討論

在HPLC 指紋圖譜分析結果中發現，三點金草甲醇萃取物、乙酸 乙酯層及正丁醇層皆含有具抗發炎化合物vitexin。在三點金草甲醇萃 取物指紋圖譜分析中，標定其黃酮類化合物apigenin 及 genistin。

一般中草藥在進行藥理實驗前，須評估其急性毒性，而三點金草 之口服急性毒性試驗，經口服10 g/kg (換算原藥材約 71.4 g/ kg)後觀 察一週其活動力及精神狀況，並未發現實驗動物死亡，三點金草在民 間使用上還未聽聞中毒之情形由；在 1972 年 Ghosal 將三點草生物鹼 萃取分層，以小鼠腹腔注射投藥進行急性毒性試驗，發現其 LD50為 215.5 mg/kg⁽⁴²⁾ (換算原藥材約 2155 g/ kg)，但對其用藥安全上尚待進 一步探討，如肝、腎功能及慢性毒性試驗的評估，以確保其在民間用 藥安全的保障。

疼痛反應之評估可分為電刺激法、熱刺激法、化學（醋酸扭體及 福馬林舔足）及機械刺激反應^(76,77)。本研究利用之疼痛反應用模式為 化學刺激之醋酸扭體及福馬林舔足反應試驗。醋酸扭體反應試驗於 1957年由Siegmund等人⁽⁷⁸⁾提出應用於評估疼痛反應，其評估方式為實 驗動物經由腹腔注射化學物質醋酸，對實驗動物腹部直接刺激所引發 急性腹膜炎而產生疼痛，並經由觀察實驗動物其腹部內縮、後腿伸直、

身體拉長扭曲之現象。鴉片類與內胜肽類等神經鎮痛物質及固醇類和

非固醇類周邊性鎮痛抗炎物質，皆可抑制醋酸扭體反應^(79,80)，因為實 驗操作方便，所以醋酸扭體試驗常被用於篩選具有鎮痛作用之中草藥

(12,48)及藥物^(88,89)。醋酸扭體試驗誘發疼痛之作用機轉，因醋酸使細胞

膜磷脂質損傷，產生花生四烯酸(arachidonic acid)，再經由環氧化酶 (cyclooxygenase)氧化促使前列腺素(prostaglandin)合成，而前列腺素中 的PGE2及PGF2α則與疼痛有關⁽⁹⁰⁾。研究結果顯示，口服三點金草甲 醇萃取物(0.5及1.0 g/kg)及腹腔注射indomethacin(10 mg/kg)，具有鎮痛 之作用，均可明顯減少由醋酸所引起疼痛之扭體次數，其鎮痛之作用 機轉可能與抑制花生四烯酸有關⁽⁸⁶⁾。由於醋酸扭體試驗之疼痛機轉包 含周邊及中樞作用，因而無法確認其作用機轉是經由中樞或周邊而來，

所以必須進一步以福馬林舔足試驗進行研究，以確認其真正的鎮痛作 用機轉。

福馬林舔足試驗於1977年由Dubuisson和Dennis提出⁽⁹¹⁾，此實驗方 法利用福馬林對組織造成損傷而產生疼痛，是目前仍常被用來篩選鎮 痛藥物的實驗模式之一。於1987年Hunskaar 等人研究指出福馬林試 驗為一有效模式，可用於篩選鎮痛藥物，是否對發炎性和非發炎性疼 痛具有鎮痛作用⁽⁹²⁾。於1989年Shibata等人經由福馬林舔足實驗模式研 究發現⁽⁹³⁾，福馬林誘發實驗動物之舔蹠行為呈雙向(biphasic response)

分鐘會造成初期疼痛（initial pain）反應而引起實驗動物舔足，稱之 為前期(early phase)，主要因直接刺激痛覺接受體造成substance P 或 bradykinin等致痛物質的釋放；而在進入20～30分鐘實驗動物所舔足 時間稱之為後期（late phase），而後期主要是因為福馬林引起發炎反 應造成化學傳遞物質，例如：histamine, serotonin, prostaglandin及kinin 等物質是由受損組織細胞中釋出，而引起及脊髓背腳功能性改變^(93,94)。 前期為非發炎性疼痛，後期則為發炎性疼痛，福馬林0.5-10 % 濃度 皆可誘導出前期及後期舔足反應，而5 %福馬林濃度可誘導最大前期 和後期舔足反應⁽⁹⁵⁾。因此本研究以5 %福馬林誘導實驗動物產生疼痛 反應，實驗結果發現三點金草甲醇萃取物對減少小鼠福馬林誘發前期 之舔足反應時間沒有明顯影響。但可明顯減少小鼠福馬林誘發後期之 舔足反應時間。顯示其對發炎性疼痛有明顯鎮痛作用，對非發炎性疼 痛無明顯作用。麻醉性鎮痛劑如morphine對前期及後期都有抑制作用，

