本實驗以四株(I-1、I-2、I-3 及 I-5)濃度 1 µg/mL 的大腸桿 倍稀釋之 GAM-AP 反應一個小時，最後以 pNPP substrate 呈色 一個小時，實驗呈色反應 1 小時後用光電比色計讀取 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量。
35 存，另一組則加入 1/5000 稀釋之 GAR-AP(Sigma A3687)為三級 抗體反應 1 個小時。兩組皆清洗完，以 50 µL/well 加入 pNPP substrate 呈色 1 個小時，用 ELISA reader 讀取 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量。
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2. Microfuge tube immunoassay 的分析：
取 1.5 mL 微量離心管(Microfuge tube)，加入 1.5 mL ELISA blocking buffer，置於 4℃下 blocking 隔夜，後將 ELISA blocking 溶液甩乾。於微量離心管中分別加入經 5 分鐘煮沸處理的大腸 桿菌菌液稀釋成 103、104、105及 106 CFU/mL 四種濃度各 1.5 mL/tube，以 10000g、4℃離心 5 分鐘後，輕倒除去上清液，加 入 1.5 mL ELISA wash buffer 後以 10000 g、4℃離心 5 分鐘後，
輕倒除去上清液並倒置微量離心管置於紙巾上將殘留液體吸乾。
然後把 10 µg/mL 大腸桿菌單株抗體(一級抗體)、5000 倍稀釋之 RAM-AP(二級抗體)及 5000 倍稀釋之 GAR-AP(三級抗體)各 50 µL 同時加入，將離心管置於 28℃下震盪反應 1 個小時，以 10000 g、4℃離心 5 分鐘，倒去上清液後加入 1.5 mL ELISA wash 溶 液離心清洗兩次，最後倒置於紙巾上吸乾殘存液體。於每管內 加入 pNPP substrate 各 100 µL，混勻後於置於 28℃下震盪反應 一個小時，每管吸出 50 µL 加入 96 孔盤中，以光電比色機偵測 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量，實驗操作示意圖如(圖五)。
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圖五、Microfuge tube immunoassay 實驗步驟示意圖
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參、 結果 一、 抗原的製備
超音波破菌條件測試：
本試驗用以測試如何以超音波處理可以使得未被超音破震 碎的大腸桿菌活菌數降到最低，並使大腸桿菌菌體內所含的各種 免疫原物質得以最大量釋出，在此運用偵測釋出蛋白質的量作為 偵測基準。由（圖六）可知當以超音波功率 6W 進行破菌處理時，
隨著超音波破菌的次數增加，OD600吸光值越來越低，細菌的存 活率也越來越低。當破菌處理超過 3 次後，OD600吸光值變化幾 乎穩定；而破菌處理超過 4 次後，細菌存活率則低於百萬分之一；
蛋白質釋出總量也趨近穩定。由結果可知，以超音波功率 6W，
進行 4 次(每次震盪 20 秒，休息 40 秒)超音波破菌處理，大部份 的細菌皆被打破，故再增加處理次數也不會增加破菌效率。以此 大腸桿菌破碎物為抗原進行小鼠免疫注射以生產單株抗體。
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圖六、超音波破菌條件測試
研究超音波處理次數與大腸桿菌破菌效果的關係，以破菌處理 過後的 OD600吸光值變化及蛋白質釋出量作為破菌程度指示。(a) 為超音處理次數與 OD600吸光值變化關係；(b)為超音波處理次
40 Pre-cloning screening
Cloning well no.
Selected cell line no.
