第二章 材料與方法
第一節 中藥製劑中摻加支氣管鬆弛劑之固相萃取與高效
1. 試劑與材料
CA, 8-chlorotheophylline (CT), DP, PP, TB 及 TP 均購自 Sigma 公 司 (St. Louis, MO, USA)。甲醇及氯仿均購自 Labscan 公司 (Dublin, Ireland)且為 LC 級。異丙醇購自 Nakalai 公司 (Kyoto, Japan)。正丁醇 購自 RDH 公司 (Seelze, Germany)。醋酸及鹽酸均為分析試藥級。超純 度過濾水之電阻高於 18 MΩ。乙醇購自台灣菸酒公賣局為中華藥典級。
三 種 市 售 中 藥 製 劑 之 濃 縮 散 作 為 模 擬 方 劑 之 用 。小 青 龍 湯 (Sheau-Ching-Long-Tang; F1)，每日含量為：麻黃、芍藥、甘草、桂枝、
細辛 (各 2.19 g)；乾薑 (1.31 g)；五味子及半夏 (各 2.62 g)。
麻黃湯 (Ma-Hwang-Tang; F2)：麻黃 (6.0 g)；甘草 (2.0 g)；桂枝 及杏仁 (各 4.0 g)。
杏蘇飲 (Shing-Su-Yiin; F3)：甘草 (2.0 g)；杏仁、紫蘇、前胡、桔 梗、枳殼、桑白皮、黃芩、麥門冬及貝母 (各 1.5 g)；橘紅及生薑 (各 0.5 g)。
以上三種市售中藥製劑均購自台北。
檢體 A 及 B 係 1997 年 10 月收集得到，均為中國大陸中藥廠製造 之黑色中藥丸。檢體 C 及 D 係 1995 年 11 月及 1996 年 1 月得自台北 市政府衛生局消費者服務中心，為中醫診所及中藥房所配製之淺褐色 粉末。
2. HPLC 儀器與條件
HPLC 儀器：Hitachi L-6200 intelligent pump 連接 Hitachi L-3000 photodiode array detector 及 Shimadzu SIL-9A auto injector。
管柱：Merck RP-select B (250×4.6 mm I.D.)。
移動相：甲醇及 1 % 醋酸 (15:85, v/v)。
流速：1.5 mL/min。
檢測波長：270 nm。
內部標準品：CT。
3. TLC篩檢試驗
檢體 A 至 D (1 g) 以乙醇 (5 mL) 超音波震盪萃取 30 min，過濾，
濾液用於 TLC 篩檢西藥成分。
TLC層析板使用 1 mm E. Merck silica gel plates (60F254)。以 UV light 254 nm 作檢測。展開溶媒為正丁醇、水及醋酸 (7/1/2, v/v)。
4. UV 及 GC/MS 確認
(1) UV
刮取相對於 DP 及 TP 標準品處之 TLC 層析板色點，以乙 醇 (3 mL)抽取。此乙醇溶液過濾後進行 UV 分析。紫外光分光 光度計為 Hitachi U-3210 spectrophotometer。
(2) GC-MS
氣相層析儀：使用 Hewlett-Packard (HP) 5890 gas chromatography。
Electron impact mass：使用 HP 5970 mass selective detector。
Ionization voltage： 70 eV。
Source temperature： 300 °C。
檢液配製：檢體 (1 g) 以乙醇 (5 mL) 萃取，萃取液過濾作為檢 液。
注入量： 1 µL。
管柱：25 m×0.25 mm I.D. fused silica column coated with 0.25 µm of HP-1。
分析溫度：120 °C至 280 °C (10 °C /min)。
5. 標準品溶液之配製及檢量線製作
精確秤取 TB, DP, TP, PP, CA 標準品，並加入內部標準品 (CT) 溶液 (1.0 mg/mL) 0.1 mL， 以 水 稀 釋 調 配 成 一 系 列 濃 度 依 序 為 8.08~161.60 µg/mL, 10.10~202.0 µg/mL, 10.12~202.4 µg/mL, 10.02~200.4 µg/mL及 10.08~201.6 µg/mL。以各標準品與內部標準品波 峰面積比及標準品之濃度，作檢量線並求出其線性迴歸方程式及相關 係數。
6. 檢體溶液之配製
檢體 A 至 C (0.5 g) 及檢體 D (1.0 g) 分別精確秤重後，各以水 (25
mL) 於 40 °C超音波震盪，萃取 30 分鐘。過濾後濾液加水至 25.0 mL。
再取各溶液A, C及 D各1.0 mL分別以水稀釋至 50.0, 50.0 及10.0 Ml (溶 液 B 不稀釋)，作為檢體溶液。
模擬方劑一公克精確秤重後，以水 (25 mL) 於 40 °C超音波震盪，
萃取 30 分鐘，過濾後加水至 25.0 mL。
7. 檢體以固相萃取法 (SPE) 萃取