但NSAID只對後期有抑制作用^(93,96)。

在篩選抗發炎藥物的實驗方法中，常注射致發炎劑後能產生抑制 浮腫之作用來評估效價，最常使用之致發炎物質包括：λ-角叉菜膠

（λ-carrageenan）、組織胺(histamine)、右旋醣苷（dextrose）、白蛋 白（albumin）、酵母（yeast）等，其中以 λ-角叉菜膠為最廣泛被使 用之動物實驗模式之一，因為 λ-角叉菜膠為局部致發炎劑與免疫反應

無關，在誘導劑量下再現性高且無全身作用⁽⁵⁰⁾。目前常被應用於篩選 抗發炎中草藥，以及研究發炎反應與自由基之關係^（97）。

研究結果發現，口服給予三點金草甲醇萃取物(0.5 g/kg 及 1 g/kg) 可明顯降低λ-carrageenan 誘導的急性足蹠浮腫，顯示三點金草具有抗 炎作用。然而足蹠注射λ-carrageenan 所引起的浮腫是雙向性反應^（98）， 足蹠注射λ-carrageenan 後在不同時期會釋放出不同物質而引起發炎，

前期在誘導後約1 小時會釋出 histamine、serotonin、platelet activating factor 等物質，使結構形一氧化氮合成酶(cNOS)活化，使一氧化氮增 加引起脂質過氧化⁽⁹⁹⁾；中期約從 1-2.5 小時，kinin 類物質會釋出，讓 受到損傷的組織血管通透性增加，使血液中的多型白血球聚集形成浸 潤現象，促使自由基的生成，引起脂質過氧化；2.5 小時之後為後期，

前列腺素(prostaglandin)、白細胞介素(leukotriens)及一氧化氮 NO 和自 由基會被釋放出來，其中白細胞介素與腫瘤壞死因子，會刺激誘導型 一氧化氮合成酶(iNOS)產生一氧化氮 NO，NO 會和 O2^－•作用，形成 ONOO^－、OH•和 ONOO^－攻擊細胞膜脂質導致細胞損傷^(99,100)，此時環 氧 化 酶-2(COX-2) 也 會 受 到 cytokine 活 化 而 產 生 前 列 腺 素 。 而 λ-carrageenan 會活化巨噬細胞釋放出大量的超氧陰離子自由基(O2^－•)，

而O2^－•會經由超氧歧化酵素(SOD)作用產生 H2O2，H2O2會被catalase

(86)

然而自由基中之活性氧(reactive oxygen species,ROS)例如：O2^－•、

H2O2、OH•、ONOO^－，則是急性發炎反應中重要介質⁽¹⁰¹⁾，發炎反應 產生後1-6 小時間，發炎組織中的活性氧自由基則會明顯產生。研究 報告指出注射λ-carrageenan 三小時後，足蹠水腫反應會達到最大，而 藥物的抗發炎作用在此時也會產生⁽¹⁰²⁾。因此，發炎反應產生時，若 能降低活性氧的含量，即可對發炎反應產生抑制作用。本實驗於注射 λ-carrageenan 後 3 小時將老鼠犧牲，並取其肝組織，測定肝臟中抗氧 化酵素的活性。結果顯示，三點金草甲醇萃物對肝臟中SOD、GSH-Rd 活性均具增強作用。可能藉由提升肝臟中抗氧化酵素的活性，使清除 自由基的能力提升，而具有抗發炎的作用。

本研究測定足蹠組織中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量，而 丙二醛為脂質過氧化物最終產物之一，組織中丙二醛含量愈高，表示 脂質過氧化程度愈高。因此所測得之丙二醛(MDA)含量多寡，與體內 脂質過氧化作用程度有關⁽¹⁰³⁾；腹腔注射 indomethacin 會降低小鼠足 蹠組織中丙二醛(MDA)的濃度⁽¹⁰²⁾和且有清除O2^－•、OH•、ONOO^－和 NO 的能力⁽¹⁰⁴⁾，因此推論 indomethacin 能減少組織中丙二醛(MDA) 形成，應該與清除過多的活性氧自由基有關。實驗結果顯示，口服給 予三點金草甲醇萃取物及腹腔注射 indomethacin (10mg/kg)，不僅會 減少小鼠足蹠組織中丙二醛(MDA)的含量，同時也會增加肝臟中抗氧

