使用 Bradford assay 方法進行蛋白質定量分析，以 Bovine serum albumin (BSA) (Sigma A7960)為標準品，將標準品與大腸
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桿菌超音波破菌樣本進行系列稀釋後，各取 50 µL 加入 96 孔盤 中，再各加入 200 µL Bradford reagent(配方見附錄三），靜置後，
以 ELISA reader 讀取波峰 595 nm 之吸光值。比對其所測出數值 大腸桿菌菌液為抗原，加入 75 μL Freund’s Complete Adjuvant 為佐劑，將抗原與佐劑進行乳化後，對三隻 6 周大 Balb/c 雌鼠 進行六針皮下注射(每針 20 µL)及一針腹腔注射(每針 30 µL)；
相隔一個月，再注射第二針，抗原為同第一次注射，但其中改 加 75 μL Incomplete Adjuvant 為佐劑，同樣混勻後注射；再隔兩 週，進行第三次注射，抗原為前兩次劑量減半(3.75×108 CFU )，
後輕壓破脾臟，並以 Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) (GIBCO 12200-036)沖洗出脾臟內部細胞至 IMDM 中，取其中 100 µL 於血球計數器下計算細胞數量，其餘 IMDM 洗出液以
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500 g 離心 5 分鐘後，倒去上清液，保留底部脾臟細胞，以 7：
1 的比例將其與懸浮於 IMDM + 20%胎牛血清(Fetal calves
serum, FCS)( Hyclone SH30071.03)的骨髓癌細胞（myeloma cell）
充分混合，並以 500 g 離心 5 分鐘後，倒去上清液，收取沉澱。
把含沉澱物之離心管底部浸於 37℃水浴中，在 2 分鐘內緩慢加 入 0.7 mL PEG1500 (Boehringer Mannheim 783641)開始進行細 胞融合，同時輕輕搖晃離心管使 PEG 1500 與細胞得以充份混 合。隨後於 2 分鐘內緩慢加入 15 mL IMDM 以中止融合反應，
再以 500 g 離心 5 分鐘後，倒去上清液，細胞則重新懸浮於 50 mL IMDM+20%胎牛血清+10% HAT
(hypoxanthine-aminopterin-thymidine) (Sigma H0262)的培養液中，
分別滴於已有小鼠腹腔巨噬細胞(macrophage cell)作為餵養細
(1) 酵素免疫分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay , ELISA)：
先將 1010 CFU/mL 以超音波處理大腸桿菌菌液經 5 分鐘 煮沸處理，以 borate saline(配方見附錄三)稀釋成 108
CFU/mL，並將此稀釋液 50 µL/well 於 4℃下使其 coating 於 96 孔盤盤底隔夜。經 ELISA wash buffer(配方見附錄三)清洗 2 次後，加入 180 µL ELISA blocking buffer(配方見附錄三)
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於室溫下兩小時。再以 ELISA wash buffer 清洗 2 次後，將 50 µL/well 融合瘤細胞之培養液為一級抗體加入反應 2 個小 時。ELISA wash buffer 清洗 2 次，以 50 µL/well 將用 ELISA diluents buffer(配方見附錄三)5000 倍稀釋之 RAM-AP(Sigma A4312)為二級抗體加入反應 2 個小時。清洗 2 次後，最後以 pNPP(p-Nitrophenyl Phosphate) substrate 進行呈色反應 1 個 小時，偵測 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量。取吸光值相對
在此使用 Isotyping kit(Southern Biotechnology Association 生產 5070-04)進行大腸桿菌單株抗體 Isotyping，首先於 96 孔盤 中加入 50 µL 3 µg/mL 稀釋於 borate saline 中的
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goat-anti-mouse(GAM)抗體(Sigma A1418)，在 4℃下進行隔夜 coating。清洗後 blocking 兩小時，再次清洗後以 50 µL/well 大 腸桿菌單株細胞培養液為一級抗體反應一小時，清洗後再以 500 倍稀釋的 GAM-AP、GA-IgG1-AP、GA-IgG2a-AP、GA-IgG2b-AP、
GA-IgG3-AP、GA-IgM-AP、GA-κ-AP、GA-λ-AP 50µL/well 為 二級抗體加入反應一個小時，清洗後加入 pNPP substrate 進行呈 色 30 分鐘，於光電比色計中讀取 405 nm 減去 490 nm 的吸光值
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本試驗使用的 11 株細菌中，Escherichia coli（ATCC 11775；
