(一) 研究樣品
經診斷判定無精神疾病或神經退化性疾病的正常人 (20 位) 及 阿茲海默氏症患者 (20 位) 的DNA樣品及 6 組年齡、性別配對的正 常人與阿茲海默氏症患者的淋巴細胞株，由林口長庚紀念醫院神經內 科吳逸如醫師、陳瓊美醫師、徐文俊醫師提供，血液樣品之採集皆經 由本人或是家屬同意。
(二) 淋巴細胞株 (lymphoblastoid cell line) 的培養及保存
6 組年齡、性別配對的正常人與阿茲海默氏症患者的淋巴細胞株 培養於 37℃、含 5% CO2 且濕度良好的培養箱中，培養液為含10%
胎 牛 血 清 、100 U/mL 青 黴 素 (penicillin) 、 100 μg/mL 鏈 黴 素 (streptomycin) 及含有 1% L-glutamine 之 RPMI1640 (Gibco)。每隔 48 ~ 72 小時添加 5 或 10 mL 培養液於培養瓶中，待培養至一定體 積後 (60 mL)，離心 1000 rpm 5 分鐘，去上清液後再更換至新的培 養瓶，繼代培養。冰凍保存細胞時，將細胞以 1000 rpm 5 分鐘離心
收集，去上清液並加入含 12.5% DMSO 的培養液 1 mL，置於冰上 2 小時、-20℃ 2 小時及 -80℃ 隔夜培養，再保存於液態氮中。
(三) 基因組 DNA 的萃取
利用 DNA extraction kit (Stratgene) 萃取基因組 DNA。先取定量 (1×107 個) 淋巴細胞培養液置於 50 mL 離心管中，以 1000 rpm 離 心 5 分鐘，去上清液後加入 1 mL PBS (Phosphate Buffered Saline)，
震盪離心管使細胞重新懸浮，再移入 15 mL 離心管，並以 1000 rpm 離心 5 分鐘，去除上清液，重複以上述步驟再次清洗，待去除上清 液後，加入 2 mL solutionⅡ，震盪使細胞重新懸浮，再加入 10 μL proteinase K，將離心管置於 37℃ 水浴槽作用 16 ~ 72 小時。自水槽 中取出離心管，加入 0.8 mL solutionⅢ，置於冰上作用 5 分鐘，以 3500 rpm 離心 15 分鐘，取上清液至新的 15 mL 離心管，加入 5 μL RNase 於 37℃ 水 浴 槽作用 15 分鐘，再加入 2.5 mL 異丙醇 (isopropanal) 緩慢搖勻，使懸浮液分上下兩層，將含 DNA 的上層懸 浮液轉置於 1.5 mL 微量離心管，以 14000 rpm 離心 1 分鐘使 DNA 沉澱，去除上清液並加入 0.5 mL 75% 酒精清洗，再以 14000 rpm 離心 1 分鐘，去除上清液後置於室溫風乾，再加入適量的 ddH2O 溶解 DNA，利用 OD260 吸光值檢測 DNA 濃度，最後以
ddH2O 稀釋 DNA 濃度為 50 ng/μL，儲存於 4℃ 冰箱備用。
(四) CpG 島甲基化分析
1、搜尋 PPP2R2B 基因啟動子及 5' 端區域的 CpG 島
以線上軟體 CpG Island searcher (http://cpgislands.usc.edu/cpg.aspx) (Takai and Jones, 2003)，分析 PPP2R2B 基因兩個異構型 (Bβ1 和 Bβ2) 的啟動子及 5' 端約 3.0 kb 區域，檢查此兩段區域是否有 CpG 島的存在。
2、Restriction enzyme based-methylation assay (RE-PCR)
利用辨識相同序列 (C↓CGG) 的限制內切酶 HpaII、MspI，針對 CpG 島甲基化作評估，無論辨識序列中的 CpG 上甲基化與否，MspI 均能切割，而 HpaII 則無法有效切割甲基化的辨識序列。實驗組 DNA 樣品分別使用此兩種酵素，而對照組 ( - ) 則以酵素反應緩衝液 處理。
以上述三種實驗處理的 DNA 為模板，利用針對 Bβ1 基因外顯 子 1.1 區域所設計的專一性引子對 (表一)，放大該區域的 DNA 片 段。PCR 的產物以 1.4% 洋菜膠體進行 150 V、20 分鐘電泳，再透 過 Alphalmager 1200 影像系統作相對定量分析，以 MspI 切割為模 板的 PCR 產物作為背景值，將以 HpaII 切割為模板的 PCR 產物
量，及以未添加酵素切割為模板的 PCR 產物量，分別減去背景值 後，計算其比值，以推知該樣品於此區域的甲基化程度。
3、Bisulfite sequencing assay
使用 EZ DNA Methylation-GoldTM Kit (ZYMO) 進行本實驗，其
實驗流程入如下: 取一管 CT Conversion Reagent，加入 900 μL ddH2O、50 μL M-Dissolving Buffer 與 300 μL M-Dilution Buffer，均 勻混合 10 分鐘，形成 CT Conversion Reagent 溶液。取 130 μL CT Conversion Reagent，加入 20 μL DNA 樣本 (濃度為 50 ng/μL )，將 混合液置於 98℃ 10 分鐘後，再移到 64℃ 反應 2.5 小時，反應完 成後加入 600 μL M-Binding Buffer 並均勻混合，以 13000 rpm 快速 離心 30 秒後去除上清液，加入 100 μL M-Wash Buffer 清洗並去除 上清液，再加入 200 μL M-Desulphonation，置於室溫反應 20 分鐘 後，快速離心去除上清液，加入 200 μL M-Wash Buffer 清洗兩次後，
