大腸桿菌之單株抗體的生產與分析研究

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 大腸桿菌之單株抗體的生產與分析研究 Production and characterization of monoclonal antibodies directed to Escherichia coli. 研究生：呂泰霖 Tai-lin Lu 指導教授：王玉麒博士 Dr. Yu-Chie Wang 中華民國 101 年八月.

(2) 致謝首先，我要感謝我的指導教授王玉麒老師在這個研究過程中悉心的教授我各種研究知識，並提供充足的實驗資源讓我的研究能順利的完成。老師在日常生活中對我們時時刻刻耳提面命，使我們對於實驗及做事細節都更加的注意，相信對我們未來無論是工作上或是生活上都會有相當的助益。並感謝我的口試委員台北醫學大學的吳雪霞老師以、本校的李冠群老師，及指導老師王玉麒老師在口試時為我的實驗內容提供了許多寶貴的建議及指教，這些都使的我的論文得以更佳的完備。接著還要對我們實驗室的全體同仁致謝，政霖、超凡、宗明、韻如、周坤學長姊都在我的研究中提供許多建議及幫助，透過他們的提攜，使研究更加順利的進行。還要感謝哲雄學長提供我們試驗材料及實務上的建議。當然還得感謝我的同學奕輝，及學弟國緯在實驗中無私的幫忙。除此之外，更是感謝大家相互的鼓勵及關心，讓進行研究的這些日子得以更佳的豐富有趣。最後，我要感謝我親愛的家人全力的支持，在我遇到挫折時聽我傾訴並給予我最大的鼓勵及安慰，並感謝我在台北期間舅舅、阿姨們的幫助，讓我能無後顧之憂的在台北進行研究，順利完成學業，這些恩情我會永遠謹記在心。.

(3) 目錄. 摘要............................................................................................................. 1 Abstract ....................................................................................................... 3 壹、緒論..................................................................................................... 5 一、食源性疾病及發展大腸桿菌偵測法的必要性 ......................... 5 二、大腸桿菌的介紹.......................................................................... 7 三、大腸桿菌表面結構及抗原簡述 ................................................. 9 四、大腸桿菌感染途徑與症狀 ....................................................... 12 五、現行國家標準檢驗方法 ........................................................... 15 六、其他大腸桿菌偵測方法 ........................................................... 17 七、研究目的.................................................................................... 22 貳、材料與方法 ...................................................................................... 24 一、抗原的製備................................................................................ 24 1. 大腸桿菌菌數定量方法測試................................................ 24 2. 大腸桿菌超音波破菌條件測試............................................ 24 3. 蛋白質定量 ............................................................................ 24 二、單株抗體製備............................................................................ 25 1. 小鼠免疫注射 ........................................................................ 25 2. 小鼠脾臟細胞與骨隨瘤細胞融合 ....................................... 25.

(4) 3. 融合瘤細胞株篩選與單株化................................................ 26 (1) 酵素免疫分析法 ................................................................ 26 (2) 細胞單株化 ........................................................................ 27 三、單株抗體的純化與分析 ........................................................... 27 1. 大腸桿菌單株抗體 Isotyping ............................................. 27 2. 大腸桿菌單株抗體的濃縮及 Protein A/G 親和性管柱純化 ...................................................................................................... 28 3. 大腸桿菌單株抗體對不同菌株專一性分析 ....................... 29 4. 大腸桿菌單株抗體結合大腸桿菌細菌顆粒能力分析 ....... 30 (1) 福馬林固定方法測試 ........................................................ 30 (2) 大腸桿菌活菌免疫沉澱試驗 ............................................ 31 5. 大腸桿菌 O-antigen(LPSs)萃取及單株抗體所辨識抗原是否為 LPS 分析.................................................................................. 32 6. 大腸桿菌單株抗體的效價分析............................................ 34 7. 不同抗體株間競爭性測試(Competitive ELISA)................. 34 四、免疫分析方法的開發................................................................ 35 (1) Direct ELISA 的分析............................................................ 35 (2) Microfuge tube immunoassay 的分析 .................................. 36 參、結果................................................................................................... 37.

(5) 一、抗原的製備................................................................................ 38 超音波破菌條件測試............................................................... 38 二、單株抗體的製備........................................................................ 40 三、單株抗體的純化與分析 ........................................................... 41 (1) 抗體分型試驗（Isotyping） ............................................... 41 (2) 大腸桿菌單株抗體純化結果 .............................................. 42 各大腸桿菌單株抗體進行免疫染色分析 ........................ 43 (3) 大腸桿菌單株抗體對不同菌種的專一性分析 .................. 44 改變二抗後再次進行菌種專一度測試 ............................ 51 (4) 大腸桿菌單株抗體結合大腸桿菌細菌顆粒能力分析 ...... 57 (一) 福馬林固定處理 ............................................................ 57 (二) 免疫沉澱方法證明單株抗體對菌體吸附能力 ............ 59 (5) 大腸桿菌單株抗體是否辨識 LPSs (O-antigen)................. 61 (6) 大腸桿菌單株抗體的效價分析 .......................................... 62 (7) 大腸桿菌單株抗體間競爭性測試分析(Competitive ELISA) .................................................................................................... 65 四、大腸桿菌免疫偵測方法的探討 ............................................... 69 (1) Direct ELISA 的分析結果.................................................... 69 (2) 使用至三級抗體對 ELISA 檢測是否可提升靈敏度 ......... 71.

(6) (3) Microfuge tube immunoassay 的分析結果 .......................... 72 肆、討論................................................................................................... 74 一、單株抗體生產製備的策略 ....................................................... 74 (1) 萃取表面抗原及可能面臨的問題 ...................................... 74 (2) 使用超音波破菌處理抗原以增加篩選出大腸桿菌專一性抗體的可能性 ...................................................................... 75 (3) 抗原注射的探討 .................................................................. 75 (4) 抗體單株化的探討 .............................................................. 77 二、抗體的分析與應用潛力 ........................................................... 78 三、免疫偵測方法的開發探討 ....................................................... 82 (1) 偵測的前處理──煮沸的必要性 ........................................ 82 (2) 使用到第三層抗體對檢測的優缺點 .................................. 82 (3) LPSs 抗體檢測極限推論 ..................................................... 83 四、抗體應用發展............................................................................ 84 伍、總結................................................................................................... 92 參考文獻................................................................................................... 94 網站參考資料.................................................................................. 104 附錄......................................................................................................... 105 附錄一、縮寫對照表...................................................................... 105.

(7) 附錄二、細菌培養液配方.............................................................. 107 附錄三、常用溶液配方.................................................................. 108.

(8) 圖目錄（圖一）大腸桿菌表面構造的示意圖 .................................................. 10 （圖二）大腸桿菌脂多醣(Lipopolysaccharides，LPSs)的構造示意圖 ................................................................................................................... 12 （圖三）大腸桿菌國家標準檢驗流程圖 .............................................. 16 （圖四）大腸桿菌 LPSs 萃取示意圖 .................................................... 33 （圖五）Microfuge tube immunoassay 實驗步驟示意圖 ..................... 37 （圖六）超音波破菌條件測試 .............................................................. 39 （圖七）單株抗體對大腸桿菌破菌抗原的免疫轉漬分析 .................. 43 （圖八）大腸桿菌單株抗體對不同菌種的辨識力比較──測試 1 ..... 48 （圖九）大腸桿菌單株抗體對不同菌種的辨識力比較──測試 2 ..... 55 （圖十）福馬林處理之大腸桿菌全菌 ELISA 結果 ............................. 58 （圖十一）免疫沉澱反應的示意圖 ...................................................... 60 （圖十二）本研究所生產的單株抗體對大腸桿菌顆粒進行免疫沉澱 (Immunoprecipitation)實驗結果 .............................................................. 60 （圖十三）單株抗體辨識 LPSs 免疫染色結果 .................................... 62 （圖十四）大腸桿菌單株抗體對其抗原作用能力比較結果 .............. 64 （圖十五）大腸桿菌單株抗體間競爭作用試驗條件選擇 .................. 66 （圖十六）大腸桿菌單株抗體間競爭作用示意圖 .............................. 67.

(9) （圖十七）大腸桿菌單株抗體間競爭作用分析結果 .......................... 69 （圖十八）大腸桿菌活菌及經煮沸處理 ELISA 反應結果 ................. 70 （圖十九）使用至二級抗體及至三級抗體檢測比較實驗 .................. 71 （圖二十）I-5 單株抗體對大腸桿菌全菌抗原的 Microfuge tube immunoassay 結果 ................................................................................... 73 （圖二十一）可能會與 O1 血清產生 Cross-reaction 的不同血清型大腸桿菌，其所擁有的 O antigen 結構比較................................................. 86.

(10) 表目錄表一、台灣地區歷年病原性大腸桿菌中毒案件統計 ............................ 7 表二、近期大腸桿菌抗體偵測分析法文獻比較 .................................. 23 表三、製備大腸桿菌單株抗體的各階段結果 ...................................... 40 表四、單株抗體的 Isotyping 結果 ......................................................... 41 表五、單株抗體純化結果表列 .............................................................. 42 表六、本實驗所測試的細菌分類資料──陽性及陰性菌 .................... 49 表七、不同大腸桿菌單株抗體對各種細菌的作用力比較 .................. 56 表八、大腸桿菌的單株抗體系統分群資料 .......................................... 57 表九、文件記載的免疫注射劑量比較 .................................................. 77 表十、本研究所生產單株抗體可適用的實驗種類 .............................. 81 表十一、Direct ELISA 於不同實驗條件下之檢驗極限(以 I-5 為實驗抗體) ............................................................................................................. 83.

