伍、討論

一、阿茲海默氏症的外遺傳研究

(一) Bβ1 啟動子區域 DNA 甲基化程度

本研究以 RE-PCR 分析 20 個正常人與 20 個阿滋海默氏症患

者，Bβ1 5' 端區域在個別樣品間的甲基化程度差異很大，正常人族群 中甲基化程度範圍為 0 ~ 46%，阿滋海默氏症患者則為 0 ~ 59%。整 體而言，阿滋海默氏症患者 DNA 甲基化程度較正常人稍高，但兩群 樣品間未達顯著差異 (圖三)。另一方面，六組經過年齡與性別配對

的淋巴細胞株中，第二、第四組配對之阿茲海默氏症患者甲基化程度 高於正常人，但第五組則相反，第一、第六組配對則無顯著差異 (圖 四)。此結果顯示 Bβ1 5' 端區域甲基化不一定和阿茲海默氏症相關。

Silva 等人研究 SIRT3、 SMARCA5、HTERT、CDH1 基因啟動子甲 基化的結果顯示，與端粒、免疫反應相關的基因 HTERT，其啟動子

區域甲基化程度，阿滋海默氏症患者明顯較正常人族群高，而其他三 個基因則無顯著差異 (Silva et al., 2008)。本研究探討的 PPP2R2B，

為腦專一性表現，於淋巴球中表現甚低，此組織特異性可能無法呈現 顯著的甲基化差異。其次，本研究的樣品數量過少，也可能降低兩群

間 甲 基 化 程 度 差 異 在 統 計 上 的 意 義 。 再 者 ， 本 實 驗 使 用 傳 統 的 RE-PCR 檢測，僅能分析少數 Hpa II 與 Msp I 辨認序列上的甲基化 之情形，故後來採用 Bisulfite sequencing 檢測法，以 sodium bisulfite 將未甲基化的 C 鹼基轉換成 U，而甲基化的 C 則不變，進行 PCR 反應後將產物做定序，來一一分析此 5' 端區域內每一個 CG 的甲基 化程度，結果顯示阿茲海默氏症患者的甲基化程度較正常人高 (圖 七)。但定序結果亦顯示 RE-PCR 限制酶所辨認的三個 CCGG 中，

只有第二個辨認位置有甲基化的情形 (圖五、六 B)，其餘兩個位置皆 無甲基化的情形 (圖五、六 A、E)。由於無甲基化的 CCGG 會被 HpaII 辨認、切割，故 PCR 後應無產物，與圖三、圖四的實驗結果

不合。故 RE-PCR 所觀察到的差異可能為酵素切割不完全，造成誤 判甲基化的情形，故 bisulfite sequencing assay 所得結果較能代表該 樣本的甲基化程度。

(二) PPP2R2B 啟動子區域的染色質結構

染色質可藉不同組蛋白修飾改變其結構，調控基因的轉錄與表 現，組蛋白 H3 的第九、第十四個胺基酸-離胺酸之乙醯化與基因轉 錄活化有關；而組蛋白 H3 的第九胺基酸-離胺酸發的甲基化修飾，

則與抑制轉錄作用相關 (Yan and Boyd, 2006)。先前 Greene 等人於

單一基因突變的富來德瑞克氏共濟失調症 (Friedreich ataxia，簡稱 FRDA) 的研究中，以 CHIP 的技術分析 frataxin (FXN) 基因的染色 質結構與其表現的關聯，結果顯示 FRDA 的患者於 FXN 基因的啟 動子區域有較高的 dimethyl H3-K9，同時患者的 FXN mRNA 表現量 亦有下降的情形 (Greene et al., 2007)。本研究使用 CHIP-PCR 分析 與 Bβ1 與 Bβ2 啟動子區域結合之組蛋白的修飾，進而推測基因轉 錄作用的活化與抑制。本研究於三個配對的淋巴細胞株中，比較 Bβ1 啟動子區域上 dimethyl H3-K9 的比例，雖然有兩組顯示阿茲海默氏 症患者 dimethyl H3-K9 修飾較正常人高，顯示 dimethyl H3-K9 修飾 可能影響 Bβ1 啟動子區域的染色質結構，導致阿茲海默氏症的發 生，但另一組配對則相反。而 dimethyl H3-K9 與 Bβ2 啟動子區域、

acetyl H3-K14 與 Bβ1

、

的複雜度差異很大，可能造成結果的差異。另一可能造成差異的因素 為偵測 PCR 產物的方法，本研究從電泳膠體圖上定 PCR 產物的

量，此定量方式由於沒有可供參照的控制組，所以無法排除人為操作 的誤差，而 Greene 等人使用 real-time PCR 的技術定 FXN DNA (經 染色質免疫沈澱)，可降低人為操作的誤差，故後續研究的方向可使