化酵素的含量，因此推論小鼠足蹠組織中丙二醛(MDA)含量減少，可 能是經由提升肝臟及血液中抗氧化酵素的含量有關。

本研究測定足蹠組織中 NO 含量，且 NO 能促使 COX 活性增加 而合成prostaglandin⁽¹⁰⁵⁾。實驗結果顯示，腹腔注射indomethacin 會減 少小鼠足蹠中NO 的含量。而口服給予三點金草甲醇萃取物，也會減 少小鼠足蹠NO 的含量，因此三點金草甲醇萃取物會抑制發炎反應可 能與抑制發炎組織中NO 的生成有關。

由實驗小鼠的足蹠組織分析中，我們發現λ-carrageenan 能使足蹠 組織中的IL-1β、TNF-α、NO 及 MDA 濃度升高，而三點金草甲醇萃 取物能抑制其濃度升高。上述結果，我們可推論，三點金草甲醇萃取 物之抗發炎作用，可能是透過抑制 IL-1β、TNF-α 活性，進而降低 COX-2 及 iNOS 活性，因 iNOS 活性降低，使得發炎組織所產生的 NO 含量下降，減少脂質過氧化的發生，而減低發炎組織 MDA 中的 產生，以達抗發炎效果，而 COX-2 活性的降低，促使前列腺素的生 合成降低，這也有助於抗發炎作用。

實驗結果發現，indomethacin對於足蹠組織中TNF-α濃度的升高，

具 有 抑 制 效 果 而 與 文 獻 報 導 一 致^(106,107)， 然 而 亦 有 文 獻 指 出 indomethacin對TNF-α無影響⁽¹⁰⁸⁾，更有與上述結果相反之論調^(109,110)。

氯化碳所造成實驗小鼠血清中sGOT、sGPT的上升並不明顯。

在抗氧化活性之評價分析方面，對DPPH 自由基清除能力、總抗 氧化能力測定及還原力測定分析中，乙酸乙酯層在三種活性分析中顯 示最佳活性，在總多酚類含量測定也是最高，進一步我們推測三點金 草清除自由基能力，可能與酚類化合物具轉移電子或氫原子給自由基 的還原能力。乙酸乙酯層及正丁醇層經HCl-Mg 反應檢測呈現陽性反，

表明含有黃酮類化合物。正丁醇層以生物鹼沈澱反應呈陽性反應，表 明含有生物鹼類化合物。

總黃酮類(flavonoids)含量測定分析中，三點金草甲醇萃取物約 22.5 mg rutin equivalent/g dry weight，若以重量百分比計算黃酮類成分 的含量約為2.25 %，與中藥中之甘草黃酮類成分含量相當⁽¹¹¹⁾。

在抗氧化儀器新應用利用 DPPH 自由基去除率與酵素免疫分析 法ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay)方式比較，三點金草 甲醇萃取物在0.4 mg/mL 時，分別相當於 77.6 及 70.7μg/mL 維生素 E，

由抗氧化效價分析測定過程中可知，決定檢品分析用量，與評估檢品 是否具抗氧化的優劣，檢品分析用量扮演重要的角色。清除率與檢品 濃度呈正相關關係，在適當濃度範圍內測定的敏感度和準確度皆具再

現性^(112-115)。檢品本身所具有的顏色在測定時不得不考慮，檢品用量

並非越大越好，若檢品具有顏色，其用量大到一定程度，檢品活性測

定將難以比較，本新開發方法檢品用量少，背景干擾很低是其優點。

建立此新的分析方法，可以用更簡單方便迅速、準確及經濟的方法，

用於大量篩選，來評估抗氧化物對於自由基的清除及抗氧化的效價，

希望在未來可以廣泛應用於分析評估食品、中草藥、化妝品及保健食 品之抗氧化效價。

第六章 結 論

本論文對三點金草(Desmodium triflorum (L.)DC)探討藥理及抗氧

本論文對三點金草(Desmodium triflorum (L.)DC)探討藥理及抗氧