(11) 摘要大腸桿菌是造成人類感染疾病的重要病原菌之一，每年都造成全球許多生命及經濟的損失，故開發快速且準確的大腸桿菌檢測方法有其必要性。現今我國使用傳統的細菌培養法作為大腸桿菌檢測的標準檢驗方法，其缺點是過程需時冗長，且需使用較多空間與耗費較多人力。故本研究擬生產可專一辨識大腸桿菌的單株抗體，期能用以開發大腸桿菌的免疫檢測方法，或是作為大腸桿菌的基礎研究工具。本研究以超音波破菌處理過的大腸桿菌(ATCC 11775，血清型 O1： K1：H7)為抗原，對小鼠進行免疫注射，經細胞融合及選殖過程後，共獲得 9 株單株抗體。依照其對不同菌種的作用特性，這 9 株抗體可被分類為兩群：第一群共有 6 株 (I-1 ~ I-6)，僅會與大腸桿菌反應；第二群則有 3 株 (II-1 ~ II-3)，除了對大腸桿菌之外，亦會與本研究所測試的其他 10 種革蘭氏陰、陽性菌作用。進一步的抗原成分分析結果顯示，第一群抗體所辨識的抗原應為大腸桿菌表面的脂多醣 O 抗原；第二群抗體則可能辨識細菌的細胞內或分泌性的成分。在應用上，第一群單株抗體具有開發大腸桿菌免疫檢測方法的潛力，亦可透過遺傳工程技術產生重組抗體後，用作為抑菌用途的功能性食品添加成分，此外，本群抗體還可被用作為分析. 1.

(12) 細菌表面 O 抗原種類之工具；第二群單株抗體則可應用於生菌數的檢測或被用來分離細菌的保守成分，以供親緣關係探討之用。本研究也利用自行生產的單株抗體(I-5)，進行大腸桿菌免疫偵測方法的先驅研究。藉著簡易的步驟，我們開發的微量離心管免疫偵測方法可將大腸桿菌的偵測極限下降至 104 CFU/mL，並且整個過程僅需 2.5 小時即可完成，未來若能進一步確定抗體的專一性及提升檢測方法的敏感度，則將有取代現行標準檢測方法的潛力。. 關鍵字:大腸桿菌、單株抗體、抗體. 2.

(13) Abstract Escherichia coli is one of the main pathogens causing human disease. It annually not only made people’s deadth, but also result in large economic loss in the world.Therefore it is important to develop a rapid and accurate detection method for E. coli. Currently, the national standard detection method of E. coli is bacterial culture method, which is time-consuming, labor extensive, and space required. Thus, the aim of the present study is to produce E. coli-specific monoclonal antibodies, which may be used to improve the detection method for E. coli and as tools for basic researches. To fulfille our aim, we used sonicated E. coli(ATCC 11775, O1：K1： H7) cells as antigens to immuniz mice and manufactured monoclonal antibodies (MAbs) against E. coli. After cell fusion and cloning processes, we have successfully obtained nine E. coli-detecting MAbs. We can cluster these MAbs into two groups by bacterial specificity. The group I MAbs (I-1 ~ I-6) recognize just E. coli, and the group II MAbs (II-1 ~ II-3) recognize not only E. coli, but also all the other tested Gram-positive and Gram-negative bacteria. The group I MAbs recognize the O-antigen of LPS on the surface of E. coli. The result of immunoprecipitation proved the group II MAbs recognize antigens are cytosolic or or secreted out by bacteria. The group I MAbs might be used to develop E. coli immunodetection methods or as funtional antibiotic supplyment of food produced by genetic engineering. Besides, they can be used as a tool for bacterial O-antigen analysis.. 3.

(14) Then, the group II MAbs might be applicable for detection of total bacterial count or basic researches, e.g. bacterial phylogenetic studies. In this study, we presently used our I-5 MAb to develop a pilot study of immunodetection method. In this microfuge tube-based immunoassay, we used simple processes to increase the sensitivity at 104 CFU/mL within 2.5 h. After characterizing the specificity of MAbs and increasing the sensitivity of this assay in the future, this method might have the potential to replace the national detection method for E.coli.. Key words: Escherichia coli, monoclonal antibodies, antibodies. 4.

(15) 壹、. 緒論. 一、食源性疾病及發展大腸桿菌偵測法的必要性疾病的傳播通常需要經由一些媒介幫忙才得以擴散，這些病媒也就成為我們分類疾病的一大依據，「食源性疾病」所意指就是病原以食品或飲水為媒介，透過口進入人體而造成的疾病，而微生物、寄生蟲、化學藥劑、天然毒素等都是造成食源性疾病常見的病原。在這些病原中微生物是造成食源性疾病最重要的元凶，而細菌所引起的更是占其中的大宗。世界衛生組織(World Health Organization, WHO) [參一]所指全球導致食物中毒主要常見的細菌性病原，大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella)、曲狀桿菌(Campylobacter)及霍亂弧菌(Vibrio cholerae)等細菌皆在其列。而據我國行政院衛生署食品藥物管理局由民國七十年至民國九十九年的統計資料中顯示，國內造成食物中毒事件的細菌性病原以病原性大腸桿菌、腸炎弧菌、金黃色葡萄球菌、仙人掌桿菌、沙門氏菌及肉毒桿菌為最常出現的食源性細菌。由此可見不論是台灣還是全球都把大腸桿菌視為重要的食源性疾病感染病原。根據 WHO 估計全球食源性疾病發病數，僅 2005 年一年就有一百八十萬人死於腹瀉[參二]。而美國疾病管制中心(Centers for Disease 5.

(16) Control and Prevention，CDC)估計美國本土 2011 年就有四千七百八十萬食源性疾病病例，造成至少十二萬八千人住院治療，其中三千多名民眾因食物中毒而死亡，而依美國 1997 當年統計數據顯示，僅由這些主要病原體所引起的疾病就造成高達三百五十億美元的醫療費用和生產力上的損失[參三]。而美國每年因大腸桿菌所造成的食源性感染病例約有七萬三千人，造成兩千人住院以及六十人死亡，並衍生出超過四億美金的社會經濟損失(Frenzen et al. , 2005)，以上數據都顯示大腸桿菌導致的食品污染對健康及經濟強大威脅。發生於台灣地區的食物中毒事件，依據食品藥物管理局發布的台灣地區歷年食品中毒資料顯示，台灣地區近期每年約有數十件大腸桿菌感染事件發生，致使數百人因此受累。我國的大腸桿菌感染雖然近期沒有死亡的病例傳出，但並不能讓我們因此而輕忽它的威脅，感染患者數目及致死率低的原因與我國的飲食習慣及檢查確實度有關。根據美國 CDC 指出，食物飲水只需經高於 70℃溫度烹調即可將其中的大腸桿菌殺死[參四]，而我國傳統飲食以熟食為主，也較少飲用生水，加上頻繁的衛生抽查自然造成感染數據偏低。但隨著國人飲食愈來愈西化，生食機會增加，大腸桿菌感染的威脅也日益加重，從統計中也可得知病原性大腸桿菌感染事件近年來有數目增加的趨勢(見表一)。 6.

(17) 表一、台灣地區歷年病原性大腸桿菌中毒案件統計年. 案件數. 患者數. 死亡數. 1999. 0. 0. 0. 2000. 1. 20. 0. 2001. 0. 0. 0. 2002. 0. 0. 0. 2003. 0. 0. 0. 2004. 0. 0. 0. 2005. 0. 0. 0. 2006. 2. 322. 0. 2007. 1. 10. 0. 2008. 1. 43. 0. 2009. 10. 171. 0. 2010. 11. 256. 0. 2011. 16. 199. 0. 資料來源：行政院食品藥物管理局（http://www.fda.gov.tw/content.aspx?site_content_sn=323 ）. 二、大腸桿菌的介紹按細菌分類，大腸桿菌屬細菌域（Bacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、γ 變形綱（Gammaproteobacteria）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、埃希氏菌屬（Escherichia）、大腸桿菌種（E. coli）。大腸桿菌的學名為 Escherichia 7.

(18) coli (通常簡稱為 E. coli)，是用以紀念最早將此菌分離出的德國微生物學家艾歇利希(Theodor Escherich)醫生(1857～1911)而命名的，大腸桿菌種名(E. coli) 中的 coli 所指的是大腸桿菌於生物體內的主要棲息地「結腸」(colon)，艾歇利希於 1884 年首度由腹瀉病人糞便中分離出來此菌。早期命名為「Bacillus coli」，其中 Bacillus 表示其為一種桿菌。現在 Bacillus 這個屬名被專門用於表示會產生孢子的桿菌，而大腸桿菌卻為不產生孢子的桿菌，故其屬名就另改為 Escherichia 以表彰其發現者的貢獻(Shulman et al. , 2007)。大腸桿菌依革蘭氏染色分類為革蘭氏陰性菌，型態呈兩端鈍圓，菌體平均長 1 ~ 3µm、寬 0.4 ~ 0.7µm，每個細胞約重 10-12 公克。大腸桿菌細胞的組成約為 70％水分，15％蛋白質，6％核糖核酸，3％碳水化合物，2％脂質，1％去氧核糖核酸，少量的離子以及其他物質，具鞭毛能游動、不產生芽孢的短桿菌。因其基因體序列已全部解碼 (Blattner et al. , 1997)，故經常作爲模式生物用於科學研究。大腸桿菌於有氧或無氧環境下皆可生長，並廣泛分布於人體或動物的腸道內，一般不致病，於腸道中能合成對宿主有益的維生素 B 和 K，但眾多血清型中有部分會引起感染或產生食物中毒症狀，造成宿主生病甚至死亡，這些大腸桿菌稱為「病原性大腸桿菌」(Enteropathogenic Escherichia coli，EPEC)。 8.