加入 10 μL M-Elution Buffer 後靜置 5 分鐘，以 13000 rpm 快速離 心 1 分鐘收集溶液並保存於 -20℃。使用處理過的 DNA 樣本進行 PCR 反應，PCR 反應所使用的引子對與條件如表一，PCR 產物經 過限制內切酶確認無誤後，委託源資生物科技股份有限公司進行定序 反應。
(五) 組蛋白的修飾分析 1、樣品備製
取定量 (1×107 個) 淋巴細胞置於 50 mL 離心管，加入 5 mL 冰 的 PBS 清洗兩次，去上清液後加入 10 mL 的 PBS 溶液與 270 μL、1% 甲醛 (formaldehyde)，置於 37℃ 培養箱 10 分鐘，cross-link DNA 與 組 蛋 白 。 再 以 內 含 protease inhibitor (1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 µg/ml aprotinin, 1 µg/ml pepstain A) 的 5 mL PBS 清洗兩次，於 4℃、2000 rpm 離心 4 分鐘後移除上清 液，加入含 protease inhibitor 的 400 μL SDS lysis buffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8.1) 於冰上作用 10 分鐘，準備進行超音 波震盪。
使用 MiceosonTM Ultrasonic cell disruptor 進行超音波擊碎 (最 大功率 100 W)。將樣品置於冰上放在超音液探針下，功率 50 ~ 75 W 震盪 30 秒後休息 2 分鐘，以此循環進行 24 次，將 DNA 裁切成 200 ~ 2000 bp。震破之後的細胞，以 4℃、12000 rpm 離心 10 分鐘，
吸取上清液置於新的 2 mL 離心管。
2、染色質免疫沈澱 (chromatin immunoprecipitation)
上清液經 OD260 定量後分成 A、B、C 三管，A 管作為正控制 組，不進行免疫沉澱，先保存於 -20℃ 冰箱，B、C 兩管則進行下
列免疫沉澱反應。B、C 兩管分別加入含 protease inhibitor 的 1600 μL CHIP dilution buffer，再加入 75 μL protein A-agarose / salmon sperm DNA 後，置於 4℃ 冰箱旋轉 1 小時，去除非專一性背景。
以 4℃、2000 rpm 離心 5 分鐘後，取上清液置於新的 2 mL 離心管，
C 管加入 5 μg 抗體 anti dimethyl Histone H3 lysine 9 (代表緊密的染 色質結構) 或 anti acetyl Histone H3 lysine 14 (代表鬆散的染色質結 構) 作為實驗組，不加抗體的 B 管為負控制組，置於 4℃ 冰箱旋轉 16 ~ 24 小時。第二天加入 60 μL protein A-agarose / salmon sperm DNA，置於 4℃ 冰箱旋轉 1 小時。以 4℃、2000 rpm、離心 3 分
鐘 後 去 除 上 清 液 ， 經 緩 衝 溶 液 的 清 洗 沉 澱 物 數 次 後 ， 以 0.1M NaHCO3、1% SDS 的溶液溶離出含 DNA 與蛋白質的免疫複合物。
將 A 管從 -20℃ 冰箱取出，與 B、C 兩管一同加入 8 µl 5 M NaCl，於 65℃ 水浴 4 小時，分開 cross-link 的 DNA 與蛋白質。
每 管 再 加 入 2 μL proteinase K 使 蛋 白 分 解 ， 最 後 使 用 phenol/chloroform 溶液萃取 DNA，並存於 -20℃。
3、聚合酶鏈鎖反應 (Polymerase Chain Reaction)
以 A、B、C 三管的 DNA 溶液為模板，配合針對 Bβ1、Bβ2 啟 動子及 5' 端區域所設計的引子 (表一) 進行 PCR 反應。PCR 的產
物 以 1.4% 洋 菜 膠 體 150 V 、 20 分 鐘 電 泳 電 泳 檢 查 ， 並 利 用 Alphalmager 1200 影像系統作相對定量，以推知染色質結構的鬆緊。
(六) PPP2R2B 基因表現量與阿茲海默氏症的關聯性 1、淋巴細胞株 RNA 的萃取
取 定 量 (1×107 個) 淋 巴 細 胞 置 於 50 mL 離 心 管 中 ， 加 入 TRIZOL 500 μL，置冰上作用 5 分鐘。再加入 100 μL chloroform 搖 勻，於冰上反應 3 分鐘。以 4℃、13000 rpm 離心 15 分鐘，吸取 上清液 600 μL 至 1.5 mL 離心管。加入 480 ~ 600 μL 異丙醇，置於 -20℃、1 小時。4℃、13000 rpm 離心 15 分鐘，去除上清液，以 1 mL 75% 酒精 (in DEPC-ddH2O) 清洗沉澱物，4℃、13000 rpm 離心 5 分鐘後去除上清液並風乾。加入適量的 DEPC-ddH2O 溶解 RNA，
利用 OD260 吸光值檢測 RNA 濃度，並以 0.8% 洋菜膠體 120 V、
40 分鐘電泳檢視，存於 -80℃ 冰箱備用。
2、cDNA 的製備
取 6.25 μg RNA 加入 0.5 μL Rnase-free DNase，加 ddH2O 補至 總體積 25 μL，置於 37℃ 反應 30 分鐘，再置於 65℃、15 分鐘終 止反應。接著利用 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) 進行反轉錄作用，反應條件如下: 取 2 μg 的
RNA 溶於總體積為 20 μL 的反應溶液，置於 25℃ 反應 10 分鐘，
再以 37℃ 作用 120 分鐘，最後 85℃、5 秒以終止反應，並將 cDNA 產物存於 -20℃。
3、即時定量 PCR (Real-time PCR)