第三章 實驗材料及方法
第三節 三點金草之鎮痛抗發炎實驗
2. 福馬林試驗
福馬林誘發舔蹠反應試驗(Formalin Test)，採用 Dubuisson 及 Dennis 修飾後的方法，將不同劑量三點金草甲醇萃取物0.1、0.5 與 1.0 g/kg 口 服給予，給藥後 60 分鐘，用微量注射器以 27 號針頭，在小鼠右後足背，
皮下注射20 μl 的 5 ％福馬林溶液(63)，立即將鼯鼠置入觀察箱中觀察，
並每隔 5 分鐘紀錄一次，小鼠舔其右後足蹠注射福馬林部位，計算舔蹠 所累積之秒數，共記錄 30 分鐘(46,49)。首先將0-5 分鐘之累積舔蹠秒數稱 為早期或第ㄧ相(early phase；first phase)為痛覺反應時間。然而 20-30 分 鐘之累積舔蹠秒數稱為晚期或第二相(late phase；second phase)為痛覺反 應時間。並以 indomethacin 10 mg/kg 為正對照組，於注射福馬林前 30 分鐘腹腔注射給藥。
圖3-2 福馬林試驗實驗流程
三、三點金草之抗發炎試驗
此實驗以λ-角叉菜膠誘導小鼠足蹠腫脹為實驗模式，用記號筆在小 鼠右後肢踝關節周圍做一標記，將小鼠右後足蹠浸入浮腫測定儀器，測 量正常足蹠容積後分別在小鼠右後足蹠皮下注射1 % λ-角叉菜膠混懸液 (50 μl/隻)誘導發炎(64)。誘導2小時後，將小鼠分別以不同劑量之三點金 草甲醇萃取物(0.1、0.5、1.0 g/kg)以口服方式投藥，誘導後1.5小時腹腔 注射正對照組indomethacin (10 mg/kg)，給藥量皆為0.1 mL/10 g。經注射 1 % λ-角叉菜膠混懸液(50 μl/隻)誘導發炎後，每隔1小時，各測定一次足 蹠容積，連續測6小時，紀錄結果，並分別計算誘導發炎後每小時足蹠 體積與誘導前個別足蹠體積差(△V)。
圖3-3 λ-角叉菜膠誘導小鼠足蹠腫脹實驗流程
四、三點金草之抗發炎機轉探討
分別在小鼠右後肢足蹠皮下注射1 % λ-角叉菜膠混懸液(50 μl/隻) 誘導發炎。誘導2小時後，分別將不同劑量之三點金草甲醇萃取物(0.1、
0.5、1 g/kg)以口服方式投予；於誘導後1.5小時腹腔注射正對照組 indomethacin (10 mg/kg)。誘導後第3個小時將部分動物犠牲，並取其肝 臟 組 織 及 足 蹠 組 織 。 測 定 小 鼠 肝 臟 組 織 之 超 氧 歧 化 酶(superoxide dismutase，SOD)、麩胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GRd)及麩胱甘 肽過氧化酶(glutathione peroxidase, GPx)活性之變化。足蹠組織中丙二醛 (MDA)濃度、NO含量、IL-1β活性及TNF-α活性，探討抗發炎活性之機 轉。
(一)、肝組織抗氧化酵素活性測定
1.超氧歧化酶(super oxide dismutase assay, SOD)之測定
本實驗方法依據1984年，Kakkar和Viswanathan提出之方法，取肝組 織0.5 g，加入0.5 ml的Normal Saline，以均質機均質，取300 μl均質液於 試管中，加入1.8 ml 冷的二次去離子水，4 ℃、冷藏15分鐘，混合均勻。
取20 μl的混合液加入120 μl 0.1M Phosphate buffer (CAPS 40 mM、EDTA 0.94 mM，pH 7.0)均勻混合，最終，取5 μl混合液加入340 μl Mixed
Substrate1 (xanthine 0.05 mM、I.N.T 0.025 mM)，再加入xanthine oxidase 呈色，混合均勻後於波長505 nm，反應溫度37 ℃下測量吸光值，每隔30 秒測量一次，總共測量3分鐘，計算每分鐘吸光值變化速率，以多重校 正曲線計算濃度。SOD活性以單位時間內抑制I.N.T自動氧化速率為一單 位(U)，肝組織內SOD 比活性以U/mg protein 表示(65)。
2.麩胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GRd)之測定
本實驗方法依據1966年Guntherberg 與Rost提出之方法(66)，主要利 用NADPH來測量GSH-Rd 的活性，NADPH在波長340 nm下具有吸光值，
而NADPH經由GSH-Rd作用下代謝變成NADP，吸光值會下降，所以 GSH-Rd 活性與吸光值呈反比。取肝組織0.5 g，加入0.5 mL的normal saline 均質，取10 μl的均質液，加入190 μl 的precipitating reagent (trichloroacetic acid in water)混合均勻，離心3000 rpm，4 ℃、10分鐘。