Well name
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三、 單株抗體的純化與分析 (1) 抗體分型試驗（Isotyping）：
本次單株抗體生產，最後得到 9 株對大腸桿菌超音波破碎 抗原 ELISA 測試有明顯反應的單株抗體，這些抗體分型(見表四) 主要分成四類(IgG1, κ)、(IgG2b, κ)、(IgM, κ)及(IgG3, κ)，其中 重鏈為 IgG1 的有 6 株，IgG2b、IgM、IgG3 的各有 1 株；輕鏈 部分則全為 κ。
表四、單株抗體的 Isotyping 結果
Cell line Isotype
Heavy chain Light chain
MA-E. coli-1C8 IgG1 κ
MA-E. coli-2E2 IgG1 κ
MA-E. coli-4D11 IgG1 κ MA-E. coli-7B2 IgG2b κ
MA-E. coli-8B6 IgG1 κ
MA-E. coli-8D12 IgG1 κ
MA-E. coli-8E9 IgG1 κ
MA-E. coli-8G11 IgM κ
MA-E. coli-10G5 IgG3 κ
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(2) 大腸桿菌單株抗體純化結果：
各單株抗體細胞培養收集液經過 Protein A/G 親和性管柱純化，純化後結果見(表五)。
表五、單株抗體純化結果表列
單株抗體編號 1C8 2E2 4D11 7B2 8B6 8D12 8E9 8G11 10G5
原體積(mL) 190 291 297 200 299 298 195 296 295
濃縮後體積(mL) 13 20 22 15 22 22 14 22 21
純化後濃度(mg/mL) 1.87 1.7 3.27 3.42 3.28 2.69 1.74 2.07 2.89 純化後體積(mL) 1.1 2.1 3.1 2.1 2.1 4.1 2.1 1.6 2.1 純化後總量(mg) 2.06 3.57 10.14 7.18 6.89 11.03 3.65 3.31 6.07
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各大腸桿菌單株抗體進行免疫染色分析：
以大腸桿菌破菌菌液離心後取其上清液為抗原，經西方轉漬 後與抗體反應結果(圖七)所示，9 株單株抗體中 1C8、2E2、4D11、
8G11、8D12、8E9、10G5 皆有多條色帶(Ladder bands)產生，在 此推測可能與大腸桿菌表面重要的免疫抗原「脂多醣 (LPSs)」
有關；7B2、8B6 則各有一條明顯色帶產生，7B2 約在 27 kDa 處，
而 8B6 則約在 75~80 kDa 處，另外還有一些較淡的色帶呈現。
圖七、單株抗體對大腸桿菌破菌抗原的免疫轉漬分析
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以超音波處理的大腸桿菌上清液為抗原以各抗體株進行 Western blot 結果。Lane1 ~ 9 是分別以九株(MA-E. coli-1C8、2E2、4D11、
7B2、8B6、8G11、8D12、8E9 及 10G5)大腸桿菌單株抗體對抗 原進行免疫染色；Lane N 則是以 MA-Sal(沙門氏菌專一性抗體)
結果 9 株大腸桿菌單株抗體培養液中 6 株(1C8、2E2、4D11、8D12、
8E9 及 10G5)對大腸桿菌破菌抗原(Ec)有很強的訊號反應，另外 3 株(7B2、8B6 及 8G11)則對所有菌種皆有或強或弱的訊號反應。
另外所有的單株抗體不論是大腸桿菌單株抗體實驗組、
Mab-Osm 負對照組或是只加入 ELISA dil.組皆對金黃色葡萄球 菌(Sa)有很強的訊號產生，這些訊號產生的可能原因是金黃色葡 萄球菌表面具有 protein-A 會非專一吸附 Mouse IgG3 及 Rabbit IgG 抗體，而不是抗體對抗原的專一性作用，除吸附少數一級抗 體(mouse monoclonal antibody)外，主要吸附大量的二級抗體 (RAM-AP)，因而造成 ELISA 反應訊號的產生。故之後應用應避 免使用兔多株抗體作為二級抗體，以消除分析樣品中如含有金 黃色葡萄球菌，而與兔抗體同時存在時所造成之非專一性吸附 現象。
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圖八、大腸桿菌單株抗體對不同菌種的辨識力比較─測試 1。
本實驗使用培養至 OD600=1 後以超音波破菌處理的 8 種不同的 細菌株(Bs：枯草桿菌；Sa：金黃色葡萄球菌；Vp：腸炎弧菌；
Pf：螢光假單胞菌；Ss：志賀氏桿菌；S-E：腸炎沙門氏菌；S-T：
鼠傷寒沙門氏菌；Ec：大腸桿菌)其縮寫標示於橫軸，破菌菌液 經稀釋成 1/10 濃度為抗原進行 ELISA 試驗。並以九株(MA-E.