(1) 檢體前處理：檢體之水溶液 (5 mL) 以 1 N HCl (一滴) 酸化 後，投入萃取管柱。
(2) 活化固相萃取管柱：甲醇 (5 mL) 及水 (5 mL)。
(3) 裝填樣品：固相萃取管使用 Supelclean C-18, 500 mg, 3 mL column volume。
(4) 沖洗： 0.01 M ammonium acetate (2×5 mL)。
(5) 沖提：氯仿-異丙醇 (19:1, v/v; 10 mL)。
收集沖提液並減壓濃縮至乾後，溶於 50 % 乙醇 2 mL 移至 5.0 mL 容量瓶。加入 CT (內部標準品) 溶液 (1.0 mg/mL) 0.1 mL 並加入 50 % 乙醇至 5.0 mL。此液以 0.45 µm 之濾膜過濾後以 HPLC 分析。
8. 精密度試驗
於各標準品檢量線之範圍內，選取三種濃度，分別為 TB: 8.08,
32.32及 161.60 µg/mL; DP: 10.10, 40.40 及 202.00 µg/mL; TP: 10.12, 40.48及 202.40 µg/mL; PP: 10.02, 40.08及 200.40 µg/mL; CA: 10.08, 40.32及 201.60 µg/mL，於同一日及不同的五天重複分析各五次，計算 其相對標準差。
9. 回收率試驗
三種不同濃度 (TB: 16.16, 32.32 及 64.64 µg/mL; DP: 20.20, 40.40 及 80.80 µg/mL; TP: 20.24, 40.48 及 80.96 µg/mL; PP: 20.04, 40.08及
80.16 µg/mL; CA: 20.16, 40.32及 80.64 µg/mL) 之標準品溶液 (含五種 西藥成分) 分別添加於水 (5.0 mL)，及各別之模擬方劑中 (5.0 mL)。
西藥成分之回收率以測定之數據及已知濃度之西藥成分計算之。這些 混合之檢液依前述方法萃取及分析。
第二節 中藥製劑中摻加類固醇之固相萃取與高效液相 層析分析
1. 試劑與材料
BE, CO, DE, HA, ME, PN, TR 及 fludrocortisone acetate (FA) 均 購自Sigma公司 (St. Louis, MO, USA)。PR 購自Nakalai公司 (Kyoto, Japan)。乙 、氯仿、二氯甲烷及甲醇均購自Labscan公司 (Dublin, Ireland) 且為LC級。超純度過濾水之電阻高於18 MΩ。乙醇購自台灣菸 酒公賣局為中華藥典級。八種不同品牌之矽膠固相萃取管 (500 mg, 3
mL) 分別購自Baker (Phillipsburg, NJ, USA; Brand 8), Chrom (Apple Valley, MN, USA; Brand 7), Macherey-Nagel (Duren, Germany; Brand 5), Merck (Darmstadt, Germany; Brand 6), Restek (Bellefonte, PA, USA;
Brand 3), Supelco (Bellefonte, PA, USA; Brand 1), Varian (Harbor City, CA, USA; Brand 4) 及Waters (Milford, MA, USA; Brand 2)。
三種市售中藥製劑之濃縮散作為模擬方劑之用。其組成如下：小 青龍湯 (Sheau-Ching-Long-Tang; F4)：麻黃、芍藥、甘草、桂枝、細辛、
乾薑、五味子 (各3.0 g) 及半夏 (6.0 g)。
獨活寄生湯 (Dwu-Hwo-Jin-Sheng-Tang; F5)：桔皮 (0.3 g)；人參、
芍藥、當歸、甘草、茯苓、川牛膝、細辛、桑寄生、秦艽、防風、川 芎、杜仲、地黃 (各0.4 g) 及獨活 (0.6 g)。
八珍湯 (Ba-Jen-Tang; F6)：甘草 (1.5 g)；川芎 (2.3 g)；人參、白 朮、芍藥、茯苓 (各3.0 g)；當歸及生地 (各4.5 g)。
以上三種市售中藥製劑均購自台北。
2. HPLC儀器與條件
HPLC 儀器：Hitachi L-6200 intelligent pump 連接 Hitachi L-3000 photodiode array detector 及 Shimadzu SIL-9A auto injector。
管柱：Inertsil ODS-80A (250×4.6 mm I.D.)。
移動相：乙 及水 (3:7, v/v)。
流速：1.2 mL/min。
檢測波長：240 nm。
內部標準品：FA。
3. 標準品溶液之配製及檢量線製作
精確秤取 BE, CO, DE, HA, ME, PN, PR, TR 標準品，並加入內部