(19) 三、大腸桿菌表面結構及抗原簡述大腸桿菌細菌表面抗原主要有 O、H 和 K 三種(Stenutz et al. , 2006)，是血清學分型的重要分類基礎，各抗原於大腸桿菌細胞上分布位置可見(圖一)。現今用以表示大腸桿菌血清型的方式是以 O：K： H 方式命名(Orskov & Orskov, 1985)，例如 O1：K1：H7 血清型，一般常用抗體血清與細菌的凝集試驗來鑑定血清型(Nataro & Kaper, 1998)，至今大約被鑑定出七百種不同的大腸桿菌血清型(Amin, 2011)。其中 O 抗原為位於細胞壁外層脂多醣(Lipopolysaccharides，LPSs) 分子最靠外側的多醣部分，現今鑑定出超過 180 種大腸桿菌 O 血清型(Cheasty, 2008)；而 H 抗原則是細菌表面所延伸出的鞭毛構造，所以只有大腸桿菌等具鞭毛、有運動能力的腸內細菌才會有 H 抗原，大腸桿菌已發現超過 60 種 H 血清型(Robins-Browne & Hartland, 2002)； K 抗原則披覆於 O 抗原的外側，為多醣結構，因其覆蓋 O 抗原，所以會抑制 O 抗原與其抗血清的凝集反應，故血清學檢測時，通常先加熱去除不耐熱的 K 抗原後才有利 O 抗原檢測。K 抗原又可細分為 L、A、B 三型(Orskov et al. , 1977)，L 型抗原是細菌的纖毛(菌毛)(Nowrouzian et al. , 2001)抗原，這類 K 抗原是引起菌血症(Blanco et al. , 1994)、新生兒腦炎(Kim et al. , 1992)以及尿道感染的重要致病因 9.

(20) 子(Connell et al. , 1996)；A、B 型則是細菌莢膜抗原，與細菌的致病能力有關，現鑑定出超過 100 種大腸桿菌 K 血清型(Jaypee, 2006)。. 圖一、大腸桿菌表面構造的示意圖，本圖修繪自[參七]. 大腸桿菌表面結構中重要的免疫抗原脂多醣分子(Rensen et al. , 2001)是由最外層親水的 O 抗原多醣鏈、連結用的核心多醣及與細胞外膜接合的脂質 A（lipid A）三部分所共同組合而成(見圖二)，脂多醣在與特定宿主細胞受體(如 CD14 受體)結合後，則會引發免疫反應 (Triantafilou et al. , 2000)。 O 抗原(O antigen)在脂多醣分子構造中最靠細胞外層，此多醣鏈是大腸桿菌表現抗原性差別最重要的結構，通常為數個至數十個寡糖 (通常以 2 至 7 個單糖形成的寡糖為一個重複單元(repeat unit))重覆連 10.

(21) 結形成的聚合物(Raetz & Whitfield, 2002, Stenutz et al. , 2006)。寡糖中單糖的種類、位置不同所造成排列方式和空間構型差異而進而造成 O 抗原具有其特異性，這些特異性使大腸桿菌得以適應不同生存環境 (Reeves, 1995)，例如藉由多樣的變異性保護細菌不受到免疫系統的調理作用傷害，其緻密分布於細菌表面也可阻擋一些會傷害細菌的物質滲透，或是為細菌表面一些易受宿主防禦機制辨識的蛋白質進行屏蔽，這些都使大腸桿菌更具生存上的優勢(Lugo et al. , 2007)。而核心多醣 (Core polysaccharide)一端經由葡萄糖殘基與 O 抗原相連；另一端由 2-酮-3-脫氧辛糖酸(2-keto-3-deoxyoctanoic acid ,KDO)殘基與脂質 A 共價聯結(Amor et al. , 2000)，大腸桿菌核心多醣結構不同可將其區分成五群 R1、R2、R3、R4，及 K12(Heinrichs et al. , 1998)。最內層的脂質 A(Lipid A)則為嵌在細菌外層膜上的疏水性構造，是內毒素 (endotoxin)所具生物毒性的主要部分，當大腸桿菌被宿主的免疫系統破壞時，其中的脂質 A 便會被從外層膜釋放出來，導致宿主產生腹瀉、發燒等不適症狀。脂質 A 並無種屬特異性，故不同細菌產生的內毒素毒性作用相似(Raetz & Whitfield, 2002)。. 11.

(22) 圖二、大腸桿菌脂多醣(Lipopolysaccharides，LPSs)的構造示意圖，本圖修自(Magalhaes et al. , 2007). 四、大腸桿菌感染途徑與症狀於衛生學檢驗實務上，因為很多經由糞便為病媒傳染的病原菌並不容易被檢驗，常需利用特殊的儀器與檢驗方法，或是需長時間培養才可進行鑑定，因此生物學家便以一個廣泛存在於生物體腸道內的代表性菌株─「大腸桿菌」作為檢驗食品飲水是否遭受糞便汙染的依據。 12.

(23) 大腸桿菌生長快速、易培養、及鑑定容易等特點，使得大腸桿菌成為一個優良的指標，用以鑑定樣本是否受到糞便汙染。大腸桿菌藉由宿主的糞便攜帶出體外污染食物及水源，所以一旦食品及飲水中出現大腸桿菌，意即此食品飲水直接或間接受到糞便污染而不再適合人們食用或飲用。食品與飲水的微生物檢驗主要是確保其未受到病人排泄物的污染，故食品中如被檢出大腸桿菌，依據衛生標準[參五]便會被衛生機關判定檢驗不合格，其原因並不是因為大腸桿菌會讓人生病(因為大多數大腸桿菌對人體是無害的)，而是代表該食品飲水曾受到糞便的污染，可能會對人體造成健康上的危害。因此在衛生檢驗上，大腸桿菌常被用做食品飲水衛生的檢定標準。而真正由病原性大腸桿菌所引發的疾病，可因感染位置不同分成兩類，一類為腸道內感染，另一則為腸道外感染。一般因大腸桿菌所引起食品中毒即為腸道內感染，潛伏期平均為數小時或數天，這類疾病主要所產生的症狀為發燒、噁心、嘔吐、腹痛、下痢、脫水及血便 [參六]，腸道感染大腸桿菌根據其致病機制不同主要可分腸產毒大腸桿菌(Enterotoxigenic E. coli；ETEC)、腸侵襲大腸桿菌(Enteroinvasive E. coli；EIEC)、腸致病型大腸桿菌(Enteropathogenic E. coli；EPEC)、腸出血型大腸桿菌(Enterohemorrhagic E. coli；EHEC)及腸聚集型大腸桿菌(Enteroaggregative E. coli，EAEC)(Nataro & Kaper, 1998)。 13.

(24) 腸道外大腸桿菌(Extraintestinal pathogenic E. coli，ExPEC)感染通常源自患者本身的正常菌叢，正常人體腸道中的大腸桿菌沒有致病性，但如果大腸桿菌進入膀胱或血流中，且人體抵抗力不足以對抗時則會引起疾病，其中以泌尿道感染(Urinary tract infection，UTI)及新生兒腦膜炎(Neonatal meningitis)最常見。泌尿道感染中大腸桿菌 (Uropathogenic E. coli，UPEC)是膀胱炎及腎盂炎最主要的致病菌 (Johnson et al. , 1998)，女性的泌尿道開口與肛門的距離接近，容易造成大腸桿菌沾黏繁殖引發泌尿道感染(Gupta & Stamm, 1999)。而造成泌尿道感染的大腸桿菌具有一些特性，首先它們表面可產生對表皮有強附著能力的構造，如纖毛(菌毛)，使其在尿液的沖刷下仍能與尿道表皮細胞緊密附著(Fagan et al. , 2008)；另外這類大腸桿菌會產生溶血素破壞宿主細胞，並對於抗生素治療有較強的耐受性(Auer et al. , 2010)。而新生兒因免疫系統未發育完全抵抗力較弱，易受細菌侵襲導致腦膜炎，大腸桿菌(Neonatal meningitis E. coli，NMEC)(Tivendale et al. , 2010)侵襲是新生兒出生後所引發腦膜炎的主要致病病因，致死率很高。而在臨床治療中，大腸桿菌是院內感染主要病原之一，敗血症、肺炎與內毒素性休克很多都為其所造成。. 14.

(25) 五、現行國家標準檢驗方法台灣現行用以檢驗食品中大腸桿菌檢驗方法是依據「中華民國國家標準：食品微生物檢驗法─大腸桿菌之檢驗」(CNS10951/N6192，簡稱 CNS 法)的檢驗方法，其操作流程圖可見(圖三)。依照流程中各檢驗步驟操作完畢後，檢體被判定為大腸桿菌陽性者其檢驗結果應符合以下幾點： (1)格蘭氏染色陰性、且無產生芽孢者；(2)IMViC 試驗中：吲哚試驗陽性；甲基紅試驗陽性；歐普氏試驗陰性；檸檬酸利用試驗陰性；(3) 乳糖產氣試驗為陽性反應者。以上三個結果皆符合者判定為大腸桿菌菌株，整個檢驗過程總需耗時八天左右(180~190±6 h)。另外在檢體原本所含菌數推定方面，實驗流程第(3)步驟中藉由系列稀釋及培養後，觀察其是否產氣，再依結果比對 MPN 統計對照表即可推算出原樣品中所含的細菌濃度，這個方法稱為最確數(Most probable number，MPN)檢定，最確數法是傳統培養方法中常使用的細菌計數方法。. 15.

(26) 圖三、大腸桿菌國家標準檢驗流程圖. 16.

(27) 六、其他大腸桿菌偵測方法根據(圖三)可知現今國家標準檢驗法檢驗所需要的時間很長，往往檢驗完成前，病原早就已經對患者造成傷害，更不用說檢驗期間造成的人力及資源耗損。故現今許多研究者都開始開發新的檢驗方法，以求更快速、便利的檢驗出樣品中所含細菌種類及其存在的數目。而現今大腸桿菌檢測方法大致可分成種菌塗盤檢測培養、聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction, PCR)及免疫分析法(Immunoassay）三類：種菌塗盤檢測培養(March & Ratnam, 1986)是目前檢驗機構最常使用的方法，但卻也最耗費時間、人力及物力。這些方法常需使用不同的選擇性培養基，將所要檢驗的細菌樣品接種其中，靠著細菌與培養基作用後所產生的各種生化反應現象來判定樣品中所含有的菌種，並仰賴系列稀釋方式得知原樣品內細菌的數量。API 20E (Nucera et al. , 2006)檢驗模組就是把許多不同的鑑別試驗整合於一個模組上，讓研究人員使用上較為方便。聚合酶鏈反應(PCR)(Liu et al. , 2008)生物檢定方法，首先會挑選出大腸桿菌內會產生較保守蛋白質的基因片段，如產生β -D-glucuronidase 基因 (Daly et al. , 2002)、產生 rRNA 的基因結構 (Sabat et al. , 2000, Maheux et al. , 2009)、或與生物呼吸作用相關的基 17.

