三點金草之抗小鼠急性肝損傷實驗

本實驗採用之動物購於國立台灣大學醫學院實驗動物中心，ICR 系雄性小鼠，體重約22-25公克。飼養於溫度控制在23 ± 1 ℃的空調飼 養室，採12小時亮12小時暗(08:00燈亮，20:00燈暗)的燈光控制系統，

食物與飲水之供應不予限制。實驗動物依中華民國實驗動物學會出版 之實驗動飼養與管理指南之規定管理與照顧。

二、主要化學試劑

福馬林(formalin)購自日本試藥株式會社。Carbon tetrachloride, silymarin, carboxymethyl cellulose (CMC), sodium phosphate 購 自 Sigma-Aldrich 公 司 。 Ethyl ether, olive oil 購 自 Wako 公 司 。 sGOT (glutamate oxaloacetate transaminase) 、 sGPT (glutamate pyruvate transaminase)、TP (total protein)等kits購自羅氏公司(UK)。

三、主要實驗儀器

1.全自動生化分析儀 (Cobas Mira plus, Roche, Switzerland) 2.組織均質機 (K54,Glas-col, USA)

3.高速冷凍離心機 (Z233 MK-2, Hermle, Germany) 4.電子計數秤 (HILAYOKA, Japan)

四、實驗方法

一、四氯化碳(CCl4)誘發急性肝炎

本實驗保肝模式採用 CCl4 誘導小鼠急性肝炎^(74,75)，操作方式如 下：小鼠預養 7 天後，隨機將小鼠分為 4 組 (正常組、CCl4 組、

Silymarin 組、MDT 1.0 g/kg)，每組 8 隻，實驗時正常組與 CCl4組口 服投與 0.5 % CMC， Silymarin 組及 MDT 組分別口服給予 Silymarin (200 mg/kg in 0.5 % CMC)及 MDT (1.0 g/kg in 0.5 % CMC)，連續 5 天。

最後一天給藥後1 小時，正常組腹腔注射 olive oil，其他各組腹腔注 射CCl4 (1 ml/kg in olive oil, 2 %)。

在CCl4注射後24 小時，動物以乙醚麻醉後，由頸動脈採血，全 血離心 (3,000 rpm, 10 min, 4 ℃)，分離血清，取上清液，使用全自動 生化分析儀分別測定GOT、GPT 活性。

二、肝功能血清生化指數之檢測^(74,75)

小鼠血液樣品在室溫下放置1小時以使其凝結。再以冷凍離心機 於4 ℃下、每分鐘3,000 rpm、離心5分鐘，分離血清，再以自動生化 分析儀檢測肝功能生化指數。

1.血清中麩氨酸草乙酸轉氨酶(GOT)之測定

以Randox kit分析。取1mL反應試劑(100 mM Tris buffer，500 mM L-asparate，15 M α-ketoglutarate，0.18 mM NADH，1,200 U LDH，500 U MDH/1,000 mL)，加入200 μl血清，混合均勻37 ℃下反應1分鐘，靜 置90秒後，於波長340 nm下，以自動生化分析儀檢測。

測定原理：試驗樣品和受質-酵素混合物作出反應，經由在樣品中的 AST催化，L-asparate＋α-ketoglutarate形成oxaloacetate＋L-glutamate 產生oxaloacetate，藉蘋果酸脫氫(MDH)轉成蘋果酸(malate)，同時 NADH被氧化成NAD，測NADH的減少量就能計算出GOT的活性值。

L-asparate＋α-ketoglutarate → oxaloacetate＋L-glutamate oxaloacetate＋malate dehydrogenase → L-malate＋NAD^＋

2.血清中麩氨酸丙氨基轉氨酶(GPT)之測定

以Randox kit分析。取1 mL反應試劑(100 mM Tris buffer，500 mM L-alanine，15 M α-ketoglutarate，0.18 mM NADH，1,200U LDH，500U MDH/1,000mL)，加入200 μl血清混合均勻，於37 ℃下反應1分鐘，靜 置90秒後，於波長340 nm下，以自動生化分析儀檢測。

測定原理：試驗樣品和受質-酵素混合物作出反應，經由在樣品中的

pyruvate藉乳酸脫氫酶(LDH)轉成乳酸(lactate)，同時NADH被氧化成 NAD^＋，測NADH的減少量就能計算出GPT的活性值。

L-alanine＋α-ketoglutarate → pyruvate＋L-glutamate pyruvate＋Lactate dehydrogenase → L-lactate＋NAD^＋

3.肝組織中總蛋白之測定(TP)

取肝組織0.5 g，加入0.5 mL 的normal saline均質，取肝均漿50 μl，

加入350 μl的normal saline 混和均勻，加入Biuret reagent（sodium hydroxide 100mM、Na-K-tartrate 16 mM、potassium iodide 15 mM、

cupric sulphate 6 mM）使反應變化呈增色反應，波長550 nm條件下測 量吸光值，每隔25秒測量一次吸光值變化，於反應第15分鐘達反應終 點，以人血清為protein standard，濃度（6.0 g/dL）產生吸光值變化扣 除blank reagent（Sodium hydroxide 100 mM、Na-K-tartrate 16 mM）之 吸光度差，換算出轉換係數（F），進而換算出肝組織total protein之 濃度，肝組織total protein以mg/g tissue表示⁽⁶⁹⁾。

第五節 三點金草對Hep G2及PC-3細胞毒殺試驗^(76,77)