標準品 (FA) 溶液 (1.0 mg/mL) 0.5 mL，以乙醇稀釋調配成一系列濃度 依 序 為 6.18~98.88 µg/mL, 6.24~99.84 µg/mL, 6.00~96.00 µg/mL, 6.18~98.88 µg/mL, 6.00~96.00 µg/mL, 6.18~98.88 µg/mL, 6.12~97.92 µg/mL及 6.24~99.84 µg/mL。以各標準品與內部標準品波峰面積比及標 準品之濃度，作檢量線並求出其線性迴歸方程式及相關係數。
4. 模擬方劑檢體溶液之製備
三種市售中藥製劑小青龍湯、獨活寄生湯及八珍湯濃縮散作為模 擬方劑，以試驗西藥成分之干擾及回收率。分別精確秤取三種模擬方 劑1 g，各以氯仿 (25 mL) 於30 °C超音波震盪，萃取30分鐘，過濾後加 氯仿至25.0 mL。
上述中藥製劑萃取液以氯仿依1:4 (v/v) 及1:24 (v/v) 稀釋以探討 八種類固醇經SPE 處理之基質的影響。八種類固醇標準品溶液 (120
µg/mL) 添加至不同濃度之三種市售中藥製劑萃取液，以探討這些西藥
成分之回收率。
5. 檢體以固相萃取法 (SPE) 萃取
(1) 活化固相萃取管柱：依序以不同溶媒 (甲醇或乙醇或異丙醇) 5
mL及氯仿 5 mL 活化固相萃取管柱。
(2) 裝填樣品：裝填檢體溶液 (5 mL)，固相萃取管使用 SiOH, 500 mg, 3 mL column volume。
(3) 沖提：以不同比例之二氯甲烷-異丙醇 (10 mL) 沖提。
收集沖提液並減壓濃縮至乾後，溶於乙醇 8 mL，移至 10.0 mL 容 量瓶。加入 FA (內部標準品) 溶液 (1.0 mg/mL) 0.5 mL 並加入乙醇定 容。此液以 0.45 µm之濾膜過濾後以 HPLC 分析。
6. 精密度試驗
於各標準品檢量線之範圍內，選取三種濃度，分別為 BE: 6.18,
24.72及 98.88 µg/mL; CO: 6.24, 24.96及 99.84 µg/mL; DE: 6.0, 24.0及 96.0 µg/mL; HA: 6.18, 24.72 及 98.88 µg/mL; ME: 6.0, 24.0 及 96.0 µg/mL; PN: 6.18, 24.72 及 98.88 µg/mL; PR: 6.12, 24.48及 97.92 µg/mL;
TR: 6.24, 24.96及 99.84 µg/mL，於同一日及不同的六天重複分析各六 次，計算其相對標準差。
7. 回收率試驗
已知濃度 (120, 240 及 360 µg/mL) 之標準品溶液 (含八種西藥成
分) 分別添加於氯仿中 (5.0 mL)。西藥成分之回收率以測定之數據及 已知濃度之西藥成分計算之。這些混合之檢液依前述方法做 SPE 萃取 及 HPLC 分析。
第三節 中藥製劑中摻加減肥藥之固相萃取與毛細管電 泳層析分析
1. 試劑與材料
DEP, FEN, MAM , PHE及 PPA 均購自 Sigma 公司 (St. Louis, MO, USA)。CBZ 係 Roussel Uclaf 公司 (Paris, France) 所贈。二氯甲烷及 乙 均購自 Labscan 公司 (Dublin, Ireland) 且均為 HPLC 級。異丙醇及
sodium dihydrogenphosphate 均購自 Nakalai 公司 (Kyoto, Japan)。
Ammonium chloride及 fluorene-2,7-diammonium dichloride (FDA) 均購 自 E. Merck 公司 (Darmstadt, Germany)。磷酸及氨水均為分析試藥級。
超純度過濾水之電阻高於 18 MΩ。
一 種 市 售 中 藥 製 劑 濃 縮 散 作 為 模 擬 方 劑 之 用 。 防 風 通 聖 散
(Farng-Feng-Tong-Sheng-Saan) 其組成如下：甘草、滑石 (各 2.5 g)；黃 芩、桔梗、石膏 (各 2.0 g)；麻黃、芍藥、 防風、連翹、薄荷、川芎、
當歸、大黃、芒硝 (各 1.0 g)；白朮、生薑及荊芥 (各 0.5 g)。此市售中 藥製劑購自台北。
檢體 A 及 B 係 1998 年 2 月收集得到，均為中國大陸中藥廠製造 之中藥膠囊。檢體 C 及 D 係 1994 年 6 月及 1990 年 10 月由台北市政 府衛生局消費者服務中心送驗，為中醫診所及中藥房所配製之淺褐色 粉末。
2. 儀器與條件
(1) CE system
儀器：Beckman P/ACE 2200 CE system 配備 UV detector。
波長：200 nm。
毛細管：57 cm×75 µm I.D. uncoated capillary (Beckman), detectionwindow placed at 50 cm。
進樣時間： 2 sec, hydrostatic。
分析時間： 15 min。
電壓：16 kV (constant voltage, positive to negative polarity)。
儀器：HP 6890 gas chromatograph 連接 HP 6890 series injector，