(28) 因，例三羧酸循環(Tricarboxylic acid cycle，TCA cycle) (Alteri et al. , 2009)的相關酵素基因等皆常被選用來做為 PCR 放大的目標基因。而有些特殊血清型的大腸桿菌會產生其他大腸桿菌所不會產生的基因產物，這類大腸桿菌就常以其產生特殊產物的基因片段為來進行檢測，如 O157:H7 產生類志賀桿菌毒素的 Shiga-like toxin(Stx)基因(Paton & Paton, 1998, Fode-Vaughan et al. , 2003)。接著就針對這些基因設計引子供作 PCR 放大使用，聚合酶鏈反應一開始，以高於 90°C 處理使大腸桿菌 DNA 雙股分離，待設計好的引子與目標基因結合後，再利用 DNA 聚合酶依模板股由引子端開始聚合，如檢測樣本內有選定的基因片段存在，經過一系列反覆擴增放大所選定的 DNA 片段，即可得到大量放大片段被偵測到，藉此推斷出樣本中是否有大腸桿菌存在。而以抗體為基礎的細菌偵測法中最常見的就是酵素免疫分析法 (Enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA)，藉由抗體的對細菌專一性結合，配合結合於抗體上的酵素與受質反應呈色。因為抗體只會與特定的細菌結合，所以抗體與細菌結合數目會影響到顯色深淺，因此分析訊號的強度，即可知道樣品中所含細菌種類及數目關係。檢驗中有時會使用三明治酵素免疫分析法(Sandwich ELISA)，此法首先在 ELISA 盤上 coating 一層專一性抗體，接著加入待測樣品，第一層抗體將會專一性吸附樣品中的特定抗原，經過清洗去除未吸附的抗原及 18.

(29) 其他物質後，再加入標記有酵素或螢光等訊號物且會吸附於上述抗原的專一性的抗體做為第二層，再次清洗去除未接上的第二層抗體後進行顯色定量。 ELISA(Lazcka et al. , 2007, Park et al. , 2008) 之外，抗體也應用於許多新的檢測分析法上。除透過改變抗體上標定物，如使用化學冷光 (Liu et al. , 2007)、螢光(Zhao et al. , 2004)或奈米金(Serra et al. , 2008)、奈米球(含顯色物)(Su & Li, 2004, Chen & Durst, 2006)等進行呈色或顯色反應，使檢測得以顯現更強的訊號外。很多研究也開始探討是否能藉由其他物理化學特性使偵測得以獲得更加優良的訊號，如免疫磁分離技術(Immuno-magnetic separation, IMS)(Chen et al. , 2008, Ravindranath et al. , 2009)就是一種將抗體固定在磁珠上，與樣品混合後抗體專一性吸附特定抗原後，再利用磁力吸引將其與其他物質分離，去除基質及未附著的抗體後偵測抗體原本標定的訊號物所表現的訊號，藉此分析樣品中的組成物，這個方法用在分析成份複雜的樣品時，可有效的減少基質干擾的問題；另現在還有使用免疫磁減量 (Immuno-magnetic reduction，IMR)方法，利用上述磁性抗體與抗原結合後，彼此間再聚合形成磁性粒子叢集，造成磁性粒子變大，藉由測量因這些磁粒子叢集形成而改變的磁性大小，探知待測樣本中抗原的濃度。而有些檢測將免疫分析法與電化學方法結合應用，藉三明治酵 19.

(30) 素免疫分析法的概念，在偵測電極上披覆一層可吸附細菌菌體的抗體，加入菌體吸附後，再加入第二層上標定有可產生氧化還原反應酵素 (如山葵過氧化酶(Horseradish peroxidase，HRP))的菌體專一性抗體，經過清洗過程後，吸附於菌體上的第二層抗體標定的酵素即可與雙氧水產生氧化還原反應產生水、氧及電子，電子轉移所產生的電流訊號便可被電極偵測，讓我們得以進一步分析(Liu et al. , 2003, Lin et al. , 2008)。也有利用抗體與抗原結合反應以及 PCR 放大原理兩者結合後來偵測細菌，先將對菌體具有專一性的抗體與經過設計同時具有酵素切割位以及 PCR 模板股的 DNA 片段結合，這樣在抗體與菌體結合清洗去除未附著的抗體後，加入切割酵素使 DNA 模板股釋出，離心取上清液進行 PCR 反應，藉放大基因片段所需時間推估原有片段數，進一步估計原有細菌濃度(He et al. , 2011)。其他的研究也有利用物體表面被不同物質覆蓋時會產生不同電性關係的表面物理技術進行偵測，如表面電漿(Surface plasmon resonance，SPR)(Mazumdar et al. , 2007, Naja et al. , 2007, Torun et al. , 2012) 。也有將抗體與碳奈管或金奈米短棒結合，藉由其類似電極的特性，而如其覆上菌體後會影響其電阻來進行偵測(Fu et al. , 2008, Singh et al. , 2009) (Cheng et al. , 2008)。另有研究藉噬菌體(bacteriophage)對細菌具有專一性的特性取. 20.

(31) 代檢測中抗體的地位(Galikowska et al. , 2011, Tawil et al. , 2012)來進行偵測實驗。近期大腸桿菌偵測分析法文獻比較可見(表二)。在比較過以上方法後，細菌培養方法除準確性佳外，所需耗費的時間、人力物力及空間都是相當可觀的，且因為操作過程中有增菌培養的過程，如一開始沒有使用需經繁瑣系列稀釋的 MPN 檢定法就無法回推增菌前的濃度，故多半用於菌種鑑定而無法進行準確定量。而一般 PCR 方法的好處是其反應快速，可在數小時內完成，且可同時處理大量細菌受測樣品。但 PCR 偵測方法具有引子選擇不佳造成無法與目標細菌模板股配對的困擾，或是菌體樣本所存在基質太過複雜而干擾 PCR 偵測靈敏度及正確性的問題存在(He et al. , 2011)。免疫檢測方法大多具有操作簡單、耗費時間較短的優點，所耗費的人力物力與傳統培菌方法相比可大幅下降。且抗體的高專一性得以於複雜的樣品組成中偵測我們所要的菌種，也因操作簡單及所需耗材少，對於檢測樣品數目多時更有益處。. 21.

(32) 七、研究目的大腸桿菌是引發食物中毒的主要病原之一，主引起腸胃不適，嚴重者則可能導致死亡或擴及感染他處，故如能於大腸桿菌導致疾病前即檢出病原的存在與否，將得以減少對我們健康的威脅及社會經濟的損失，有鑒於此發展大腸桿菌的快速偵測方法已成為重要的課題。在各種偵測方法中，我們對於免疫偵測方法的開發很有興趣，而想開發免疫偵測法抗體是不可或缺的重要工具，單株抗體的製備是將免疫注射後小鼠的脾臟細胞與骨髓瘤細胞(myeloma cell)進行細胞融合，所產生的融合瘤細胞(hybridoma cell）便可不斷增生，且同時具有分泌抗體的能力(Kohler & Milstein, 1975)。如此製備出之單株抗體由於只辨識特定的表位，故對抗原的辨識較多株抗體來的專一。本研究的目的在於生產大腸桿菌單株抗體，並通過一系列經過設計的實驗及篩選，依其專一性進行分群，並分析各株抗體的特性，藉此判斷這些抗體於檢驗或是基礎研究上的應用價值。最後我們以研究中所生產的抗體來進行免疫偵測法的初步改良，期待能發展成為一個新的檢驗模式，對因現行繁瑣檢驗方法所產生的問題提供新的解決辦法。. 22.

(33) 表二、近期大腸桿菌抗體偵測分析法文獻比較文獻. 偵測方法. 目標菌種. 分析時間. 偵測極限. (Zhao et al. , 2004). 單株抗體標定奈米螢光粒子與細菌結合，進行流式細胞儀偵測. E. coli. 小於 20 分鐘. 1 – 400 cells. (Mathew et al. , 2004). 使用標有化學冷光的抗 β-galactosidase enzyme 抗體，以冷光儀偵測. E. coli. 0.5 小時. 102～105 CFU/mL. (Nyquist-Battie et al. , 2005). 直接將大腸桿菌 coating 於 96 孔盤上進行 ELISA(QuantBlu substrate). E. coli. 2 小時. 105～107 CFU/mL. E. coli. 1~2 小時. <103 CFU/mL. E. coli, Yersinia, Salmonella, Listeria. 4~5 小時. 104～105 CFU/mL. E. coli. 1.5 小時. 8～104 CFU/mL. E. coli. 1.5~2 小時. 1 CFU/mL(有其他菌存在干擾下為 102 CFU/mL). (Torun et al. , 2012) 附微鐵球抗體收集大腸桿菌，以表面電漿(SPR)檢測. E. coli. 2 小時. 30～3×104 CFU/mL. 以噬菌體(T4)取代抗體，專一性吸附大腸桿菌，以 SPR 檢測. E. coli. 1 小時. 7×102～7×108 CFU/mL. (Frank et al. , 2007) 以生物冷光(Bioluminescence)標定之抗體顯色，以冷光儀偵測 (Magliulo et al. , 2007). 經增菌培養後，以三明治式 ELISA 檢測. (Choi et al. , 2008, 以標有微鐵球的抗體收集細菌，以標有 Guven et al. , 2011) 黃金微短棒的抗體產生 IMS 訊號 (Sanvicens et al. , 2011). (Arya et al. , 2011). microarray 上抗體先吸附菌體，然後以標有 Quantum dots(螢光)的抗體顯色. 23.

