(1) 新細菌物種的定義
本研究自分離菌株中挑選最耐熱/最耐鹽的分離株來進行菌種鑑定，並 以 16S rRNA 基因序列來作為菌株的初步菌種鑑定依據。由於序列的覆蓋 率 (coverage) 都相當高，因此在菌株的物種判定方面，以序列的相同度 (identity) 做為依據，當與已知種名的序列記錄相同度在 97% 以下，或是最 大相同度高於 97% 但同時與多個不同種的微生物 16S rRNA 序列相同度 相同時，則判定該菌種可能為一新種，需要進一步的鑑定。當分離菌株之 16S rRNA 基因序列與已知種名的序列記錄相同度在 97% 以下，且最高相同度 的記錄同時為多個不同屬微生物的 16S rRNA 序列時，則推斷該分離株可 能為新的屬，並進行進一步的鑑定。
(2) 可能的新細菌物種
在取得分離菌株的 16S rRNA 基因序列資料後，先根據菌株菌落外型、
生化特性 (如耐鹽) 與 16S rRNA 基因序列，刪除重複出現的菌株後共鑑定 出 110 株菌株。其中 T 組 (75 oC) 33 株 (表二十三)、TTH 組 24 株 (表二 十四)、HT 組 20 株 (表二十五) 與 HM 組 33 株 (表二十六)。在本研究 的 110 株分離菌株中，無法推定種名而需要進一步鑑定的菌株共 30 株，
其中有 13 株為可能的新種/屬 (表二十七)，另外的 17 株則是因為屬內種 與種之間的 16S rRNA 序列相似度太高，無法由 16S rRNA 序列推定種名。
在可能的新物種菌株中，分離株 JR-HT3-2 與 YZH-HM2-2 無法推定屬名，
是由於此二菌株的 16S rRNA 基因序列與已知的菌種相同度最高僅為 96%，
且同時與多個屬的菌種相同度接近，無法判定其所屬的物種，需要進行進一 步的鑑定。分離株 HY-TTH-D23 與雖然 16S rRNA 序列可以將其分別歸類 為 Anoxybacillus flavithermus，但其生長與生化特性與 type strain 有顯著差 異，僅先判定其屬名，需要進一步研究是否為新物種。Calditerricola sp. ST-T5-2 則是由於該屬目前僅有兩個種，Calditerricola sp. ST-ST-T5-2 與這兩個種 間 的 16S rRNA 序 列 相 同 度 均 相 同 (99%) ， 無 法 判 定 種 名 。 由 於
表二十三、高溫菌組 (T) 菌株之 16S rRNA 基因序列比對結果 Table 23. Results of 16S rRNA gene sequence search of thermophile (T)
Hot spring Strain Species Query cover Max identity
Jhao-Rih T2-1 Geobacillus toebii 100% 99%
表二十四、各溫泉耐熱菌組 (TTH) 菌株之 16S rRNA 基因序列比對結果 Table 24. Results of 16S rRNA gene sequence search of thermophile (TTH)
Hot spring Strain Species Query cover Max identity
Jhao-Rih TTH 1 Geobacillus sp. 99% 99%
TTH 2-1A Brevibacillus hermoruber 100% 99%
TTH 4-1 Bacillus licheniformis 100% 99%
TTH 4-2 Bacillus licheniformis 100% 99%
TTH 5-1A Bacillus licheniformis 100% 99%
Jing-Lun TTH 2-1 Bacillus thermoamylovorans 100% 99%
TTH 2-2 Bacillus thermoamylovorans 100% 99%
TTH 4 Paenibacillus baregoltzii 100% 99%
TTH 5 Bacillus thermoamylovorans 100% 99%
Hong-Ye TTH 1 Anoxybacillus flavithermus 100% 99%
TTH 2-1 Anoxybacillus sp. 100% 99%
TTH 2-2* Tepidimonas taiwanensis 100% 99%
TTH 2-3 Anoxybacillus flavithermus 100% 99%
You-Zai-Hou TTH 1-1 Paenibacillus baregoltzii 100% 99%
TTH 1-2 Paenibacillus baregoltzii 100% 99%
*Deseased
表二十五、各溫泉嗜鹽高溫菌組 (HT) 菌株之 16S rRNA 基因序列比對結果 Table 25. Results of 16S rRNA gene sequence search of halothermophile (HT)
Hot spring Strain Species Query
cover
表二十六、各溫泉嗜鹽常溫菌組 (HM) 菌株之 16S rRNA 基因序列比對結果 Table 26. Results of 16S rRNA gene sequence search of halomesophile (HM)
Hot spring Strain Species Query
cover
HM 3 Staphylococcus saprophyticus 100% 99% 20%
HM 2-1 Staphylococcus saprophyticus 100% 99% 25%
表二十七、本研究中經由初步鑑定後可能的新細菌物種 Table 27. Plausible novel species/genus of isolates in this study
Hot spring Strain Species Remark
Jhao-Rih T 5-2 Calditerricola sp. Plausible novel species HT 3-2 Sediminibacillus sp. Plausible novel genus
Thalassobacillus sp.