取上清液50 μl 於Cuvette中，依序加入等量50 μl 的Buffer (potassium phosphate、diethylenetriamine pentaacetic acid 、Lubrol 、pH 7.8)，Reducing agent(tris(2-carboxyethyl) phosphine in HCl) ， Chromogen (1-methyl-4-chloro-7-trifluoromethyl-quinolinium methylsulfate in HCl)，
Color developer (NaOH in water)混合均勻，於波長340 nm下測量吸光值，
3.麩胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase, GPx)之測定
本法根據Paglia及Valentine (1967)所提出之方法為基礎(68)，利用 glutathione 及 cumene hydroperoxide 與 GSH-Px 作 用 ， 再 以 NADPH 與 glutathione reductase將氧化態的GSSG (oxidised glutathione)迅速轉成還 原 態 ， 伴 隨 著NADPH氧化成NADP+， 以 吸 光 值 之 減 少 速 率 來 定 義 GSH-Px之活性。取肝組織0.5 g，加入0.5 ml的normal saline均質，取均 質液50 μl，加入1 mL的diluting agent稀釋，隨即加入Reagent 1 (glutathione 4 mM、glutathione reductase 0.5 U/L、NADPH 0.28 mM)混合均勻，再加 入Reagent 2 (cumene hydroperoxide 0.18 mM)作用，於溫度37℃、波長340 nm下測量吸光值，計算吸光值變化速率(U/L)，肝組織內glutathione peroxidase活性以U/mg protein 表示。
4.肝組織中總蛋白之測定
取肝組織0.5 g，加入0.5 mL的normal saline 均質，取肝均漿50 μl，
加 入350 μl 的 normal saline 混 和 均 勻 ， 加 入 Biuret reagent (sodium hydroxide 100 mM、Na-K-tartrate 16 mM、potassium iodide 15 mM、cupric sulphate 6 mM)使反應變化呈增色反應，波長550 nm條件下測量吸光值，
每隔25秒測量一次吸光值變化，於反應第15分鐘達反應終點，以人血清 為protein standard，濃度(6.0 g/dL）產生吸光值變化扣除blank reagent (Sodium hydroxide 100 mM、Na-K-tartrate 16 mM）之吸光度差，換算出 轉換係數(F)，進而換算出肝組織total protein之濃度，肝組織total protein 以mg/g tissue表示(69)。
(二)、足蹠組織抗發炎相關活性測定：
1.足蹠組織中IL-1β濃度測定：
本分析是採用定量的三明治酵素免疫分析法(quantitative sandwich enzyme immunoassay technique)來測定mouse IL-1β的濃度。一種對IL-1β 有特異性的monoclonal antibody已經先被結合在microplate上，當標準品 和樣品被加入wells後，加入對IL-1β有特異性的enzyme-linked polyclonal antibody，最後加入substrate reagent等顏色呈現後便終止反應，在波長450 nm的吸光值下得到樣本中IL-1β的濃度。
(1)足蹠組織前處理
↓秤取蹠組織，加入4 倍量生理食鹽水均質。
↓於4℃，以 12,000 rpm 離心 5 分鐘，取上清液為檢品(此檢品可與 TNF-α、
NO 的測定共用)。
(2)製備IL-1β標準曲線
↓取4管eppendorf (分別為Stock、Std1~3)，均加入300 μl standard diluent。
↓加入100 μl IL-1β standard置於Stock tube，之後從Stock中取100 μl加入 Std 1 tube內；再從Std 1取100 μl加入Std 2 tube內；再從Std 2取100 μl