BCRC 10675）、Bacillus subtilis（BCRC 10255）、Shigella sonnei
（BCRC 10773）、Salmonella enterica serovar Enteritidis（BCRC 10744）、Salmonella enterica serovar Typhimurium（BCRC 10747）、
Staphylococcus aureus（BCRC 10781）、Vibrio parajaemolyticus
（BCRC 10806）、Streptococcus dysgalactiae（BCRC 12577）皆 來自生物資源保存與研究中心(Bioresource Collection and
Research Center，BCRC)，而 Listeria monocytogenes 則為台北市 衛生局檢驗室由食品檢體中分離出的菌株，Klebsiella
C ：抗體濃度(mg/mL) A ：280 nm 吸光值
ε ：抗體消光系數 1.36 (cm-1 mg -1 mL) b ：光徑長 1 (cm)
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pneumoniae 為環保署環境檢驗所分離出的菌株，Pseudomonas flurescens 為本實驗室自己分離出的菌株。
各菌種所使用的培養液，Bacillus subtilis、Vibrio parajaemolyticus 及 Shigella sonnei 三種菌種以 neutrient
broth(NB) (配方見附錄二)培養，Vibrio parajaemolyticus 的培養 液因其為嗜鹽菌而要添加 3%的 NaCl，其餘菌株則皆以
Luria-Bertani (LB)培養。生長溫度，除 Vibrio parajaemolyticus 及 Pseudomonas flurescens 培養於 28℃外，其餘皆於 37℃下培 養。
negative control 用的是 Mab-Osm 單株抗體；E dil.用的是 ELISA 抗體稀釋液。二級抗體則使用 1/5000 稀釋的 RAM-AP，實驗呈 control 用的是 MA-Sal 單株抗體；E dil.用的是 ELISA 抗體稀釋 液。二級抗體則改用 10000 倍稀釋的 GAM-AP，實驗呈色反應 1 小時後讀偵測 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量。
31 formalin-fixed 大腸桿菌於 96 孔盤上進行單株抗體 ELISA 測試，使用之一級抗體為 I-1 ~ I-5 共 5 株抗體。
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後，接著以 16500 g 離心 5 min，收取離心後上清液，各取 5 µL/lane 以 120 V 的電壓進行 12% SDS-PAGE 電泳，之後進 行 electroblotting 將膠上物質以 40 V 電壓轉漬至 NC
membrane 上 35 分鐘。將此 NC 膜以 ELISA blocking 溶液中 於室溫 blocking 1 個小時後，以然後以 ELISA wash buffer 清洗後再以 5000 倍稀釋的 RAM-AP 做為一級抗體反應 1 個小時，清洗後以 33 µL BCIP 及 66 µL NBT 受質加入 10 mL Western substrate buffer(配方見附錄三)進行反應呈色。
5. 大腸桿菌 O-antigen(LPSs)萃取及單株抗體所辨識抗原是否為 LPS 分析：
參考文獻後採用 phenol-water-extraction 萃取法(Koga et al. , 1985, Ronholm et al. , 2011)，將大腸桿菌經隔夜培養後，並以 PBS 清洗並以 2000 g 離心 5 分鐘後去上清液，重複過程三次，後回 溶於與初始體積相等的滅菌水中，置於 70℃水浴槽中水浴 10 分 鐘，加入等體積預熱至 70℃的 90%苯酚，於 70℃水浴之下劇烈 搖晃 20 分鐘(需確認劇烈搖晃後水層與苯酚層互溶不再分層)，
接著迅速降溫至 10℃，再以 5000 g 於室溫下離心 10 分鐘。取上 部水層保存，並將苯酚層加入等體積的滅菌水後，於 70℃水浴 之下依前述步驟進行再次進行萃取，冷卻離心後，亦抽取水層保 留。將兩次萃取的水層混合收集，對二次水透析隔夜，後進行冷 凍乾燥，最後以二次水回溶使用。步驟示意圖如圖四：
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圖四、大腸桿菌 LPSs 萃取示意圖
取 10 µL LPSs 萃取物，與 5 μL 三倍的 SDS sample buffer 對混，於沸水中煮沸 5 分鐘，加入單槽膠片中，以 120 V 電壓 進行 12%的 SDS-PAGE 電泳後，隨後進行 electroblotting 將膠 上的物質以 40 V 電壓轉漬到 NC membrane 上 40 分鐘。將轉好 的膜以 ELISA blocking buffer 於 4℃浸泡隔夜，垂直切割成寬約 3 mm 條狀後，經過 ELISA wash buffer 浸泡清洗 15 分鐘兩次後，
