第三章 材料與方法
3.1 主要材料與設備
1. 矽膠管
本實驗使用之矽膠管(l2 mm 長，0.76 mm 內徑，1.65 mm 外徑)購自 Helix Medical,Inc (USA)。
2. Chitosan
脫乙醯度 80 % (全球生技公司)
3. PEO (polyethylene oxide)聚環氧乙烷
為環氧乙烷經多相催化，開環聚合而成的高分子量聚合物(外觀為 白色)，加入與 chitosan 混合電訪，可得到較佳的穩固性、可紡性與多 孔性。PEO 購自瑋睿科技股份有限公司(台灣)。
4. 醋酸
Chitosan 溶於弱酸，所以醋酸為 chitosan 混合電訪溶液的助劑。
醋酸純度為 99 %-100 % ，購自島久藥品株式會社(Japan)。
5. 磁石攪拌器
Corning Laboratory Stirrer/Hot Plat，美國製，台中逢甲大學 提供。
6. 冷凍乾燥機
用已烘乾剛完成的纖維膜。EYELA FDU-1200，尚偉儀器公司。
7. 靜電紡織裝置
KdScientific Modol 200 Series，美國製，台中逢甲大學提供。
8. Toluidine Blue
組織染色使用。Toluidine Blue 化學式為 C15H16SCl+ZnCl2，它對神 經組織中蛋白質的碳氧基有高度的親合力，常用以神經髓鞘的染色。當 以 Toluidine Blue 染色時，髓鞘被染成深藍色．而髓鞘環內的軸突則
呈現淡白色。實驗所用的 Toluidine Blue 購自 Sigma (USA)。
9. Hematoxylin 與 eosin
Hematoxylin 是一種天然染料，組織學上廣為使用，並通常選用 eosin 來做對比染色。實驗所用的 Hematoxylin、eosin 購自 Sigma (Germany)。
10. AErrane®
氣體麻醉劑，用於手術過程減低動物痛苦。實驗所用的 AErrane® (Isoflurane)購自 Baxter (USA)。
11. 優點藥水(普威隆碘®)
用於手術前對大鼠皮膚的消毒。實驗所用的普威隆碘®購自久仁製 藥廠(台灣)。
12. 抗生素 Pamoxcillin®
內含 Amoxicillin Trihydrate l.5 gm/60ml，加入手術後大鼠的 飲用水中，預防傷口感染。抗生素 Pamoxcillin®購自聯邦化學製藥股 份有限公司(台灣)。
13. Betadine® Antiseptic Solution
用 於 實 驗 過 程 動 物 及 器 械 的 消 毒 。 實 驗 所 用 的 Betadine® Antiseptic Solution 購自 Mundipharma (Germany)。
14. 9-0 Nylon 縫線
用於將斷傷神經固定於神經導管。實驗所用的 9-0Nylon 縫線購自 Mani (Japan)。
15. 4-0 Catgut chrom 縫線
用於縫合大鼠肌肉及皮膚。實驗所用的 4-0 Catgut chrom 縫線購 自 B.Braun (Germany)。
16. SEM 掃描式電子顯微鏡
HITACHI S3000N，日本製，台中逢甲大學提供。
17. 氣體麻醉機(Forawick Vaporizer)
將液態的麻醉劑揮發為氣態，並混合氧氣用以麻醉實驗動物。購自 Muraco Medical Co.(Japan)。
18. 誘發電位儀(Neuropack Four Mini)
可發出電流刺激，藉著記錄電極接收並以電位波型呈現。購自 Kohden Co.(Japan)。
3.2 矽膠管內填幾丁聚醣纖維膜的製備方法
3.2.1 製備纖維膜
首先製備 Chitosan/PEO 溶液，利用去離子水調配 1 %醋酸溶液，並 根據 Chitosan/PEO 重量比 40/60 的比例，取 Chitosan 粉末 1.6 g 及 PEO 粉末 2.4 g 溶於 100 g (100 c.c.)的醋酸溶液中，形成 4wt %的水 溶液，用磁石攪拌器攪拌至完全溶解，過濾後即可使用。
靜電紡絲設備裝置圖如下(圖 3.1)，我們把靜電紡絲參數設定距離 為 12.0 cm、推進速率 0.5 ml/hr、6.0KV，噴出時間 20 小時。並根據 此組參數，將調配好的 Chitosan/PEO 溶液依靜電紡絲裝置抽出纖維，