(34) 貳、研究材料與方法一、抗原的製備： 1. 大腸桿菌菌數定量方法測試：將 Escherichia coli（ATCC 11775; BCRC 10675）於 Luria-Bertani (LB)培養液(配方見附錄二)中培養，測量 600 nm 的吸光值，利用細菌濃度與吸光值的關係推算出所菌數總量(大腸桿菌標準為 OD600=1 時，菌量約為 109 CFU/mL)，並輔以系列稀釋塗於 LB 盤上觀察實際菌落數。 2. 大腸桿菌超音波破菌條件測試：實驗中以超音波處理大腸桿菌細胞，使其於超音波下破裂成小片段，藉此殺死大多數細菌並希望以最少的步驟及不使用化學處理方式取得大腸桿菌抗原進行免疫注射。首先將大腸桿菌使用 LB 培養液培養至 OD600 約 1.0，菌液經 4℃、2000g 離心 5 min 去除上清液，加入 PBS buffer 清洗後再次離心去除上清液，以無菌 PBS(配方見附錄三)回溶成 1010 CFU/mL 濃度。取菌液 0.5 mL 於微量離心管中，離心管置於冰浴上，超音波均質機 (Ultrasonic cell disruptor XL)探針震盪端伸入約一半液面深度處，以超音波功率 6W，進行 4 次(震盪 20 秒，休息 40 秒)超音波破菌處理，測其每次破菌處理後之 OD600 吸光值變化，並取 5 µL 菌液系列稀釋塗盤，觀察菌落生長數，並與未破菌前總菌量合併推算其經超音波破菌後存活率，其餘破菌菌液則進行 Bradford assay 蛋白質濃度定量及冷凍保存供作抗原用。 3. 蛋白質定量：使用 Bradford assay 方法進行蛋白質定量分析，以 Bovine serum albumin (BSA) (Sigma A7960)為標準品，將標準品與大腸 24.

(35) 桿菌超音波破菌樣本進行系列稀釋後，各取 50 µL 加入 96 孔盤中，再各加入 200 µL Bradford reagent(配方見附錄三），靜置後，以 ELISA reader 讀取波峰 595 nm 之吸光值。比對其所測出數值落於標準品所做出的標準曲線位置，即可推算出破菌樣本內所含蛋白質濃度。. 二、單株抗體製備 1. 小鼠免疫注射：生產單株抗體實驗由小鼠免疫注射開始，第一次免疫注射將經超音波破菌處理內含細菌濃度為 7.5×108 CFU (75 μL) 之大腸桿菌菌液為抗原，加入 75 μL Freund’s Complete Adjuvant 為佐劑，將抗原與佐劑進行乳化後，對三隻 6 周大 Balb/c 雌鼠進行六針皮下注射(每針 20 µL)及一針腹腔注射(每針 30 µL)；相隔一個月，再注射第二針，抗原為同第一次注射，但其中改加 75 μL Incomplete Adjuvant 為佐劑，同樣混勻後注射；再隔兩週，進行第三次注射，抗原為前兩次劑量減半(3.75×108 CFU )，不加任何佐劑，並於沸水中煮沸 5 分鐘後注射。. 2. 小鼠脾臟細胞與骨隨瘤細胞融合：最後一次注射完成後三天，將小鼠頸椎脫臼法犧牲後，以針筒刺入心臟採鼠血作為正對照組血清。接著小鼠以 70%酒精充份浸潤後移至無菌操作台。以無菌手術工具取出小鼠脾臟，後輕壓破脾臟，並以 Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) (GIBCO 12200-036)沖洗出脾臟內部細胞至 IMDM 中，取其中 100 µL 於血球計數器下計算細胞數量，其餘 IMDM 洗出液以 25.

(36) 500 g 離心 5 分鐘後，倒去上清液，保留底部脾臟細胞，以 7： 1 的比例將其與懸浮於 IMDM + 20%胎牛血清(Fetal calves serum, FCS)( Hyclone SH30071.03)的骨髓癌細胞（myeloma cell）充分混合，並以 500 g 離心 5 分鐘後，倒去上清液，收取沉澱。把含沉澱物之離心管底部浸於 37℃水浴中，在 2 分鐘內緩慢加入 0.7 mL PEG1500 (Boehringer Mannheim 783641)開始進行細胞融合，同時輕輕搖晃離心管使 PEG 1500 與細胞得以充份混合。隨後於 2 分鐘內緩慢加入 15 mL IMDM 以中止融合反應，再以 500 g 離心 5 分鐘後，倒去上清液，細胞則重新懸浮於 50 mL IMDM+20%胎牛血清+10% HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) (Sigma H0262)的培養液中，分別滴於已有小鼠腹腔巨噬細胞(macrophage cell)作為餵養細胞(feeder cell)的 96 孔培養盤中，置於培養箱中，以 37℃及 5% 二氧化碳濃度培養約 10 天後進行融合瘤細胞株篩選。所取鼠血放置於 4℃過夜，吸取上層血清，以 4℃、15000 g 離心 5 分鐘澄清化，加入 0.02% NaN3 保存，作為抗體正對照組使用。. 3. 融合瘤細胞株篩選與單株化： (1) 酵素免疫分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay , ELISA)：先將 1010 CFU/mL 以超音波處理大腸桿菌菌液經 5 分鐘煮沸處理，以 borate saline(配方見附錄三)稀釋成 108 CFU/mL，並將此稀釋液 50 µL/well 於 4℃下使其 coating 於 96 孔盤盤底隔夜。經 ELISA wash buffer(配方見附錄三)清洗 2 次後，加入 180 µL ELISA blocking buffer(配方見附錄三) 26.

(37) 於室溫下兩小時。再以 ELISA wash buffer 清洗 2 次後，將 50 µL/well 融合瘤細胞之培養液為一級抗體加入反應 2 個小時。ELISA wash buffer 清洗 2 次，以 50 µL/well 將用 ELISA diluents buffer(配方見附錄三)5000 倍稀釋之 RAM-AP(Sigma A4312)為二級抗體加入反應 2 個小時。清洗 2 次後，最後以 pNPP(p-Nitrophenyl Phosphate) substrate 進行呈色反應 1 個小時，偵測 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量。取吸光值相對正對照組(1000 倍稀釋經抗原注射小鼠血清)高的細胞株繼續培養。 (2) 細胞單株化：依限數稀釋法，以 IMDM+20%胎牛血清+10% HT(Hypoxanthine Thymidine)培養基將所篩出將單株化的融合瘤細胞每株稀釋在 6.5 mL 培養基中，使其內約有 63 個細胞，均勻滴在含 Feeder cell 的 96 孔細胞培養盤中。於培養箱中以 37℃及 5%二氧化碳濃度培養約 10 天。挑出一個孔洞只生長一個細胞團的孔洞，吸取其中的培養液做 ELISA 試驗篩選。篩選出有訊號的細胞株即可開始大量培養以收取培養基進一步純化，培養液須經 500 g 離心 5 分鐘澄清化處理，並加入 0.02%的 NaN3 保存。. 三、單株抗體純化與分析： 1. 大腸桿菌單株抗體 Isotyping：在此使用 Isotyping kit(Southern Biotechnology Association 生產 5070-04)進行大腸桿菌單株抗體 Isotyping，首先於 96 孔盤中加入 50 µL 3 µg/mL 稀釋於 borate saline 中的 27.

(38) goat-anti-mouse(GAM)抗體(Sigma A1418)，在 4℃下進行隔夜 coating。清洗後 blocking 兩小時，再次清洗後以 50 µL/well 大腸桿菌單株細胞培養液為一級抗體反應一小時，清洗後再以 500 倍稀釋的 GAM-AP、GA-IgG1-AP、GA-IgG2a-AP、GA-IgG2b-AP、 GA-IgG3-AP、GA-IgM-AP、GA-κ-AP、GA-λ-AP 50µL/well 為二級抗體加入反應一個小時，清洗後加入 pNPP substrate 進行呈色 30 分鐘，於光電比色計中讀取 405 nm 減去 490 nm 的吸光值的差量。. 2. 大腸桿菌單株抗體的濃縮及 Protein A/G 親和性管柱純化：將融合瘤細胞培養之培養液進行 50%硫酸胺沉澱之後，將沉澱回溶於相當 1/20 原體積之 PBS 中，澄清化處理後通入 Protein A/G 親和性管柱純化。以 10 倍 protein A/G(Pierce 製造 20422)膠體體積之 PBS buffer 流過管柱進行清洗，接著以 2 倍膠體體積 pH 2.5 的 Gly-Cl 溶液進行假流洗(fake elution)後，再以 20 倍膠體體積之 PBS 清洗管柱。將經過澄清化處理之濃縮培養液通過 protein A/G 管柱，其流出液需保留以進行下一輪純化，再以約 20 倍體積之 PBS 通過管柱清洗，將未專一性結合於膠體上之蛋白洗除，其流出液需保留。使用 2 倍膠體體積之 pH 2.5 的 Gly-Cl 溶液進行流洗並以每 1 mL/tube（每管事先加入 0.2 mL 之 pH8.5 的 Tris-Cl 溶液）收集流出液，待 Gly-Cl 溶液流完則加入 PBS 繼續收集，約收集 10 管後再以 20 倍膠體體積之 PBS 流過清洗管柱。測量每管收集液 OD280 吸光值，並將吸光值超過 0.036 之收集液統一收集。將已通過管柱之濃縮培養流出液再重複進行以 28.

(39) 上通管柱、清洗、流洗、清洗的過程，直到其中一批收集液中吸光值最高的一管低於 0.1 後，將流出的培養液再進行一次 50% 的硫酸銨沉澱，再次濃縮為 1/20 體積，經澄清化後再次重複進行管柱純化流程，直到某批收集液中吸光值最高的一管再次低於 0.1 即可停止。將所有收集液集中後，進行 50%硫酸銨沉澱，最後盡量以最少體積的 PBS 進行回溶(依經驗估計盡量讓抗體濃度約為 2 mg/mL)。澄清化後，取出 100 µL 進行 6 倍稀釋，測其 OD280 值以下列公式換算出抗體的濃度，並加入 0.02% NaN3 分裝待用。. C=. A ε∙b. C. ：抗體濃度(mg/mL). A ：280 nm 吸光值 ε. ：抗體消光系數 1.36 (cm-1 mg -1 mL). b. ：光徑長 1 (cm). 3. 大腸桿菌單株抗體對不同菌株專一性分析：本試驗使用的 11 株細菌中，Escherichia coli（ATCC 11775； BCRC 10675）、Bacillus subtilis（BCRC 10255）、Shigella sonnei （BCRC 10773）、Salmonella enterica serovar Enteritidis（BCRC 10744）、Salmonella enterica serovar Typhimurium（BCRC 10747）、 Staphylococcus aureus（BCRC 10781）、Vibrio parajaemolyticus （BCRC 10806）、Streptococcus dysgalactiae（BCRC 12577）皆來自生物資源保存與研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)，而 Listeria monocytogenes 則為台北市衛生局檢驗室由食品檢體中分離出的菌株，Klebsiella 29.