Halobacillus sp.
Anoxybacillus sp.
Virgibacillus sp.
Hong-Ye T 3-2 Thermus sp. Plausible novel species T 3-3 Thermus sp. Plausible novel species T 3-4 Thermus sp. Plausible novel species T 6-1 Thermus sp. Plausible novel species T 6-2 Thermus sp. Plausible novel species T 7-1 Thermus sp. Plausible novel species T 7-2 Thermus sp. Plausible novel species T 7-3 Thermus sp. Plausible novel species TTH 4-3 Anoxybacillus sp. Plausible novel species HY D23 Anoxybacillus sp. Plausible novel species You-Zai-Hou HM 2-2 Ornithinibacillus sp. Plausible novel genus
Virgibacillus sp.
Bacillus sp.
Halobacillus sp.
步 鑑 定 分 析 有 困 難 。 菌 株 Anoxybacillus sp. HY-TTH-4-3 與 已 知 的 Anoxybacillus 物種 16S rRNA 序列相同度最高為 97%，因此列為可能的新 物種。在其餘 9 株可能的新種菌株中，有 8 株為來自紅葉溫泉的 T 組樣 品，皆為 Thermus 屬物種，但由於其 16S rRNA 序列與已知物種的相同度 最高僅為 97%，且同時與多個物種的相同度相同，因此也列為可能的新物 種。
(3) 高溫菌組 (T 組) 的鑑定結果
高溫菌組的菌株種類比較少，主要為 Thermus 與 Geobacillus 屬的菌 種，以及一株 Calditerricola sp.，由朝日、金崙與紅葉溫泉分離出的菌種為 Thermus 與 Geobacillus 屬皆有，然而彩霞溫泉只有 Thermus 屬，而柚子湖 則是只有 Geobacillus 屬的菌種。
(4) 耐熱菌組 (TTH 組) 的鑑定結果
在耐熱菌組的培養結果中分離菌株的種類與樣區之間有顯著的關聯，綠 島 朝 日 溫 泉 主 要 為 Bacillus licheniformis (60%) ， 金 崙 溫 泉 主 要 為 B.
thermoamylovorans (75%)，紅葉溫泉主要為 Anoxybacillus (90%)，彩霞溫泉 與柚子湖地區則皆為 Paenibacillus (100%) (表二十四)。其他出現的物種包 含 Geobacillus ( 朝 日 溫 泉 ) 、 Brevibacillus thermoruber ( 朝 日 溫 泉 ) 、 Tepidimonas taiwanensis (紅葉溫泉)。
(5) 嗜鹽高溫菌組 (HT 組) 的鑑定結果
在嗜鹽高溫菌組的部分，除了 JR-HT3-2 無法推定屬名之外，其餘皆為 Bacillus 屬的菌種 (18/20，90%)，由於 B. licheniformis 與近親物種如 B.
sonorenesis 在生化特性上主要的差異為 B. licheniformis 耐鹽度較高 (> 5%
NaCl)，因此即使大多數的菌株 16S rRNA 序列無法判定種名，除了分離株
(6) 嗜鹽常溫菌組 (HM 組) 的鑑定結果
嗜鹽常溫組的菌種鑑定結果則與其他組顯著不同，菌株的種類明顯較多，
且菌株與樣區的關係較不明顯。其中朝日溫泉的嗜鹽常溫菌株多樣性最高，
7 株分離菌株中至少有 6 個不同的物種 (表二十六)。金崙溫泉與紅葉溫泉 則是以 Bacillus 與 Halomonas 為主，彩霞溫泉則是以 Halomonas 以及 Staphylococcus 為主。柚子湖則與朝日溫泉類似，多樣性較高，4 個分離株 皆不同種，其中兩株分離株為 Marinobacter 屬，與過去研究記錄相符 (陳，
2006)。
(7) 菌株鑑定結果統整
圖十六 (A) 為所有菌株種類的鑑定結果統整，結果顯示本研究的分離 菌株中以 B. licheniformis 為最大宗，達到 22 株，Thermus sp. 次之，共有 11 株。圖十一 (B) 為各屬分離菌株的數量統計，以 Bacillus 屬最多，共有 38 株，Thermus 屬 21 株次之，其次依序是 Anoxybacillus 屬 (15 株)、
Geobacillus 屬 (12 株) 與 Paenibacillus 屬 (8 株)。總計格蘭氏陽性菌佔所 有分離株總數的 71.3%，而產孢格蘭氏陽性菌佔分離株總數的 67.2%。
圖十七為各組的菌株數量統整，高溫菌分離株 (T 組) 多為 Thermus 屬 與 Geobacillus 屬 ( 圖 十 七 (A)) ， 而 TT 組 分 離 株 則 最 大 宗 為 Anoxybacillus 屬 (圖十七 (B))，HT 組菌株則幾乎都是 Bacillus 屬 (圖十七 (C))，HM 組菌株則無明顯的主要菌種 (圖十七 (D))