光值同 時以藍光照相系統記錄其綠色螢光蛋白亮度，並以 ImageJ 軟體測量進行量 化。
(2) α-galactosidase 之純化
首先將菌體以 20 mM imidazole 的 binding buffer 均勻懸浮，加入 1%
Triton X-100 增 加 破 菌 效 率 ， 於 冰 浴 上 利 用 超 音 波 破 碎 機 (ultrasonic processor) 以功率 60 W 與間斷工作模式， 5 sec 停 5 sec 的方式進行破菌 30 min，使得菌液呈現半透明狀後停止。因獲得的酵素粗萃液仍含有大量的 E. coli 雜蛋白存在，而本研究所選殖出的 rAFGAL 為耐熱酵素，於高溫下 並不會變性失活，因此利用熱處理將大多數非目標蛋白質去除。將破菌完的 菌液置於 55°C 水浴熱處理 30 min 使不耐熱的蛋白質聚集沈澱之後以 12,000 xg 於 4°C 下離心 30 min，小心將上清液移至另一離心管即為酵素 粗萃液上清液，留取部份樣本以 native-PAGE 與 SDS-PAGE 蛋白質膠體電 泳進行蛋白質分析。
接著使用 HisTrap HP column 純化蛋白，將管柱連接到蠕動式幫浦，注 入蛋白上清液後循環流洗 12 hr 後，以 15 mL 的 20 mM imidazole binding buffer 將未結合的雜蛋白洗下，之後以不同 imidazole 濃度 elution buffer 沖提，測試多少濃度的 imidazole 可以將目標蛋白完全沖提下來，每 1 mL 收集一管，之後取適量純化樣品，部分以 native-PAGE 蛋白質電泳分析，部 分與 5X sample buffer 混合於 95°C 加熱 5 min 後進行 SDS-PAGE 蛋白質 膠體電泳，觀察蛋白質純化情型。
(3) α-galactosidase 活性分析 (a) 蛋白質濃度偵測
以 Bradford 法測定蛋白質濃度 (Bradford, 1976)。標準品 bovine serum albumin (BSA) 分別稀釋成 0.2、0.4、0.6、0.8 及 1.0 mg/mL 等不 同 濃 度 ， 將 Bradford 試劑 (Bio-Rad, USA) 稀釋 5 倍後，取 1 mL Bradford 試劑 (Bio-Rad, USA) 分別混合 20 µL 標準品與蛋白質溶液後 靜置於室溫中 10 min，再以 OD595 測定反應後的吸光值，所得數值做出 蛋白質定量標準曲線，以此推算出樣品中的蛋白質濃度。
(b) α-galactosidase 活性測定
α-galactosidase 活 性 測 定 是 以 4-nitrophenyl-alpha-D-galactopyranoside (pNPG) 做為酵素的基質，當 pNPG 受 α-galactosidase 催化水解產生 D-galactose 與 p-nitrophenol ，p-nitrophenol 帶有黃色，因 此能夠藉由分光光度計在 OD405 測量其吸光值，以公式推算出酵素活性 值，進而觀察不同條件下酵素活性的表現 (Peter et. al., 1968)。
Units/ml enzyme = A405nm Test - A405nm Blank 3.0 df 18.5 5 0.1 3.0 = 總體積
df = 稀釋倍率 5 = 轉換的時間
18.5 = p-Nitrophenol 在 405 nm 的消光係數
(c) 溫度對酵素穩定度與活性的影響
分別將 rAFGAL 與市售 α-galactosidase 置於不同溫度 (25-80oC) 之 水 浴 槽 ， 每 30 min 自 水 浴 槽 取 出 100 µL rAFGAL 與 市 售 α-galactosidase，加入 700 µL 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5) 與 200 µL 9.9 mM pNPG，放回水浴槽反應 5 min 後以 2 mL 200 mM borate buffer (pH 9.8) 中止反應，以分光光度計測量溶液在 OD405 的吸光值，經 由公式換算即可得知 rAFGAL 在不同溫度下的穩定度。
(d) pH 值對酵素活性的影響
配製不同 pH 值的緩衝液 (pH 4-6: 10 mM citrate phosphate buffer; pH 7-8: 10 mM sodium phosphate buffer; pH 9-10: 10 mM glycine-NaOH buffer)，