(40) pneumoniae 為環保署環境檢驗所分離出的菌株，Pseudomonas flurescens 為本實驗室自己分離出的菌株。各菌種所使用的培養液，Bacillus subtilis、Vibrio parajaemolyticus 及 Shigella sonnei 三種菌種以 neutrient broth(NB) (配方見附錄二)培養，Vibrio parajaemolyticus 的培養液因其為嗜鹽菌而要添加 3%的 NaCl，其餘菌株則皆以 Luria-Bertani (LB)培養。生長溫度，除 Vibrio parajaemolyticus 及 Pseudomonas flurescens 培養於 28℃外，其餘皆於 37℃下培養。本實驗第一次試驗選用的 8 種菌株養至 OD600=1.0 時，經 PBS 離心清洗過後回溶為 5×109 CFU/mL，以超音波破菌處理 6W，4 次(震盪 20 秒，休息 40 秒)處理後煮沸 5 分鐘殺菌。以 borate saline 將菌液稀釋至 108 CFU/mL 加入 96 孔盤中，置於 4 ℃過夜。以 9 株不同大腸桿菌單株抗體培養液進行試驗； negative control 用的是 Mab-Osm 單株抗體；E dil.用的是 ELISA 抗體稀釋液。二級抗體則使用 1/5000 稀釋的 RAM-AP，實驗呈色反應 1 小時後偵測 405 nm 與 490nm 吸光值的差量。本實驗第二次試驗改選用的 11 種菌株養至 OD600=1.0 時，經 PBS 離心清洗過後回溶為 1010 CFU/mL，以超音波破菌處理 6W，4 次(震盪 20 秒，休息 40 秒)處理後煮沸 5 分鐘殺菌。以 borate saline 將菌液稀釋至 108 CFU/mL 加入 96 孔盤中，置於 4 ℃過夜。以 9 株不同大腸桿菌單株抗體進行試驗；negative control 用的是 MA-Sal 單株抗體；E dil.用的是 ELISA 抗體稀釋液。二級抗體則改用 10000 倍稀釋的 GAM-AP，實驗呈色反應 1 小時後讀偵測 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量。 30.

(41) 4. 大腸桿菌單株抗體結合大腸桿菌細菌顆粒能力分析： (1) 福馬林固定方法測試：將大腸桿菌養於 LB 培養液中至 OD600=1，再以 1000 g、 4℃、10 min 離心去除上清液後收取沉澱物(菌泥)，沉澱物回溶至 EPBS 中，再次以 1000 g、4℃、10 min 離心後收取沉澱，重複回溶、離心步驟兩次。沉澱物回溶於 0.5%福馬林溶液(36%原液稀釋 72 倍於 EPBS 中)中。將其置於培養箱中以 37℃，200 rpm 震盪 24 小時後離心收取沉澱物，並以 0.22 µm 濾膜過濾之 EPBS 回溶清洗沉澱物，再次以 1000 g、 4℃、10 min 離心後收取沉澱，重複回溶、離心步驟兩次。回溶沉澱於經 0.22 µm 濾膜過濾之 EPBS，取其中 5 µL 做 LB 液態培養(查看是否存活)，並 coating 108 CFU/mL formalin-fixed 大腸桿菌於 96 孔盤上進行單株抗體 ELISA 測試，使用之一級抗體為 I-1 ~ I-5 共 5 株抗體。 (2) 大腸桿菌活菌免疫沉澱試驗：將大腸桿菌養於 5 mL LB 培養液中至 OD600=1.0，接著分裝成 1 mL/tube，並以 2000 g、4℃、5 min 離心去上清液後收取菌泥。回溶沉澱至 1 mL EPBS 中清洗菌泥，再次以 2000 g、4℃、5 min 離心收取沉澱，重複回溶、離心步驟兩次。去上清液後每管各加入 25 µg 的單株抗體(I-1 ~ I-6、II-1 ~ II-3，共 9 株)，並將每管體積以 EPBS 調整成最後體積 200 µL，置於 28℃下震盪反應 2 小時後以 2000 g、4℃、5 min 離心收取沉澱物，將之回溶至 1 mL EPBS 中，再次以 2000 g、 4℃、5 min 離心收取沉澱重複回溶、離心步驟兩次。沉澱物加入 100 µL 2 倍 SDS sample buffer 回溶，加熱煮沸 5 min 31.

(42) 後，接著以 16500 g 離心 5 min，收取離心後上清液，各取 5 µL/lane 以 120 V 的電壓進行 12% SDS-PAGE 電泳，之後進行 electroblotting 將膠上物質以 40 V 電壓轉漬至 NC membrane 上 35 分鐘。將此 NC 膜以 ELISA blocking 溶液中於室溫 blocking 1 個小時後，以然後以 ELISA wash buffer 清洗後再以 5000 倍稀釋的 RAM-AP 做為一級抗體反應 1 個小時，清洗後以 33 µL BCIP 及 66 µL NBT 受質加入 10 mL Western substrate buffer(配方見附錄三)進行反應呈色。. 5. 大腸桿菌 O-antigen(LPSs)萃取及單株抗體所辨識抗原是否為 LPS 分析：參考文獻後採用 phenol-water-extraction 萃取法(Koga et al. , 1985, Ronholm et al. , 2011)，將大腸桿菌經隔夜培養後，並以 PBS 清洗並以 2000 g 離心 5 分鐘後去上清液，重複過程三次，後回溶於與初始體積相等的滅菌水中，置於 70℃水浴槽中水浴 10 分鐘，加入等體積預熱至 70℃的 90%苯酚，於 70℃水浴之下劇烈搖晃 20 分鐘(需確認劇烈搖晃後水層與苯酚層互溶不再分層)，接著迅速降溫至 10℃，再以 5000 g 於室溫下離心 10 分鐘。取上部水層保存，並將苯酚層加入等體積的滅菌水後，於 70℃水浴之下依前述步驟進行再次進行萃取，冷卻離心後，亦抽取水層保留。將兩次萃取的水層混合收集，對二次水透析隔夜，後進行冷凍乾燥，最後以二次水回溶使用。步驟示意圖如圖四：. 32.

(43) 圖四、大腸桿菌 LPSs 萃取示意圖. 取 10 µL LPSs 萃取物，與 5 μL 三倍的 SDS sample buffer 對混，於沸水中煮沸 5 分鐘，加入單槽膠片中，以 120 V 電壓進行 12%的 SDS-PAGE 電泳後，隨後進行 electroblotting 將膠上的物質以 40 V 電壓轉漬到 NC membrane 上 40 分鐘。將轉好的膜以 ELISA blocking buffer 於 4℃浸泡隔夜，垂直切割成寬約 3 mm 條狀後，經過 ELISA wash buffer 浸泡清洗 15 分鐘兩次後，每條各以 10 μg/mL 9 株大腸桿菌抗體 300 µL 為一級抗體反應 1 個小時，經過浸泡清洗後以 ELISA diluent 稀釋 10000 倍之 GAM-AP 300 µL 為二級抗體反應 1 個小時後進行浸泡清洗，接著以 Western substrate buffer 浸泡 15 分鐘，最後以 NBT 及 BCIP 受質呈色約 5 分鐘至 30 分鐘。. 33.

(44) 6. 大腸桿菌單株抗體的效價分析：本實驗以 108 CFU/mL 經超音波破菌處理的大腸桿菌為抗原，於 4℃下 coating 隔夜，一級抗體使用 50 µL/well 9 株大腸桿菌抗體分兩組(I-1 ~ I-6 一組、II-1 ~ II-3 為一組)各以 5 種不同濃度(10 µg/mL、1 µg/mL、0.1 µg/mL、0.01 µg/mL 及 0.001 µg/mL) 進行試驗；negative control 用的是沙門氏菌專一性單株抗體 MA-Sal。二級抗體則用 1/10000 稀釋的 GAM-AP，實驗呈色反應 1 小時後讀偵測 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量。. 7. 不同抗體株間競爭性測試(Competitive ELISA)：本實驗以四株(I-1、I-2、I-3 及 I-5)濃度 1 µg/mL 的大腸桿菌抗體為一級抗體。而以經超音波破菌且煮沸 5 分鐘處理濃度為 106 CFU/mL 的大腸桿菌為抗原；negative control 用的是沙門氏菌專一性單株抗體 MA-Sal。一級抗體實驗組，分別將四株 1 µg/mL 的大腸桿菌單株抗體各 50 µL 兩兩配對(I-1 與 I-2、I-1 與 I-3、I-1 與 I-5、I-2 與 I-3、 I-2 與 I-5 及 I-3 與 I-5，共六組)加入同一孔內(共 100 µL)；對照組則以 1 µg/mL 的大腸桿菌單株抗體各 50 µL 與 ELISA diluent 溶液 50 µL 混合(當成 1 倍)，以及 1 µg/mL 的大腸桿菌單株抗體各 100 µL(當成 2 倍)，反應一個小時。二級抗體則是以 10000 倍稀釋之 GAM-AP 反應一個小時，最後以 pNPP substrate 呈色一個小時，實驗呈色反應 1 小時後用光電比色計讀取 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量。. 34.