並在金屬網上收集到 Chitosan/PEO 薄膜。
圖 3.1 靜電紡絲設備裝置實體圖
靜電紡絲製備好的幾丁聚醣纖維薄膜外觀呈現白色薄片樣，極易破
損碎裂，小心地從離心紙上取下後，用掃描式電子顯微鏡(SEM)觀察幾 丁聚醣纖維薄膜之奈米纖維結構。從照片中可清楚看到細小的白色纖維 細絲，呈無方向性的不織布形態排列，其周圍佈滿大小不等的白色珠 粒，纖維與珠粒之間充滿不規則的間隙(圖 3.2)。從 10μm 及 5μm 放大 比例的照片可看出實驗結果所得到的幾丁聚醣薄膜纖維均達到奈米等 級標準(介於 1~100 nm 的範圍內)。
圖 3.2 紡織纖維膜在掃描式電子顯微鏡下的情形(上二圖為 10μm，下 圖為 5μm)
3.2.2 將纖維膜填充入矽膠管中
製備完成的矽膠管外觀呈無色透明，導管內部為中空，共 16 根。
此 16 根矽膠管隨機分為 2 組，一組當對照組用，不放入幾丁聚醣薄膜，
為矽膠管空管，共 8 根；另一組當實驗組用，待幾丁聚醣薄膜製備完成 後將置入管內，共 8 根。
確定達到奈米等級標準後，將幾丁聚醣纖維薄膜裁成長 10 mm，寬 4.3 mm 的長方形纖維膜(圖 3.3)，並捲曲成圓柱管狀，填充置放入長 12 mm 的實驗組矽膠管中。放入幾丁聚醣薄膜時，導管前後端各留 1mm 的距 離，以便縫合入截斷後的大鼠坐骨神經時保有 10 mm 的間隙，此即為本 實驗的實驗組神經導管，共 8 根。
圖 3.3 幾丁聚醣纖維薄膜外觀
3.3 動物實驗
我們以矽膠管填充幾丁聚醣纖維薄膜來評估對截斷大鼠坐骨神經 再生的影響，觀察重點包含實驗大鼠外觀的變化、電生理功能評估、神 經再生情形及術側腓腸肌萎縮程度等項。
3.3.1 動物分組、麻醉與消毒
實驗動物則選用雌性 Sprague-Dawley (SD)大鼠 16 隻，重量為 251-326 g，隨機將大鼠分為 2 組: 麻醉機麻醉，初起劑量為 5 litter/kg.min，等大鼠昏迷後自麻醉箱中 取出。利用塑膠管輸送麻醉劑，此時將麻醉劑量改為 5 litter/kg.min，
並將此塑膠管套於大鼠鼻上，保持其麻醉狀態。 (greater trochanter of fermur )及外側豆狀骨(lateral fabella)予 以定位，並用刀片延此兩點之連線劃開皮膚，鈍性分離股二頭肌(biceps femoris muscle)與筋膜，游離出長約 2.5 cm 的坐骨神經。在距梨狀肌 (piriformis)下緣約 8 mm 處，用剪刀整齊剪斷坐骨神經幹，再取已滅 菌之神經導管，以 9-0 Nylon 縫合線將神經近側斷瑞固定在神經導管其 中一端距導管邊緣 1 mm 處，並使斷端伸入管中，用同樣的方式，將神 經遠側斷端固定在神經導管另一端距導管緣 1 mm 處，也使斷端伸入管 中而製造出 l0 mm 的間距(圖 3.4)。神經與神經導管縫合完畢後，以 4-0
Catgut chrom 縫合肌肉及皮膚。
圖3.4 神經斷端與矽膠管縫合的步驟。9-0 nylon 自矽膠管之外端穿入
（1），然後穿過斷端之神經外膜（2），最後自矽膠管之內側穿出（3），
神經藉著少許張力帶入矽膠管內，並在矽膠管內的外側打結固定
手術完畢後，測量大鼠體重，並將大鼠置回籠子，照光維持體溫，
等待動物甦醒。以抗生素 Pamoxcillin 1 g 溶解於 100 ml 逆滲透水中，
當作兩天份的自由飲水，預防傷口感染。並在飼養期間定期觀察大鼠的 飲食、大小便、傷口、毛色、活動情形與是否自殘等。
3.3.3 動物飼養環境
實驗動物之飼養環境為空調房間，一個塑膠籠子飼養 2 隻大鼠，溫 度維持 22 ± 3 ℃，相對溼度 55 ± 5 %，半日照環境，自由飲水及餵養 標準大鼠實驗飼料(福壽公司，台灣)。
3.3.4 觀察實驗大鼠外觀的變化
動物犧牲前，在上述飼養環境中飼養大鼠，並觀察大鼠的飲食、傷 下，置入 3.7 % Formalin solution 中保存。之後取樣本中間部份做切 片，以 Parffin wax 包埋，切片厚度為 12μm，並以 Hemnatoxylin and eosin 染色。
再 生 神 經 組 織 連 同 神 經 導 管 與 兩 側 神 經 幹 ， 浸 泡 於 2.5 %