用此技術。

(三) PPP2R2B mRNA 的表現量

本研究以淋巴細胞株為材料，使用 real-time PCR 技術比較阿茲 海默氏症患者與正常人 PPP2R2B mRNA 表現量，但由於淋巴細胞株 中的 PPP2R2B mRNA 含量太低而無法有效比較 (圖九)。PPP2R2B

為腦特異性表現基因，因此推測在其他組織或細胞株中的表現量不 高。Schild 等人研究指出，人類胚胎腎細胞株 (Human embryonic kidney HEK293) 和人類神經瘤細胞株 (SH-SY5Y) 中，PR55α、PR55β (PPP2R2B)、PR55γ、PR55δ 等四種 B 次單位的 mRNA 表現量不同，

SH-SY5Y 中 PR55α 表現量最高而 PR55β (PPP2R2B) mRNA 之含 量最低，而 HEK293 細胞株中則無法偵測到 PPP2R2B 的 mRNA

的 存 在 (Schild et al., 2006) ， 顯 示 非 腦 部 組 織 的 其 他 細 胞 株 中 PPP2R2B 的 mRNA 表現量甚低，此結果與本研究數據相符。

(四) DNA 甲基化、組蛋白修飾與基因表現

DNA 甲基化會與甲基化結合蛋白結合，進而吸引組蛋白去乙醯 酶前來，促使組蛋白發生去乙醯化，形成較緊密的染色質結構，阻礙

轉錄因子與啟動上轉錄活化位的結合，使轉錄作用無法執行，而降低 基因的表現。Al-Mahdawi 等人針對基因表現的機轉，提出另一個看 法，組蛋白 H3K9 發生去乙醯化而導致組蛋白 H3K9 甲基化，吸引 heterochromatin protein 1 (HP1)、組蛋白去乙醯酶與 DNA 甲基轉移 酶，而造成 DNA 甲基化，進而關閉基因轉錄作用 (Al-Mahdawi et al., 2008)。組蛋白的修飾並非一定伴隨 DNA 的甲基化，fragile X mental retardation 1 (FMR1) 基因啟動子區域缺乏甲基化，但仍發生組蛋白

去乙醯化與組蛋白 H3K9 甲基化，雖然此狀況並不影響 FMR1 的基 因轉錄調節 (Pietrobono et al., 2005)。綜合上述的結果，DNA 甲基化 與組蛋白修飾間並非完全連結，此兩者調節基因表現的機制可能是獨 立的。而本研究的結果顯示 Bβ1 5' 端區域的甲基化程度 (圖七) 與組 蛋白的修飾 (圖八) 亦無明顯關聯。

二、 Bβ1 基因啟動子多型性與阿茲海默氏症、血管性失智症 感受性的相關性

本研究分析 Bβ1 啟動子區域上六個多型性位點，無論是在多型 性基因型 (表六) 或等位基因 (表七) 頻率分佈層面，都未發現任一 多型性位點與阿茲海默氏症或血管性失智症之感受性有相關 (P >

0.05)。進一步的多型性位單套型分析結果 (表八)，亦顯示並無特定

單套型與阿茲海默氏症與血管性失智症相關，即此六點之單套型頻率 對疾病的發生無太大影響。

Bβ1 啟動子之六個多型性位點的哈溫平衡檢測，除多型性位點 -2737，其餘五點皆符合哈溫定律 (表四)，顯示取樣的正常人為自由

婚配、配子亦可隨機結合，且不因突變、遷徙或天擇等演化動力而影 響基因頻率的分佈。而多型性位點 -2737 不符合哈溫平衡，造成此結 果的因素不明。