加入 100 µL rAFGAL，於 55oC 下預處理 30 min，加入 200 µL 9.9 mM pNPG，在 55oC 下反應 5 min 後以 2 mL 200 mM borate buffer (pH 9.8) 中止反應，以分光光度計測量溶液在 OD348 的吸光值 (避免 pH 值影響 吸光值)，經由公式換算即可得知 pH 值對 rAFGAL 活性的影響。
(e) 金屬離子對酵素活性的影響
配製含 1 mM 金屬離子 (Cu2+、Ca2+、Fe2+、K2+、Mg2+、Mn2+、Na2+、 Ni2+ 與 Zn2+) 的 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5)，加入 100 µL rAFGAL，於 55oC 下預處理 30 min，加入 200 µL 9.9 mM pNPG，在 55oC 下反應 5 min 後加入 2 mL 200 mM borate buffer (pH 9.8) 中止反應，以 分光光度計測量溶液在 OD405 的吸光值經由公式換算即可得知不同金屬 離子對 rAFGAL 活性的影響。。
(f) 其它化學試劑對酵素活性的影響
配製含 1 mM 試劑 (PMSF、DTT、β-Mercaptoethanol 與 EDTA) 的 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5)，加入 100 µL rAFGAL，於 55oC 下預處理 30 min，加入 200 µL 9.9 mM pNPG，在 55oC 下反應 5 min 後 加入 2 mL 200 mM borate buffer (pH 9.8) 中止反應，以分光光度計測量溶
液 在 OD405 的 吸 光 值 ， 經 由 公 式 換 算 即 可 得 知 抑 制 劑 是 否 會 抑 制 rAFGAL 的活性。
(e) 界面活性劑對酵素活性的影響
配製含 1 mM 界面活性劑 (SDS、Tween-80 與 TritonX-100) 的 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5)，加入 100 µL rAFGAL，於 55oC 下 預處理 30 min 後，加入 200 µL 9.9 mM pNPG，在 55oC 下反應 5 min 後加入 2 mL 200 mM borate buffer (pH 9.8) 中止反應，以分光光度計測量 溶液在 OD405 的吸光值，經由公式換算即可得知界面活性劑對 rAFGAL 活性的影響。
三、結果與討論 (一) 菌株分離與鑑定
1. 各菌群生長情形
(1) 高溫菌組 (T 組) 的培養結果
本研究中所有樣品皆在 85oC 下無顯著生長 (表十九)，無法持續繼代 培養，顯示本研究樣點中的高溫菌可能皆屬於嗜熱菌 (thermophile，45 – 80oC)，而並無超嗜熱菌 (hyperthermophile，70 – 120oC) 存在。此外大多數 的綠島朝日溫泉以及金崙溫泉樣品雖然無法在 85 oC 下生長，但是將培養 溫度改為 65 oC 之後就可以觀察到明顯生長，顯示有些樣品中的微生物在 高溫下以休眠的方式抵抗逆境。
(2) 耐熱菌組 (TTH 組) 的培養結果
在高溫循環篩選 (TTH) 的部分，各溫泉所採集的樣本，除彩霞溫泉樣 點 1 與樣點 2 之外，都經過循環溫度培養後仍有菌株存活。所有樣品在培 養溫度 4oC 時皆無明顯生長，顯示 TTH 循環培養中，大多數為嗜熱耐冷 菌 (表二十)。彩霞溫泉樣點 1 在溫度降低至 25oC 之後即無法繼代培養，
顯示彩霞溫泉點 1 與樣點 2 的 TTH 組所培養出的菌株均不耐低溫。綠島 朝日溫泉樣點 2 在 25-35 oC 區間無明顯生長，但溫度升高後即恢復生長，
顯示存在的菌株為耐冷的嗜熱菌，紅葉溫泉樣點 2、樣點 3、樣點 4、樣點 6 與樣點 7 皆有相同的現象。紅葉溫泉樣點 5 僅在 25 oC 下有明顯生長，
顯示存在耐熱耐冷的嗜常溫菌。彩霞溫泉樣點 2 一開始就生長狀況不佳，
顯示其中的菌株對溫度波動較敏感。
(3) 嗜鹽高溫菌組 (HT 組) 的培養結果
整體而言，本研究中的樣點並無微生物可在 25% 以上的 NaCl 濃度 生長，因此為最多為中度耐/嗜鹽 (4.6% - 20% NaCl; Ollivier et al., 1994)。在 各樣點中，綠島朝日溫泉樣點均有一定程度的生長，各樣點最高生長鹽度介
表十九、各樣品之高溫菌組 (T) 培養生長情形 Table 19. Growth of thermophile (T) of samples
Hot spring Strains 55oC 65oC 75oC 85oC
＋ Significant growth: Turbid broth observed.