每條各以10 μg/mL 9 株大腸桿菌抗體 300 µL 為一級抗體反應 1 個小時，經過浸泡清洗後以 ELISA diluent 稀釋 10000 倍之 GAM-AP 300 µL 為二級抗體反應 1 個小時後進行浸泡清洗，接 著以 Western substrate buffer 浸泡 15 分鐘，最後以 NBT 及 BCIP 受質呈色約 5 分鐘至 30 分鐘。
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6. 大腸桿菌單株抗體的效價分析：
本實驗以 108 CFU/mL 經超音波破菌處理的大腸桿菌為抗 原，於 4℃下 coating 隔夜，一級抗體使用 50 µL/well 9 株大腸 桿菌抗體分兩組(I-1 ~ I-6 一組、II-1 ~ II-3 為一組)各以 5 種不同 濃度(10 µg/mL、1 µg/mL、0.1 µg/mL、0.01 µg/mL 及 0.001 µg/mL) 進行試驗；negative control 用的是沙門氏菌專一性單株抗體 MA-Sal。二級抗體則用 1/10000 稀釋的 GAM-AP，實驗呈色反 應 1 小時後讀偵測 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量。
7. 不同抗體株間競爭性測試(Competitive ELISA)：
本實驗以四株(I-1、I-2、I-3 及 I-5)濃度 1 µg/mL 的大腸桿 倍稀釋之 GAM-AP 反應一個小時，最後以 pNPP substrate 呈色 一個小時，實驗呈色反應 1 小時後用光電比色計讀取 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量。
35 存，另一組則加入 1/5000 稀釋之 GAR-AP(Sigma A3687)為三級 抗體反應 1 個小時。兩組皆清洗完，以 50 µL/well 加入 pNPP substrate 呈色 1 個小時，用 ELISA reader 讀取 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量。
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2. Microfuge tube immunoassay 的分析：
取 1.5 mL 微量離心管(Microfuge tube)，加入 1.5 mL ELISA blocking buffer，置於 4℃下 blocking 隔夜，後將 ELISA blocking 溶液甩乾。於微量離心管中分別加入經 5 分鐘煮沸處理的大腸 桿菌菌液稀釋成 103、104、105及 106 CFU/mL 四種濃度各 1.5 mL/tube，以 10000g、4℃離心 5 分鐘後，輕倒除去上清液，加 入 1.5 mL ELISA wash buffer 後以 10000 g、4℃離心 5 分鐘後，
輕倒除去上清液並倒置微量離心管置於紙巾上將殘留液體吸乾。
然後把 10 µg/mL 大腸桿菌單株抗體(一級抗體)、5000 倍稀釋之 RAM-AP(二級抗體)及 5000 倍稀釋之 GAR-AP(三級抗體)各 50 µL 同時加入，將離心管置於 28℃下震盪反應 1 個小時，以 10000 g、4℃離心 5 分鐘，倒去上清液後加入 1.5 mL ELISA wash 溶 液離心清洗兩次，最後倒置於紙巾上吸乾殘存液體。於每管內 加入 pNPP substrate 各 100 µL，混勻後於置於 28℃下震盪反應 一個小時，每管吸出 50 µL 加入 96 孔盤中，以光電比色機偵測 405 nm 與 490 nm 吸光值的差量，實驗操作示意圖如(圖五)。
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圖五、Microfuge tube immunoassay 實驗步驟示意圖
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參、 結果 一、 抗原的製備
超音波破菌條件測試：
本試驗用以測試如何以超音波處理可以使得未被超音破震 碎的大腸桿菌活菌數降到最低，並使大腸桿菌菌體內所含的各種 免疫原物質得以最大量釋出，在此運用偵測釋出蛋白質的量作為 偵測基準。由（圖六）可知當以超音波功率 6W 進行破菌處理時，
隨著超音波破菌的次數增加，OD600吸光值越來越低，細菌的存 活率也越來越低。當破菌處理超過 3 次後，OD600吸光值變化幾 乎穩定；而破菌處理超過 4 次後，細菌存活率則低於百萬分之一；
蛋白質釋出總量也趨近穩定。由結果可知，以超音波功率 6W，
進行 4 次(每次震盪 20 秒，休息 40 秒)超音波破菌處理，大部份 的細菌皆被打破，故再增加處理次數也不會增加破菌效率。以此 大腸桿菌破碎物為抗原進行小鼠免疫注射以生產單株抗體。
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圖六、超音波破菌條件測試
研究超音波處理次數與大腸桿菌破菌效果的關係，以破菌處理 過後的 OD600吸光值變化及蛋白質釋出量作為破菌程度指示。(a) 為超音處理次數與 OD600吸光值變化關係；(b)為超音波處理次
40 Pre-cloning screening
Cloning well no.