加入Std 3 tube內。 diluents (μl)
Standard 4,000 (pg/mL)
IL-1β Concentration (pg/mL) wells(除Blank外)，室溫下，振搖96孔微量盤，2小時後，用400 μl wash buffer沖洗3次。
↓加入100 μl streptavidin-HRP conjugate後，室溫下，振搖96孔微量盤，
2小時後，用400 μl wash buffer沖洗3次。
↓加入100 μl TMB substrate後，避光振搖96孔微量盤，30分鐘。
↓加入100 μl stop solution。
↓在波長450 nm下測定其吸光值。
上述流程如表3-3之說明。
表3-3 IL-1β 實驗步驟流程表
Well Blank (μl)
Streptavidin-HRP conjugate 100 100 100 Room temperature 2 hr, sealed →→→ →→→ →→→
Wash 3次 × 400 μl →→→ →→→ →→→
TMB substrate 100 100 100 Room temperature 30 min, in
dark
→→→ →→→ →→→
Stop solution 100 100 100
－：表示該步驟不加任何試劑。
→→→：表示等候時間內於室溫下振搖或是清洗數次
2.足蹠組織中TNF-α濃度測定：
本分析是採用定量的三明治酵素免疫分析法(quantitative sandwich enzyme immunoassay technique)來測定mouse TNF-α的濃度。一種對 TNF-α有特異性的monoclonal antibody已經先被結合在microplate上，當 標準品和樣品被加入wells後，加入對TNF-α有特異性的enzyme-linked polyclonal antibody，加入substrate solution，incubation一段時間後，加入 substrate reagent使顏色呈現出來，終止反應後，在波長490 nm下測得該 樣品所含TNF-α濃度(71)。
(1)製備TNF-α標準曲線
↓取8管eppendorf(分別為Stock、Std 1~7)，stock加入450 μl assay buffer；
Std 1~7加入250 μl assay buffer。
↓加入50 μl TNF-α standard置於Stock tube，之後從Stock中取250 μl加入 Std 1 tube內；再從Std 1取250 μl加入Std 2 tube內；再從Std 2取250 μl 加入Std 3 tube內，以此類推，連續稀釋到Std 7。
上述標準品濃度之配製，如表3-4。
表3-4 TNF-α 標準品濃度之配製表 Test
tube
Assay buffer (μl)
TNF standard (μl) 20,000 (pg/mL)
TNF Concentration (pg/mL)
Stock 450 50 2,000
Std 1 250 Stock 250 1,000 Std 2 250 Std 1 250 500 Std 3 250 Std 2 250 250 Std 4 250 Std 3 250 125 Std 5 250 Std 4 250 62.5 Std 6 250 Std 5 250 31.25 Std 7 250 Std 6 250 15.625
(2)檢品分析步驟
↓加入50 μl標準品及檢品到指定wells(除Blank外)，室溫下，振搖96 孔微量盤，2小時後，用400 μl wash buffer沖洗3次。
↓加入50 μl TNF-α 抗體，室溫下，振搖96孔微量盤，2小時後，用400 μl wash buffer沖洗3次。
↓加入100 μl streptavidin-HRP conjugate後，室溫下，振搖96孔微量盤，
30分鐘後，用400 μl wash buffer沖洗3次。
↓加入100 μl TMB substrate後，振搖96孔微量盤，30分鐘。
↓加入100 μl stop solution。
↓在波長490 nm下測定其吸光值。
↓上述流程如表3-5之說明。
表3-5 TNF-α實驗步驟流程表
Well Blank (μl)
Streptavidin-HRP conjugate 100 100 100 Room temperature 30 min, sealed →→→ →→→ →→→
3.足蹠組織中NO含量測定