(45) 四、免疫分析方法的開發 1. Direct ELISA 的分析：本試驗測試經煮沸處理是否能將全菌抗原之檢測極限降低，首先將大腸桿菌培養至 OD600 約等於 1.0 的菌液，以 3000 g、4 ℃離心 10 分鐘後除去上清液，加入等體積 PBS 回溶，後分成兩組，一組經過煮沸處理 5 分鐘後以 borate saline 稀釋為 103 至 108 CFU/mL，另一組則不經煮沸直接稀釋相同的倍率，直接將兩組稀釋好的菌液以 50 µL/well coating 於 96 孔盤中，置於 4℃ 下隔夜。以 ELISA wash buffer 清洗兩次後，再加入 1 µg/mL 大腸桿菌單株抗體 I-5 為一級抗體反應 1 個小時。再經清洗，加入 1/10000 稀釋之 GAM-AP 為二級抗體反應 1 個小時。清洗完，以 50 µL/well 加入 pNPP substrate 呈色 1 個小時，用 ELISA reader 讀取 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量。接著試驗測試使用到三級抗體能否將檢測極限降低，首先將大腸桿菌培養至 OD600 約等於 1.0 的菌液，以 3000 g、4℃離心 10 分鐘後除去上清液，加入等體積 PBS 回溶，煮沸處理後以 borate saline 稀釋為 102 至 107 CFU/mL，將稀釋好的菌液以 50 µL/well coating 於 96 孔盤中，置於 4℃下隔夜。以 ELISA wash buffer 清洗兩次後，再加入 1 µg/mL 大腸桿菌單株抗體 I-5 株為一級抗體反應 1 個小時。再經清洗，加入 1/5000 稀釋之 RAM-AP 為二級抗體反應 1 個小時。清洗完後分成兩組，一組到此先保存，另一組則加入 1/5000 稀釋之 GAR-AP(Sigma A3687)為三級抗體反應 1 個小時。兩組皆清洗完，以 50 µL/well 加入 pNPP substrate 呈色 1 個小時，用 ELISA reader 讀取 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量。 35.

(46) 2. Microfuge tube immunoassay 的分析：取 1.5 mL 微量離心管(Microfuge tube)，加入 1.5 mL ELISA blocking buffer，置於 4℃下 blocking 隔夜，後將 ELISA blocking 溶液甩乾。於微量離心管中分別加入經 5 分鐘煮沸處理的大腸桿菌菌液稀釋成 103、104、105 及 106 CFU/mL 四種濃度各 1.5 mL/tube，以 10000g、4℃離心 5 分鐘後，輕倒除去上清液，加入 1.5 mL ELISA wash buffer 後以 10000 g、4℃離心 5 分鐘後，輕倒除去上清液並倒置微量離心管置於紙巾上將殘留液體吸乾。然後把 10 µg/mL 大腸桿菌單株抗體(一級抗體)、5000 倍稀釋之 RAM-AP(二級抗體)及 5000 倍稀釋之 GAR-AP(三級抗體)各 50 µL 同時加入，將離心管置於 28℃下震盪反應 1 個小時，以 10000 g、4℃離心 5 分鐘，倒去上清液後加入 1.5 mL ELISA wash 溶液離心清洗兩次，最後倒置於紙巾上吸乾殘存液體。於每管內加入 pNPP substrate 各 100 µL，混勻後於置於 28℃下震盪反應一個小時，每管吸出 50 µL 加入 96 孔盤中，以光電比色機偵測 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量，實驗操作示意圖如(圖五)。. 36.

(47) 圖五、Microfuge tube immunoassay 實驗步驟示意圖. 37.

(48) 參、結果一、抗原的製備超音波破菌條件測試：本試驗用以測試如何以超音波處理可以使得未被超音破震碎的大腸桿菌活菌數降到最低，並使大腸桿菌菌體內所含的各種免疫原物質得以最大量釋出，在此運用偵測釋出蛋白質的量作為偵測基準。由（圖六）可知當以超音波功率 6W 進行破菌處理時，隨著超音波破菌的次數增加，OD600 吸光值越來越低，細菌的存活率也越來越低。當破菌處理超過 3 次後，OD600 吸光值變化幾乎穩定；而破菌處理超過 4 次後，細菌存活率則低於百萬分之一；蛋白質釋出總量也趨近穩定。由結果可知，以超音波功率 6W，進行 4 次(每次震盪 20 秒，休息 40 秒)超音波破菌處理，大部份的細菌皆被打破，故再增加處理次數也不會增加破菌效率。以此大腸桿菌破碎物為抗原進行小鼠免疫注射以生產單株抗體。. 38.

(49) 圖六、超音波破菌條件測試研究超音波處理次數與大腸桿菌破菌效果的關係，以破菌處理過後的 OD600 吸光值變化及蛋白質釋出量作為破菌程度指示。(a) 為超音處理次數與 OD600 吸光值變化關係；(b)為超音波處理次 39.

(50) 數與細菌存活率關係曲線(存活率=破菌處理後塗盤所計算出之活菌數除以處理前活菌數的百分比)；(c)為超音處理次數與釋出蛋白質總量變化關係。圖中每個資料點均為三個重複樣品(n=3) 的平均值±標準差。. 二、單株抗體的製備本次實驗單株抗體篩選過程中，篩選出的細胞株數與呈陽性反應的細胞株數如（表三），經融合後滴於 96 孔盤中的培養，其中有 24.2%有融合瘤細胞團落生成，接著以超音波破菌煮沸處理的菌液為抗原進行篩選，篩選結果篩選出 30 株有較強訊號的細胞株，並於其中挑選出生長良好的細胞株 12 株進行單株化過程，最後成功生產出九株可產生對經超音波破菌及煮沸處理大腸桿菌抗原有顯著訊號反應的單株抗體融合瘤細胞株來生產單株抗體，接著收集細胞株培養液供作抗體純化用。表三、製備大腸桿菌單株抗體的各階段結果篩選階段 Plate out wells. 細胞株數(篩選後呈陽性反應株數) 1056(255). 1st screening. 255(49). 2nd screening. 45(17). 1st+2nd screening. 66(30). Pre-cloning screening. 30(16). Cloning well no.. 12. Selected cell line no.. 12(9). Well name. 1C8、2E2、4D11、7B2、8B6、 8D12、8E9、8G11、10G5. 40.

(51) 三、單株抗體的純化與分析 (1) 抗體分型試驗（Isotyping）：本次單株抗體生產，最後得到 9 株對大腸桿菌超音波破碎抗原 ELISA 測試有明顯反應的單株抗體，這些抗體分型(見表四) 主要分成四類(IgG1, κ)、(IgG2b, κ)、(IgM, κ)及(IgG3, κ)，其中重鏈為 IgG1 的有 6 株，IgG2b、IgM、IgG3 的各有 1 株；輕鏈部分則全為 κ。. 表四、單株抗體的 Isotyping 結果 Cell line. Isotype Heavy chain. Light chain. MA-E. coli-1C8. IgG1. κ. MA-E. coli-2E2. IgG1. κ. MA-E. coli-4D11. IgG1. κ. MA-E. coli-7B2. IgG2b. κ. MA-E. coli-8B6. IgG1. κ. MA-E. coli-8D12. IgG1. κ. MA-E. coli-8E9. IgG1. κ. MA-E. coli-8G11. IgM. κ. MA-E. coli-10G5. IgG3. κ. 41.

(52) (2) 大腸桿菌單株抗體純化結果：各單株抗體細胞培養收集液經過 Protein A/G 親和性管柱純化，純化後結果見(表五)。. 表五、單株抗體純化結果表列單株抗體編號. 1C8. 2E2. 4D11. 7B2. 8B6. 8D12. 8E9. 8G11. 10G5. 原體積(mL). 190. 291. 297. 200. 299. 298. 195. 296. 295. 13. 20. 22. 15. 22. 22. 14. 22. 21. 1.87. 1.7. 3.27. 3.42. 3.28. 2.69. 1.74. 2.07. 2.89. 純化後體積(mL). 1.1. 2.1. 3.1. 2.1. 2.1. 4.1. 2.1. 1.6. 2.1. 純化後總量(mg). 2.06. 3.57. 10.14. 7.18. 6.89. 11.03. 3.65. 3.31. 6.07. 濃縮後體積(mL) 純化後濃度(mg/mL). 42.

(53) 各大腸桿菌單株抗體進行免疫染色分析：以大腸桿菌破菌菌液離心後取其上清液為抗原，經西方轉漬後與抗體反應結果(圖七)所示，9 株單株抗體中 1C8、2E2、4D11、 8G11、8D12、8E9、10G5 皆有多條色帶(Ladder bands)產生，在此推測可能與大腸桿菌表面重要的免疫抗原「脂多醣 (LPSs)」有關；7B2、8B6 則各有一條明顯色帶產生，7B2 約在 27 kDa 處，而 8B6 則約在 75~80 kDa 處，另外還有一些較淡的色帶呈現。. 圖七、單株抗體對大腸桿菌破菌抗原的免疫轉漬分析 43.

(54) 以超音波處理的大腸桿菌上清液為抗原以各抗體株進行 Western blot 結果。Lane1 ~ 9 是分別以九株(MA-E. coli-1C8、2E2、4D11、 7B2、8B6、8G11、8D12、8E9 及 10G5)大腸桿菌單株抗體對抗原進行免疫染色；Lane N 則是以 MA-Sal(沙門氏菌專一性抗體) 為負對照組進行免疫染色；「MW」為蛋白質分子量標準(Bioman PL001425) (3) 大腸桿菌單株抗體對不同菌種的專一性分析：第一次實驗藉 ELISA 測試分析大腸桿菌單株抗體對各菌株作用反應結果見「測試 1」(圖八)，在此使用不同的 8 種菌株。本實驗所使用的 8 種細菌基本上涵括了腸內細菌較代表性的形類(見表六)，裡面有陰性菌也有陽性菌，我們可以依靠這些細菌大致分析我們所生產的抗體對不同種類腸內菌的專一性程度。結果 9 株大腸桿菌單株抗體培養液中 6 株(1C8、2E2、4D11、8D12、 8E9 及 10G5)對大腸桿菌破菌抗原(Ec)有很強的訊號反應，另外 3 株(7B2、8B6 及 8G11)則對所有菌種皆有或強或弱的訊號反應。另外所有的單株抗體不論是大腸桿菌單株抗體實驗組、 Mab-Osm 負對照組或是只加入 ELISA dil.組皆對金黃色葡萄球菌(Sa)有很強的訊號產生，這些訊號產生的可能原因是金黃色葡萄球菌表面具有 protein-A 會非專一吸附 Mouse IgG3 及 Rabbit IgG 抗體，而不是抗體對抗原的專一性作用，除吸附少數一級抗體(mouse monoclonal antibody)外，主要吸附大量的二級抗體 (RAM-AP)，因而造成 ELISA 反應訊號的產生。故之後應用應避免使用兔多株抗體作為二級抗體，以消除分析樣品中如含有金黃色葡萄球菌，而與兔抗體同時存在時所造成之非專一性吸附現象。 44.