coli-1C8、2E2、4D11、7B2、8B6、8G11、8D12、8E9 及 10G5) 大腸桿菌單株抗體培養液為實驗組一級抗體 50 µL/well 加入 ELISA plate 中；負對照組(negative control)用的是 Mab-Osm 單株 抗體培養液 50 µL/well；E dil.用的是 ELISA 抗體稀釋液。二級 抗體則皆使用 1/5000 稀釋的 RAM-AP，實驗呈色反應 1 小時後 讀 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量，縱軸即為其讀值，這九株 抗體株反應結果表示於圖(a) ~ (i)。
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表六、本實驗所測試的細菌分類資料─陽性菌
Gram stain Phylum Class Order Family Genus/Species serotype
Gram (+)
Staphylococcus aureus
(金黃色葡萄球菌) ─
Bacillaceae (芽孢桿菌科)
Bacillus subtilis
(枯草桿菌) ─
Listeriaceae (李斯特菌科)
Listeria monocytogenes
(李斯特菌) ─
Lactobacillales (乳桿菌目)
Streptococcaceae (鏈球菌科)
Streptococcus dysgalactiae
(減乳糖鏈球菌) ─ 註：紅色代表本實驗第一次菌種專一度測試所用之細菌菌株；綠色則為第二次實驗所增加之菌株。
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表六、本實驗所測試的細菌分類資料─陰性菌
Gram stain Phylum Class Order Family Genus/Species serotype
Gram (−) Proteobacteria (變形菌門)
Vibrio parahaemolyticus
(腸炎弧菌) ─
Pseudomonadales (假單胞菌目)
Pseudomonadaceae (假單胞菌科)
Pseudomonas fluorescens
(螢光假單胞菌) ─
Enterobacteriales (腸桿菌目)
Enterobacteriaceae (腸桿菌科)
Escherichia coli
(大腸桿菌) O1 : K1 : H7 Klebsiella pneumonia
(克雷伯氏菌) ─
Shigella sonnei
(志賀氏桿菌) ─
Salmonella enteric (腸道沙門氏菌)
Enteritidis Typhimurium 註：紅色代表本實驗第一次菌種專一度測試所用之細菌菌株；綠色則為第二次實驗所增加之菌株。
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改變二抗後再次進行菌種專一度測試：
再進行第二次菌種專一性試驗後，依「測試 2」(圖九)所呈 現之結果，本次實驗使用 9 株經過純化後大腸桿菌單株抗體，
其中 6 株對大腸桿菌抗原(Ec)具有顯著反應，負對照組抗體 (MA-Sal)則對大腸桿菌抗原(Ec)無反應，但依預期對沙門氏菌抗 原(S-T)有顯著反應。反應結果中因改用 GAM-AP 為二級抗體，
原本金黃色葡萄球菌 protein A 非專一吸附 RAM-AP 的情形消失，
偽訊號也不再呈現，但對於單株抗體 10G5 仍有訊號反應(「*」
標記處)，推測為其 protein A 會對 IgG3 型抗體產生非專一性吸 附，而非抗體對抗原的專一性作用。不同大腸桿菌單株抗體對 各菌株抗原的作用力比較結果可見(表七)，本實驗所生產的 9 株 單株抗體中，有 6 株(1C8、2E2、4D11、8D12、8E9、10G5(金 黃色葡萄球菌與其會有反應))對於大腸桿菌抗原有著顯著的專 一性反應，定此為第一群；而其他 3 株(7B2、8B6、8G11)則對 所有實驗菌株皆有反應，實驗組訊號值相對於負對照組均有顯 著差異，故把這 3 株定為第二群。在此依其專一性特性重新編 號 1C8、2E2、4D11、8D12、8E9 及 10G5 為 I-1、I-2、I-3、I-4、
I-5 及 I-6，作為第一群；第二群 7B2、8B6 及 8G11 則為 II-1、II-2 及 II-3。重新系統分群後大腸桿菌單株抗體重新命名與原本抗體 細胞株名稱對照表見(表八)。
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圖九、大腸桿菌單株抗體對不同菌種的辨識力比較─測試 2。
本實驗想得知二級抗體改用 GAM-AP，對 ELISA 反應結果之影 響，在此使用培養至 OD600=1 後以超音波破菌處理的 11 種不同 的細菌株菌液，其各菌株簡寫列於橫軸(Bs：枯草桿菌；Lm：李 斯特菌；Sa：金黃色葡萄球菌；Sd：減乳糖鏈球菌，以上為革 蘭氏陽性菌；以下為革蘭氏陰性菌，Vp：腸炎弧菌；Pf：螢光 假單胞菌；Ss：志賀氏桿菌；Kp：克雷伯氏菌；Ec：大腸桿菌；
