(一) CpG 島甲基化分析
使用線上軟體 CpG Island searcher，分析 PPP2R2B 基因兩個異 構型 Bβ1、Bβ2 的啟動子及 5' 端約 3 kb 區域，圖二(A) 顯示 Bβ1 具有兩個 CpG 島，Bβ2 則無，故選擇 Bβ1 的 5' 端區域進行 DNA 甲基化的研究。
(二) Restriction enzyme based-methylation assay
利用 (C↓CGG) 的限制內切酶 HpaII、MspI，針對 20 位正常人 及 20 位阿茲海默氏症患者的血液 DNA 樣品 (圖三)，及 6 組年齡 與性別配對的正常人與阿茲海默氏症患者的淋巴細胞株 DNA 樣品 (圖四)，進行 CpG 島甲基化作評估。各 DNA 樣品均以三種條件處 理：未經過酵素切割、HpaII 切割、MspI 切割。如圖三(A)、圖四(A) 所示，未經過酵素切割者有一明顯的 DNA 色帶 (lane -)；由於辨識 序列 C↓CGG 無論甲基化與否，均能被 MspI 切割，經 MspI 切割 後 DNA 而呈 smearing 現象 (lane M)；而 HpaII 僅能切割未甲基化
的辨識序列 C↓CGG，故經 HpaII 切割後的 DNA 片段明顯大於 MspI 切割者 (lane H)。
以上述三種實驗條件處理後之基因組 DNA 作為模版，利用辨認 Bβ1 5' 端區域之專一性引子對進行 PCR 反應，結果顯示於圖三 (B)、圖四(B)。未經過酵素切割的正控制組模板，於 358 bp 的位置 有一明顯的 PCR 產物 (lane -)，MspI 切割後的負控制組模板則無 (lane M)，而以 HpaII 切割後的實驗組模板，則依此區域 CCGG 序 列上的甲基化程度，而增幅出不同強度的 PCR 產物 (lane H)，甲基 化程度越高，則此段 DNA 因不易被 HpaII 裁切，而得以形成較強 的 PCR 產物；反之，若甲基化程度低，則 PCR 產物不明顯或無 PCR 產物。Bβ1 啟動子上游 -1974 ~ -1824 區域，因缺乏 CCGG 序 列，故三種實驗條件處理後之基因組 DNA 模板，均能增幅出 151 bp 大小的 PCR 產物，作為內生性控制組 (internal control)。
進一步利用 Alphalmager 1200 影像系統，比較 20 位正常人和 20 位阿茲海默氏症患者血液基因組 DNA 的甲基化程度。如圖三 C
所示，個別樣品間的甲基化程度差異很大，然阿茲海默氏症患者的平 均甲基化程度稍高於正常人，但兩群間的差異未達顯著水準 (圖三 D，P > 0.05)。圖四 C 顯示各組年齡與性別配對的淋巴細胞 DNA 甲 基化程度，個別樣品間的甲基化程度差異很大，其中第二、第四組阿
茲海默氏症的患者甲基化程度明顯高於正常人，但第五組則相反。兩 群樣品間之平均甲基化程度，阿茲海默氏症患者稍高於正常人，但差 異未達顯著水準(圖四 D，P > 0.05)。
(三) Bisulfite sequencing assay
利用 EZ DNA Methylation-GoldTM Kit 處理淋巴球 DNA，使 DNA 序列上的 C 鹼基轉變為 T 鹼基，然 CpG 上的 C 鹼基若發
生甲基化，則不被轉變為 T 鹼基而維持 C 鹼基，藉由定序比較 DNA 序列上 T 鹼基與 C 鹼基的訊號強弱，可推知該樣本的甲基化
程度。圖五為第五組正常人的定序結果，包括 RE-PCR 所辨認的三 個 CCGG 在內，序列上大部分的 C 鹼基皆被轉變成 T，但第 8 個 CpG 則有少部分維持 CG。圖六為第三組阿茲海默氏症患者的定序
結果，顯示第1、2、4 個 C 鹼基被甲基化而維持不變，但 RE-PCR 所辨認的另外兩個 CCGG 皆被轉換成 TTGG。此二個 CCGG 序列 於所檢測的 12 個樣品皆無甲基化情形。圖七為 6 組配對的阿茲海 默氏症患 (P1 ~ P6) 與正常人 (N1 ~ N6) 淋巴細胞株之甲基化程度 量化圖。結果顯示正常人的 CpG 大多無甲基化，只有部分的樣本有 零星的甲基化，且甲基化程度大多低於 50%，阿茲海默氏症的患者 則富含甲基化的 CpG，且甲基化程度大多高於 50%，即阿茲海默氏
症的患者 Bβ1 序列上該區域的甲基化程度明顯高於正常人。
(四) Chromatin immunoprecipitation (CHIP)
為了分析 Bβ1 與 Bβ2 啟動子區域的染色質結構，使用 CHIP 技術檢測此二異構型啟動子區域上組蛋白修飾的情形。如圖八(A)、
(D) 所示，與未受超音波震盪處理相較 (lane -)，經過超音波震盪後，
DNA 被震碎成小片段呈 smearing 現象 (lane +)。超音波處理後將樣 品分成 A (未進行免疫沈澱，作為正控制組)、B (不加抗體但進行免 疫沈澱，作為負控制組)、C (加抗體進行免疫沈澱，作為實驗組) 三 組，免疫沉澱反應的抗體包括辨認 dimethyl Histone H3 lysine 9 及辨 認 acetyl Histone H3 lysine 14 的抗體。dimethyl Histone H3 lysine 9
的組蛋白修飾代表染色質結構緊密、低基因轉錄活性，而 acetyl Histone H3 lysine 14 的組蛋白修飾則代表染色質結構鬆散，利於基因 轉錄作用。如圖八(B) (E) 所示，兩種抗體免疫沉澱的 DNA 模板，
PCR 增幅後皆於所檢測的三個配對樣品偵測到代表 Bβ1 的 358 bp 片段與代表 Bβ2 的 301 bp 片段。利用 Alphalmager 1200 影像系統 定量後，得到各 AD/NC 配對的比值，顯示於圖八(C) (F)。三個配對 的淋巴細胞株中，第 2、第 5 個配對的 Methyl-H3 比值大於 1，顯 示此兩個阿茲海默氏症患者的 Bβ1 5' 端區域上，dimethyl H3-K9 的
比例較配對的正常人高，然第 4 個配對的 Methyl-H3 ratio 則小於 1，顯示該配對的阿茲海默氏症患者的 Bβ1 5' 端區域上，dimethyl H3-K9 比 例 較 配 對 的 正 常 人 低 。 Bβ2 啟 動 子 區 域 的 Methyl-H3 ratio、Bβ1 與 Bβ2 啟動子區域的 Acetyl-H3 ratio，於三個配對的細
胞株中則無明顯差異，顯示這些區域上的修飾組蛋白比例於三個配對 中並無太大區別。
(五) PPP2R2B 基因表現量與阿茲海默氏症的關聯性
使用 Real-time PCR-Taqman 的系統，檢測上述 6 個配對的阿茲 海默氏症患者與正常人淋巴細胞中 PPP2R2B RNA 的表現量，結果 顯示於圖九。由於所檢測到的 CT 值多數超過 35， 代表樣品 RNA
濃度太低，實驗誤差相對提高，無法作為可信數據，故無法使用此數 據做更進一步的分析。