W Weak growth: Turbidity only detectable with ELISA reader.
－ No growth: No significant increase of optical density (OD).
* No growth but viable: Growth restored when shifted to lower temperature.
表二十、各溫泉耐熱菌組 (TTH) 循環溫度之液態培養 Table 20. Growth of Temperature tolerant-high (TTH) of samples Hot spring Strains 55
oC
＋ Significant growth: Turbid broth observed.
W Weak growth: Turbidity only detectable with ELISA reader.
－ No growth: No significant increase of optical density (OD).
* No growth but viable: Growth restored when shifted to lower temperature.
於 10 - 20% 之間，顯示有相當的嗜鹽高溫菌存在。金崙溫泉的菌株生長鹽 度最高，介於 15-20% 之間，其中金崙樣點 1 為所有樣點中耐鹽程度最高 的，可以在 20% NaCl 下有顯著的生長。紅葉溫泉樣點中的菌株的生長鹽度 較低，且變化較大，由低於 5% 到 15% 皆有。彩霞溫泉的菌株生長鹽度則 十分平均，皆為 15%。柚子湖潮間帶的兩個樣品差異較大，樣點 1 菌株生 長鹽度低於 5%，而樣點二的生長鹽度為 10% (表二十一)。
(4) 嗜鹽常溫菌組 (HM 組) 的培養結果
整體而言，本研究樣點中的常溫微生物嗜/耐鹽程度較高溫組 (HT) 為 高，可以在 25% NaCl 下顯著生長，達到極度耐/嗜鹽 (20% - 30% NaCl;
Ollivier et al., 1994) 程度。其中綠島朝日溫泉樣點的最高生長鹽度較為平均，
介於 20-25% 之間。金崙溫泉除了樣點 3 無法在高於 5% NaCl 下有顯著 生長外，其餘樣品的生長鹽度介於 15-25% 之間。紅葉溫泉各樣點的生長 鹽度則介於 10-25% 之間，彩霞溫泉各樣點最高生長鹽度均為 20%，柚子 湖樣品則為 15% (表二十二)。
(5) 培養結果統整
高溫菌 ( T 組) 培養結果顯示 (圖十五 (A))，各採樣地區均有在 75 oC 下有明顯生長的樣點，除了彩霞溫泉之外，其他採樣地區樣點的生長溫度中 位數皆接近 75oC。高溫循環培養 (TTH 組) 的結果顯示，環境中微生物對 於溫度的適應力相當強，在溫度週期性大幅變化 (55-4oC) 的情況下，大部 分樣點都有微生物存活，只有彩霞溫泉的兩個樣點在培養溫度低於 25oC 後 就沒有微生物繼續生長 (表二十)。嗜鹽高溫 (HT) 與嗜鹽常溫菌 (HM) 的 培養結果顯示 (圖十五 (B) 與圖十五 (C))，整體來說 HT 組菌株耐鹽程度 較 HM 組來的低。而在 HT 組中，微生物耐鹽的能力與採樣區有明顯的關 連，彩霞溫泉與柚子湖樣區的微生物耐鹽程度較低，而綠島朝日溫泉與金崙 溫泉樣區的微生物耐鹽程度較高。
表二十一、各溫泉嗜鹽高溫菌組 (HT) 於液態培養之耐鹽程度 Table 21. Growth of halothermophile (HT) of samples
Hot spring Strains 5%
＋ Significant growth: Turbid broth observed.
W Weak growth: Turbidity only detectable with ELISA reader.
－ No growth: No significant increase of optical density (OD).
表二十二、各溫泉嗜鹽常溫菌組 (HM) 於液態培養之耐鹽程度 Table 22. Growth of halomesophile (HM) of samples
Hot spring Strains 5%
＋ Significant growth: Turbid broth observed.
W Weak growth: Turbidity only detectable with ELISA reader.
－ No growth: No significant increase of optical density (OD).
圖十五、各樣點中微生物有顯著生長的最高溫度/鹽度。
Figure 15. Highest microorganism growth temperature/salinity of samples.
(A) Thermophile at 75oC.
(B) Halothermophile at 55 oC.
(C) Halomesophile at 28 oC.