S-E：腸炎沙門氏菌；S-T：鼠傷寒沙門氏菌。綠色標記為在本 測試中與「測試 1」相比增加之測試細菌株)，菌液經稀釋成 1/10 濃度(108 CFU/mL)為抗原，實驗在此使用同「測試 1」的 9 株大 腸桿菌單株抗體，但本測試已經將這 9 株單株抗體經過純化處 理，並將其稀釋成 1 µg/mL 濃度作為一級抗體進行 ELISA 試驗，
各單株抗體株反應後結果顯示於圖(a) ~ (i)；負對照組所用之一 級抗體是 1 µg/mL 的沙門氏菌單株抗體 MA-Sal。二級抗體則皆 改用 1/10000 稀釋的 GAM-AP，實驗呈色反應 1 小時後偵測 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量，縱軸即為其讀值。圖中每個資料 點均為三個重複樣品(n=3)的平均值±標準差。
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表七、不同大腸桿菌單株抗體對各種細菌的作用力比較 Well name
(designated name) 1C8 2E2 4D11 7B2 8B6 8D12 8E9 8G11 10G5 (I-1) (I-2) (I-3) (II-1) (II-2) (I-4) (I-5) (II-3) (I-6) Bacteria (Gram +/−)
Bacillus subtilis (+) − − − + + − − + −
Listeria monocytogenes(+) − − − + + − − + −
Staphylococcus aureus (+) − − − + + − − + ++
Streptococcus dysgalactiae(+) − − − + + − − + −
Vibrio parahaemolyticus (−) − − − + + − − + −
Pseudomonas fluorescens(−) − − − ++ + − − + −
Shigella sonnei(−) − − − ++ + − − + −
Klebsiella pneumonia (−) − − − ++ + − − + −
Escherichia coli(−) +++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ + ++
Salmonella Enteritidis (−) − − − ++ + − − + −
Salmonella Typhimurium (−) − − − ++ + − − + −
註:在同次 ELISA 實驗中(圖九)，OD 值訊號高於 0.7 者標為「+++」，介於 0.4 至 0.7 之間者標為「++」，介於 0.05 至 0.4 者為「+」，訊號低於 0.05 者標為「−」；(+) 代表革蘭氏陽性菌，(−) 代表革蘭氏陰性菌。「designated name」是依各大腸桿 菌單株抗體對細菌專一性結果重新系統分群命名。
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圖十、福馬林處理之大腸桿菌全菌 ELISA 結果。
本實驗以將 108 CFU/mL 未破菌處理的大腸桿菌 I (intact cell)經 過福馬林固定(formalin-fixed)處理及超音波破菌處理的大腸桿 菌 S (sonicated cell)為抗原，使用 5 株大腸桿菌專一抗體進行試 驗；P：正對照組，用的是注射大腸桿菌抗原的小鼠 1/1000 稀釋 血清；N：負對照組，用的是沙門氏菌單株抗體 MA-Sal。二級 抗體則用 1/10000 稀釋的 GAM-AP，實驗呈色反應 1 小時後偵 測 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量，縱軸即為其讀值。圖中每 個柱狀圖均為平均值±標準差(n=3)。
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(二)免疫沉澱方法證明單株抗體對菌體吸附能力：
在此應用免疫沉澱方法測試大腸桿菌單株抗體是否能與大 腸桿菌活菌顆粒表面結合，實驗操作圖與預測結果圖如下(圖十 一)，實驗結果(圖十二)顯示以第一群抗體 6 株大腸桿菌專一性 抗體進行免疫染色後，在重鏈(50 kDa)及輕鏈(25 kDa)處皆產生 紫黑色的線條，這即代表免疫沉澱實驗中大腸桿菌表面有抗體
在此應用免疫沉澱方法測試大腸桿菌單株抗體是否能與大 腸桿菌活菌顆粒表面結合，實驗操作圖與預測結果圖如下(圖十 一)，實驗結果(圖十二)顯示以第一群抗體 6 株大腸桿菌專一性 抗體進行免疫染色後，在重鏈(50 kDa)及輕鏈(25 kDa)處皆產生 紫黑色的線條，這即代表免疫沉澱實驗中大腸桿菌表面有抗體