(55) 45.

(56) 46.

(57) 47.

(58) 圖八、大腸桿菌單株抗體對不同菌種的辨識力比較─測試 1。本實驗使用培養至 OD600=1 後以超音波破菌處理的 8 種不同的細菌株(Bs：枯草桿菌；Sa：金黃色葡萄球菌；Vp：腸炎弧菌； Pf：螢光假單胞菌；Ss：志賀氏桿菌；S-E：腸炎沙門氏菌；S-T：鼠傷寒沙門氏菌；Ec：大腸桿菌)其縮寫標示於橫軸，破菌菌液經稀釋成 1/10 濃度為抗原進行 ELISA 試驗。並以九株(MA-E. coli-1C8、2E2、4D11、7B2、8B6、8G11、8D12、8E9 及 10G5) 大腸桿菌單株抗體培養液為實驗組一級抗體 50 µL/well 加入 ELISA plate 中；負對照組(negative control)用的是 Mab-Osm 單株抗體培養液 50 µL/well；E dil.用的是 ELISA 抗體稀釋液。二級抗體則皆使用 1/5000 稀釋的 RAM-AP，實驗呈色反應 1 小時後讀 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量，縱軸即為其讀值，這九株抗體株反應結果表示於圖(a) ~ (i)。. 48.

(59) 表六、本實驗所測試的細菌分類資料─陽性菌. Gram stain. Gram (+). Phylum. Class. Firmicutes. Bacilli. (厚壁菌門). (芽孢桿菌綱). Order. Family. Genus/Species. Staphylococcaceae. Staphylococcus aureus. (葡萄球菌科). (金黃色葡萄球菌). Bacillales. Bacillaceae. Bacillus subtilis. (芽孢桿菌目). (芽孢桿菌科). (枯草桿菌). Listeriaceae. Listeria monocytogenes. (李斯特菌科). (李斯特菌). Lactobacillales. Streptococcaceae. Streptococcus dysgalactiae. (乳桿菌目). (鏈球菌科). (減乳糖鏈球菌). 註：紅色代表本實驗第一次菌種專一度測試所用之細菌菌株；綠色則為第二次實驗所增加之菌株。. 49. serotype ─. ─. ─. ─.

(60) 表六、本實驗所測試的細菌分類資料─陰性菌. Gram stain. Phylum. Class. Order. Family. Genus/Species. Vibrionales. Vibrionaceae. Vibrio parahaemolyticus. (弧菌目). (弧菌科). (腸炎弧菌). Pseudomonadales Pseudomonadaceae Pseudomonas fluorescens (假單胞菌目). (假單胞菌科). (螢光假單胞菌). serotype ─. ─. Escherichia coli Gram (−). Proteobacteria γ-Proteiobacteria (變形菌門). (大腸桿菌). (γ-變形菌綱). Klebsiella pneumonia Enterobacteriales (腸桿菌目). Enterobacteriaceae (克雷伯氏菌) (腸桿菌科) Shigella sonnei (志賀氏桿菌). ─. ─. Salmonella enteric. Enteritidis. (腸道沙門氏菌). Typhimurium. 註：紅色代表本實驗第一次菌種專一度測試所用之細菌菌株；綠色則為第二次實驗所增加之菌株。. 50. O1 : K1 : H7.

(61) 改變二抗後再次進行菌種專一度測試：再進行第二次菌種專一性試驗後，依「測試 2」(圖九)所呈現之結果，本次實驗使用 9 株經過純化後大腸桿菌單株抗體，其中 6 株對大腸桿菌抗原(Ec)具有顯著反應，負對照組抗體 (MA-Sal)則對大腸桿菌抗原(Ec)無反應，但依預期對沙門氏菌抗原(S-T)有顯著反應。反應結果中因改用 GAM-AP 為二級抗體，原本金黃色葡萄球菌 protein A 非專一吸附 RAM-AP 的情形消失，偽訊號也不再呈現，但對於單株抗體 10G5 仍有訊號反應(「*」標記處)，推測為其 protein A 會對 IgG3 型抗體產生非專一性吸附，而非抗體對抗原的專一性作用。不同大腸桿菌單株抗體對各菌株抗原的作用力比較結果可見(表七)，本實驗所生產的 9 株單株抗體中，有 6 株(1C8、2E2、4D11、8D12、8E9、10G5(金黃色葡萄球菌與其會有反應))對於大腸桿菌抗原有著顯著的專一性反應，定此為第一群；而其他 3 株(7B2、8B6、8G11)則對所有實驗菌株皆有反應，實驗組訊號值相對於負對照組均有顯著差異，故把這 3 株定為第二群。在此依其專一性特性重新編號 1C8、2E2、4D11、8D12、8E9 及 10G5 為 I-1、I-2、I-3、I-4、 I-5 及 I-6，作為第一群；第二群 7B2、8B6 及 8G11 則為 II-1、II-2 及 II-3。重新系統分群後大腸桿菌單株抗體重新命名與原本抗體細胞株名稱對照表見(表八)。. 51.

(62) 52.

(63) 53.

(64) 54.

(65) 圖九、大腸桿菌單株抗體對不同菌種的辨識力比較─測試 2。本實驗想得知二級抗體改用 GAM-AP，對 ELISA 反應結果之影響，在此使用培養至 OD600=1 後以超音波破菌處理的 11 種不同的細菌株菌液，其各菌株簡寫列於橫軸(Bs：枯草桿菌；Lm：李斯特菌；Sa：金黃色葡萄球菌；Sd：減乳糖鏈球菌，以上為革蘭氏陽性菌；以下為革蘭氏陰性菌，Vp：腸炎弧菌；Pf：螢光假單胞菌；Ss：志賀氏桿菌；Kp：克雷伯氏菌；Ec：大腸桿菌； S-E：腸炎沙門氏菌；S-T：鼠傷寒沙門氏菌。綠色標記為在本測試中與「測試 1」相比增加之測試細菌株)，菌液經稀釋成 1/10 濃度(108 CFU/mL)為抗原，實驗在此使用同「測試 1」的 9 株大腸桿菌單株抗體，但本測試已經將這 9 株單株抗體經過純化處理，並將其稀釋成 1 µg/mL 濃度作為一級抗體進行 ELISA 試驗，各單株抗體株反應後結果顯示於圖(a) ~ (i)；負對照組所用之一級抗體是 1 µg/mL 的沙門氏菌單株抗體 MA-Sal。二級抗體則皆改用 1/10000 稀釋的 GAM-AP，實驗呈色反應 1 小時後偵測 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量，縱軸即為其讀值。圖中每個資料點均為三個重複樣品(n=3)的平均值±標準差。. 55.

(66) 表七、不同大腸桿菌單株抗體對各種細菌的作用力比較 Well name (designated name) Bacteria (Gram +/−) Bacillus subtilis (+) Listeria monocytogenes (+) Staphylococcus aureus (+) Streptococcus dysgalactiae (+) Vibrio parahaemolyticus (−) Pseudomonas fluorescens (−) Shigella sonnei (−) Klebsiella pneumonia (−) Escherichia coli (−) Salmonella Enteritidis (−) Salmonella Typhimurium (−). 1C8 (I-1). 2E2 (I-2). 4D11 (I-3). 7B2 (II-1). 8B6 (II-2). 8D12 (I-4). 8E9 (I-5). 8G11 (II-3). 10G5 (I-6). − − − − − − − − +++ − −. − − − − − − − − ++ − −. − − − − − − − − +++ − −. + + + + + ++ ++ ++ +++ ++ ++. + + + + + + + + +++ + +. − − − − − − − − ++ − −. − − − − − − − − +++ − −. + + + + + + + + + + +. − − ++ − − − − − ++ − −. 註:在同次 ELISA 實驗中(圖九)，OD 值訊號高於 0.7 者標為「+++」，介於 0.4 至 0.7 之間者標為「++」，介於 0.05 至 0.4 者為「+」，訊號低於 0.05 者標為「−」；(+) 代表革蘭氏陽性菌，(−) 代表革蘭氏陰性菌。「designated name」是依各大腸桿菌單株抗體對細菌專一性結果重新系統分群命名。. 56.

(67) 表八、大腸桿菌的單株抗體系統分群資料 Cell line MA-E. coli-1C8 MA-E. coli-2E2 MA-E. coli-4D11 MA-E. coli-7B2 MA-E. coli-8B6 MA-E. coli-8D12 MA-E. coli-8E9 MA-E. coli-8G11 MA-E. coli-10G5. Group I-1 I-2 I-3 II-1 II-2 I-4 I-5 II-3 I-6. (4) 大腸桿菌單株抗體結合大腸桿菌細菌顆粒能力分析： (一)福馬林固定處理：在此本想以簡單 direct ELISA 方法檢測抗體是否會與細菌表面，為了使細菌表面物質得以被固定方便我們操作檢測，我們想到使用福馬林進行固定。實驗中，福馬林固定處理的大腸桿菌全菌( I )訊號極弱，超音波破菌處理的大腸桿菌( S )訊號則和之前實驗相同。而根據實驗結果(圖十)，有兩個可能性，一個是福馬林處理造成抗原無法被單株抗體辨識，另一則為 ELISA plate 上只有極少細菌存在。而因正對照組中的福馬林處理之全菌只有微弱訊號，注射大腸桿菌抗原小鼠的稀釋血清應可認許多種不同的大腸桿菌抗原而不會因為幾種抗原經福馬林處理無法辨識即造成訊號消失，所以顯示經福馬林固定處理的大腸桿菌幾乎無法 coating 於 ELISA plate 上，因此本實驗無法用以測試單株抗體是否有能力辨識大腸桿菌表面抗原。 57.