配備 HP 5973 mass selective detector。
管柱：HP-5MS capillary column (fused-silica coated with 5 %
phenylmethylsilicone phase), 0.25 µm (film thickness)×0.25 mm i.d.×30 m length。
攜行氣體：氦氣。
Column head pressure：10.5 psi。
注入量：1 µL (splitless mode) 。
溫度條件：初始為 65 °C 維持 1 min, 10 °C/min 增加至 280 °C，
維持 5 min。
Full-scan mass range：40~550 amu at 2.89 scan/sec。
MS ionization mode：electron impact (EI) 。 Electron energy：70 eV。
Ion source temperature：230 °C。
Quadrupole temperature： 150 °C。
3. 標準品溶液之配製及檢量線製作
精確秤取六種減肥藥標準品，並加入內部標準品 (FDA) 水溶液 (0.5 mg/mL) 0.5 mL，以水稀釋調配成 4~128 µg/mL。以各標準品與內 部標準品波峰面積比及標準品之濃度，作檢量線並求出其線性迴歸方 程式及相關係數。
4. 檢體溶液之配製
檢體 A 及 B (25 mg) 及檢體 C 及 D (100 mg) 分別精確秤重後，各 以水 (25 mL) 於 40 °C超音波震盪，萃取 30 分鐘。過濾後濾液加水至 25.0 mL，作為檢體溶液。
模擬方劑一公克精確秤重後，以水 (50 mL) 於 40 °C 超音波震
盪，萃取 30 分鐘，過濾後加水至 50.0 mL。
5. 檢體以固相萃取法 (SPE) 萃取
(1) 活 化 固 相 萃 取 管 柱 ： 甲 醇 (5 mL) 、 水 (5 mL) 及 NH4Cl/NH4OH buffer, pH 6.0 (10 mL)。
(2) 裝填樣品：裝填檢體溶液 10 mL，固相萃取管使用 mixed adsorbent C8-SCX (1:4), Evidex, J&W Scientific, 400 mg, 6 mL column volume。
(3) 沖提：CH2Cl2/isopropanol/ NH4OH (78/20/2, v/v/v, 2×10 mL)，
vacuum set at 2.5 mmHg。
收集沖提液並減壓濃縮至乾後，溶於 50 % 甲醇 8 mL 移至 10.0 mL 容量瓶。加入 FDA (內部標準品) 溶液 (0.5 mg/mL) 0.5 mL 後，再加水 定容。此液以 0.45 µm之濾膜過濾後以 HPLC 分析。
6. 精密度試驗
於各標準品檢量線之範圍內，選取三種濃度，分別為 CBZ: 4.016, 16.064及 128.512 µg/mL; DEP: 4.032, 16.128 及 129.024 µg/mL; FEN:
4.0, 16.0及 128.0 µg/mL; MAM: 4.08, 16.32及 130.56 µg/mL; PHE:
4.016, 16.064 及 128.512 µg/mL; PPA: 3.984, 15.936及 127.488 µg/mL，
於同一日及不同的五天重複分析各五次，計算其相對標準差。
7. 回收率試驗
三種不同濃度 (CBZ: 80.32, 160.64 及 321.28 µg/mL; DEP: 80.64,
161.28及 322.56 µg/mL; FEN: 80.0, 160.0及 320.0 µg/mL; MAM: 81.6, 163.2及 326.4 µg/mL; PHE: 80.32, 160.64及 321.28 µg/mL; PPA: 79.68, 159.36及 318.72 µg/mL) 之標準品溶液 (含六種西藥成分) 分別添加於 水 (10.0 mL)，及各別之模擬方劑中 (10.0 mL)。西藥成分之回收率以 測定之數據及已知濃度之西藥成分計算之。這些混合之檢液依前述方 法做 SPE 萃取及 HPCE 分析。
第四節 中藥製劑中摻加胃腸藥之毛細管電泳層析分析
1. 試劑與材料
CIM, HOM, MET, PIR, RAN及SCO 均購自Sigma 公司 (St. Louis, MO, USA)。乙 及甲醇均購自 Labscan 公司 (Dublin, Ireland) 且為 LC 級。Disodium hydrogenphosphate 及 sodium dihydrogenphosphate 均購自
Nakalai 公 司 (Kyoto, Japan) 。
3-Benzyl-5-(2-hydroxyethyl)-4-methylthiazolium chloride (BHM) 購自 E.