測定組織中 NO 含量的方法，一般利用 NO2-可與 sulfanilamide 發生重氮化，再與naphthylethylenediamine 偶合反應(coupling reaction)，
生成紫紅色產物，此紫紅色產物在波長540 nm 下測定吸光值，經由 此原理可用分光光度法測定分析NO 含量(72)。
(1) NO 分析溶液配製
↓將assay buffer 用二次水稀釋到 100 mL
↓取1.0 ml assay buffer，加入 nitrate standard vial 瓶中
↓取1.2 ml assay buffer，加入 enzyme cofactors vial 瓶中
↓取1.0ml assay buffer，加入 nitrate reductase vial 瓶中
(2) NO 標準品溶液配製
如下表3-6 依序加入試劑，配製 NO 標準品濃度 表 3-6 NO 標準品濃度配製
Nitrate conc (μM) Nitrate standard (μl) Assay buffer (μl)
0 0 80 5 5 75 10 10 70 15 15 65 20 20 60 25 25 55 30 30 50 35 35 45
(3) NO 含量測定步驟
↓取80 μl NO 標準品或檢品放置於 96 孔微量盤中
↓先加入10 μl 的 enzyme cofactors
↓再加入10 μl 的 nitrate reductase 於室溫下靜置三小時
↓加入50 μl 的 Griess reagent R1
↓加入50 μl 的 Griess reagent R2 於室溫下靜置 10 分鐘
↓於540 nm測定吸光值
4.足蹠組織中丙二醛(Malnodialdehyde; MDA)濃度測定
其測定方法利用丙二醛MDA與硫代巴比妥酸thiobarbituric acid (TBA)，在酸性高溫下縮合，形成紅色複合物TBARS。此複合物在 波長532 nm下有最大吸光值，經由此原理可用分光光度法測定分析 MDA含量(73)。
(1) MDA標準品溶液配置
↓取1,1,3,3-tetraethoxypropane (TEP) 50 μl 以 40 %乙醇定容至 25 ml
↓取上述配製溶液250 μl，以 40 %乙醇定容至 50 mL，完成 TEP 試 液配製 (置於 4℃避光，可儲存 2 週)
↓ 以 0.01N 的 鹽 酸 ， 將 TEP 試 液 稀 釋 成 MDA 標 準 溶 (0.625/1.25/2.5/5/10/20/40 μM) 備用。(置於 4℃避光，可儲存 1 週) 詳如3-7 MDA 標準品濃度配製
表3-7 MDA 標準品濃度配製表
MDA濃度(μM) 0.625 1.25 2.5 5 10 20 TEP intermediate
standard solution (mL)
0.15 0.3 0.6 1.2 2.4 4.8
0.01 N HCl(mL) 9.85 9.7 9.4 8.8 7.6 5.2
(2)MDA含量測定溶液配製
↓0.2 g TBA加入50 mL、0.2 N HCl，以磁石攪拌器攪拌溶解 (置於4℃
下，可儲存4週)。
↓0.1 g BHT(butyhydroxytoluene)，加入50 mL 95％乙醇溶解(避光，
於4℃下，可儲存1週)。
↓取eppendorf (包裹鋁箔)，見表3-8依次序加入藥品。
表3-8 加入MDA試劑流程表
標準品或樣品(μl) BHT試液(μl) TBA試液(μl)
Blank 100 (0.01N HCl) 45 300
MDA standard 100 45 300
Sample 100 45 300
(3)蹠組織前處理
↓秤取蹠組織，加入4 倍量 0.9 % 生理食鹽水均質
↓於4℃，以 12,000 rpm 離心 5 分鐘，取上清液為檢品
↓測定組織中蛋白質含量(如前述) (4) MDA 含量測定步驟
↓取100 μl MDA 標準品或檢品放置於微量離心管
試 藥
孔
↓先加入保護劑45 μl BHT 試液於微量離心管
↓再加入300 μl 呈色劑 TBA 試液於微量離心管
↓將上述試液震盪混合均勻
↓於90℃水浴加熱 45 分鐘
↓取出靜置冷卻，加入445 μl 正丁醇，混合搖盪
↓以12,000 rpm 離心 5 分鐘
↓取上層液於532 nm下測吸光值
五、統計學分析
本研究所得之數據，均以Oneway ANOVA analysis 分析變異數，
再以Scheffe’s multiple range test 檢定其間差異之顯著性，凡p值小於 0.05時，則認為有統計意義。
第四節 三點金草之抗小鼠急性肝損傷實驗