Selected cell line no.
Well name
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三、 單株抗體的純化與分析 (1) 抗體分型試驗（Isotyping）：
本次單株抗體生產，最後得到 9 株對大腸桿菌超音波破碎 抗原 ELISA 測試有明顯反應的單株抗體，這些抗體分型(見表四) 主要分成四類(IgG1, κ)、(IgG2b, κ)、(IgM, κ)及(IgG3, κ)，其中 重鏈為 IgG1 的有 6 株，IgG2b、IgM、IgG3 的各有 1 株；輕鏈 部分則全為 κ。
表四、單株抗體的 Isotyping 結果
Cell line Isotype
Heavy chain Light chain
MA-E. coli-1C8 IgG1 κ
MA-E. coli-2E2 IgG1 κ
MA-E. coli-4D11 IgG1 κ MA-E. coli-7B2 IgG2b κ
MA-E. coli-8B6 IgG1 κ
MA-E. coli-8D12 IgG1 κ
MA-E. coli-8E9 IgG1 κ
MA-E. coli-8G11 IgM κ
MA-E. coli-10G5 IgG3 κ
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(2) 大腸桿菌單株抗體純化結果：
各單株抗體細胞培養收集液經過 Protein A/G 親和性管柱純化，純化後結果見(表五)。
表五、單株抗體純化結果表列
單株抗體編號 1C8 2E2 4D11 7B2 8B6 8D12 8E9 8G11 10G5
原體積(mL) 190 291 297 200 299 298 195 296 295
濃縮後體積(mL) 13 20 22 15 22 22 14 22 21
純化後濃度(mg/mL) 1.87 1.7 3.27 3.42 3.28 2.69 1.74 2.07 2.89 純化後體積(mL) 1.1 2.1 3.1 2.1 2.1 4.1 2.1 1.6 2.1 純化後總量(mg) 2.06 3.57 10.14 7.18 6.89 11.03 3.65 3.31 6.07
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各大腸桿菌單株抗體進行免疫染色分析：
以大腸桿菌破菌菌液離心後取其上清液為抗原，經西方轉漬 後與抗體反應結果(圖七)所示，9 株單株抗體中 1C8、2E2、4D11、
8G11、8D12、8E9、10G5 皆有多條色帶(Ladder bands)產生，在 此推測可能與大腸桿菌表面重要的免疫抗原「脂多醣 (LPSs)」
有關；7B2、8B6 則各有一條明顯色帶產生，7B2 約在 27 kDa 處，
而 8B6 則約在 75~80 kDa 處，另外還有一些較淡的色帶呈現。
圖七、單株抗體對大腸桿菌破菌抗原的免疫轉漬分析
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以超音波處理的大腸桿菌上清液為抗原以各抗體株進行 Western blot 結果。Lane1 ~ 9 是分別以九株(MA-E. coli-1C8、2E2、4D11、
7B2、8B6、8G11、8D12、8E9 及 10G5)大腸桿菌單株抗體對抗 原進行免疫染色；Lane N 則是以 MA-Sal(沙門氏菌專一性抗體)
結果 9 株大腸桿菌單株抗體培養液中 6 株(1C8、2E2、4D11、8D12、
8E9 及 10G5)對大腸桿菌破菌抗原(Ec)有很強的訊號反應，另外 3 株(7B2、8B6 及 8G11)則對所有菌種皆有或強或弱的訊號反應。
8E9 及 10G5)對大腸桿菌破菌抗原(Ec)有很強的訊號反應，另外 3 株(7B2、8B6 及 8G11)則對所有菌種皆有或強或弱的訊號反應。