Merck (Darmstadt, Germany)。磷酸為分析試藥級。超純度過濾水之電 阻高於 18 MΩ。
一 種 市 售 中 藥 製 劑 濃 縮 散 作 為 模 擬 方 劑 之 用 。 小 建 中 湯 (Sheau-Jiann-Jong-Tang) 其組成如下：甘草 (2.0 g)；生薑、桂枝及大棗 (各 3.0 g)；飴糖 (4.0 g) 及芍藥 (6.0 g)。此市售中藥製劑購自台北。
2. 儀器與條件
儀器：Beckman P/ACE 5500 CE system 配備 photodiode array detector。
波長：214 nm。
毛細管：47 cm×75 µm I.D. uncoated capillary (Beckman), detection window placed at 40 cm。
進樣時間：2 sec, hydrostatic。
分析時間：7 min。
電壓：20.5 kV (constant voltage, positive to negative polarity)。
溫度：30 °C。
緩 衝 液 ： 含 15 % 乙 之 100 mM sodium phosphate buffer
(NaH2PO4/H3PO4, pH 2.5)。
內部標準品：BHM。
緩衝液使用前以 0.45 µm syringe filter (Gelman) 過濾。分析實驗結 束後，毛細管依序以 1.0 % sodium hydroxide 2 min 及水 2 min 清洗。
分析實驗開始前以緩衝液充填 2 min。使用 Gold software (Beckman) 作 為系統控制及數據處理。
3. 標準品溶液之配製及檢量線製作
精確秤取六種胃腸藥標準品，並加入內部標準品 (BHM) 水溶液 (1.2 mg/mL) 0.5 mL，以水稀釋調配成 16~260 µg/mL。以各標準品與內 部標準品波峰面積比及標準品之濃度，作檢量線並求出其線性迴歸方 程式及相關係數。
4. 模擬方劑檢體溶液之配製
模擬方劑一公克精確秤重後，以水 (50 mL) 於 40 °C下超音波震 盪，萃取 30 分鐘，過濾後加水至 50.0 mL。
5. 精密度試驗
於各標準品檢量線之範圍內，選取三種濃度，分別為 CIM: 16.4,
65.6及 262.4 µg/mL; HOM: 16.2, 64.6及 258.6 µg/mL; MET: 16.4, 65.6 及262.4 µg/mL; PIR: 16.3, 65.3及 261.1 µg/mL; RAN: 16.2, 64.6及 258.6 µg/mL及 SCO: 16.4, 65.6 及 262.4 µg/mL，於同一日及不同的六天重複 分析各六次，計算其相對標準差。
6. 回收率試驗
三種不同濃度 (CIM: 32.8, 65.6 及 131.2 µg/mL; HOM: 32.4, 64.6 及 129.2 µg/mL; MET: 32.8, 65.6及 131.2 µg/mL; PIR: 32.6, 65.3及 130.6 µg/mL; RAN: 32.4, 65.0及130.0 µg/mL及SCO: 32.8, 65.6 及 131.2 µg/mL) 之標準品溶液 (含六種西藥成分) 添加於模擬方劑中 (10.0 mL)，並加入 BHM (1.2 mg/mL) 0.5 mL 作為內部標準品。西藥成分之 回收率以測定之數據及已知濃度之西藥成分計算之。這些混合之檢液 依前述方法分析。