Glutardialdehyde 三天後取出，利用刀片將導管均分為三等分。將中間 三分之一以刀片輕輕劃開，把中央的再生神經組織剝下，過程中需注意 保 持 其完 整 ；將 再 生神 經 組織 置 入含 2.5% Glutardialdehyde、 4%
Paraformaldehyde 及 0.lM Cacodehyde 混合液中。兩天後將神經取出，
以 1% OsO4固定約二小時，再以 50-100%酒精脫水。用樹脂包埋後，將再 生神經組織之樹脂置入 60-70℃ 烤箱中約 16 小時。待樹脂硬化，隨後 將包埋的再生神經組織作橫向 lμm 切片後，以 Toluidine blue 染色，
髓鞘與 Schwann cell 會明顯呈色。對再生神經組織切片先以接於顯微 鏡的數位相機(Nikon Coolpix 950，Japan)拍下數位影像。
第四章 結果
4.1 神經導管接合術實驗
4.1.1 實驗大鼠外觀的變化
存活情形
此次實驗，大鼠全部順利存活至飼養期滿而犧牲。
行動方面
坐骨神經截斷後一週內，大自鼠右後肢有明顯的癱瘓現象，行動以 前肢及左後肢為主，拖曳著右後肢而行，步態不穩，有時甚至踡縮在角 落。實驗過程中整體行動上的改變並不多。
毛色方面
神經截斷後，剃毛區逐漸長出正常鼠毛，毛色則隨時間增長逐漸由 原本光澤的白色轉為淡黃無澤，但並未出現脫落的情況。
傷口方面
術後將抗生素溶解於逆滲透水中當作自由飲水，預防傷口感染。各 組動物傷口乾淨，癒合情況良好，無感染發生。
重量變化
各組大鼠於截斷神經前及犧牲後，分別記錄大鼠體重(表 4.1)。大
足趾自殘
神經截斷後，大鼠足趾就陸續有自殘的現象發生。術側咬傷的足趾 有出血與傷口，進一步造成潰瘍與變形，但大部分大鼠足趾是完整的。
大鼠犧牲前傷口泰半已經癒合，外觀大多為外側足趾及腳掌的缺損，少 數伴有潰瘍或足跟腫脹(如圖 4.1)。
圖 4.1 大鼠足趾自殘外觀。左圖為實驗組，右圖為對照組。
矽膠管外觀觀察
截斷神經後六週，經麻醉剃毛，於右下肢後外側縱行切開皮膚，將 股二頭肌及矽膠管外部的纖維組織剝離，暴露出植入大鼠的矽膠管(圖 4.2)。剝除異物膜後，發現實驗組及對照組矽膠管中皆有不成形的膠狀 棕色物質及一些黃褐色液體，對照組在矽膠管中則可見白色再生管狀物 通過。
圖 4.2 6 週取出神經導管前的外觀圖
4.1.2 電生理檢測分析
波形代表意義如圖 4.3
圖 4.3 電生理檢測波形代表意義
電生理檢測結果主要包含波幅(amplitude)、波期(duration)、面 積(area)與神經傳導速度(NCV)。波幅代表神經纖維數目、傳導速度的 一致性、及肌纖維產生活動電位的能力；波期則代表不同神經纖維的相 對速率。面積是指波幅和波期所形成的曲線下的總和，可更精確地作為
波期
神經纖維數目的指標。統計結果發現除波幅外，各組間均未達顯著差異:
表 4.2 續
表 4.3 續
表 4.4 兩組面積(mVms)之數據與統計結果
表 4.4 續
表 4.5 續
的緊密排列，細胞核則位於肌細胞的周圍。而坐骨神經截斷側(圖 4.4) 可見到橫紋肌萎縮的現象，肌纖維不管是實驗組或對照組直徑皆明顯變 小，肌纖維間的間隙變寬且較疏鬆。
圖 4.4 實驗大鼠術側腓腸肌切片。上圖為實驗組大鼠腓腸肌切片，下圖 為對照組腓腸肌切片(比例尺 40 μm)
4.1.4 評估神經再生情形
由圖 4.5 及圖 4.6 可知，實驗組(纖維薄膜組)在顯微鏡下可見淡綠 色物質，而對照組卻無，研判這應是未降解完全的幾丁聚醣成分。
圖 4.5 實驗組顯微鏡 100 倍下的再生神經切片(比例尺 40μm)
圖 4.6 對照組顯微鏡 100 倍下的再生神經切片(比例尺 40 μm)
實驗組則有巨噬細胞，沒有見到具髓鞘的神經軸突。而對照組(矽 膠管空管)則有具髓鞘的神經軸突再生，髓鞘被染成深藍色，髓鞘環內 的軸突則呈現較淡的顏色。
圖 4.7 實驗組顯微鏡 400 倍下的再生神經切片(比例尺 10 μm)
圖 4.8 對照組顯微鏡 400 倍下的再生神經切片(比例尺 10 μm)
第五章 討論
5.1 神經導管接合術實驗
5.1.1 實驗大鼠外表的變化
大鼠右坐骨神經遭截斷並經導管接合兩神經斷端後，大鼠右後肢有
大鼠右坐骨神經遭截斷並經導管接合兩神經斷端後，大鼠右後肢有