sequencing
儀器：
PCR machine (Astec PC320)
PCR gradient machine (Astec PC-818A)
超高速離心機Model J2-21 centrifuge (Beckman) Microplate autoreader EL-311 (Bio-TEK)
TD-20/20 Single-Tube Luminometer (Turner Biosystems) Dry Bath Incubator (Major Science)
Plasmids：
pGEM-T Easy Vector (3015 bp)
pGL3-Basic-pcDNA modified Vector (6079 bp) phRG-TK Vector (4843 bp)
pERV3 (8.4 kb) pEGSH (4.8 kb) pEGSH-luc (6.4 kb)
(二) 實驗方法
(1)神經母細胞瘤株 SK-N-SH 及 IMR32，OTEX 基因表現之 分析：
1.RNA 之萃取：
取細胞 (2 x 106個) 離心 1200 rpm 5 分鐘，去除上清液。加入 0.5 ml TRIzol (Invitrogen)，室溫放置 5 分鐘。加入 0.1 ml 氯仿，劇烈震
盪15 秒，室溫放置 3 分鐘。於 4 ℃ 12000 rpm 離心 15 分鐘。取上清 液， 加入 0.25 ml 異丙醇，室溫放置 10 分鐘。於 4 ℃ 12000 rpm 離 心10 分鐘。去除上清液，加入 0.5 ml 75%酒精。於 4 ℃ 7500 rpm 離 心10 分鐘，去除上清液。真空加熱，乾燥 RNA，去除殘留酒精。加 入20 μl 60℃ DEPC-H2O，充份溶解，並保存 RNA 於-70 ℃。
2.反轉錄 PCR (reverse transcription PCR)：
1.取 Oligo dT (500 μg/ml) 1 μl、RNA 1-5 μg 補水至 16 μl
2.70 ℃加熱 10 分鐘
3.加入 10X Stratescript (Stratagene) buffer 2 μl、0.1 M DTT 2 μl 及 10 mM dNTP 1 μl，於 37℃反應 2 分鐘
4.加入 RNase inhibitor (40 U/μl) (波仕特) 2 μl、Stratescript (50 U/μl) (Stratagene) 1 μl，於 37℃反應 2 小時
5.利用引子 B-actinF’、B-actinB’引子，當做對照組：denature 溫度是 94 ℃ for 5 min，之後進行 35 cycles 之反應：94 ℃ for 1 min，49 ℃ for
1 min，72 ℃ for 2 min，final elongation：72 ℃ for 10min。
6.也利用兩對引子 AI-631510-F 及 B，TPX-1F 及 B 來作為偵測 OTEX 表現用：AI631510-F、AI631510-B，先 denature：94 ℃ for 5 min，才
進行35 cycles：94 ℃ denature for 1 min，56 ℃ for 1 min，72 ℃ for 2 min，最後 elongation：72℃ for 10min，另一組引子 TPX-1F、TPX-1B，
先denature 94℃ for 5 min，才進入 35 cycles：94℃ for 1 min，55℃ for 1 min，72℃ for 2 min，最後 elongation：72 ℃ for 10min。
(2)利用 Real-time PCR (TaqMan PCR)分析 BPH , PCa 病人 PSA ( KLK3 )和 OTEX 的表現情形
1.抽前列腺組織RNA：
參考Invitrogen TRIzol Reagent Protocol，秤 取10 pg~5 μg的前列腺組織塊(由臺北醫學大學附設醫院泌尿科及病 理科提供)，用180℃隔夜烘乾的剪刀剪碎，放入研缽中，然後倒入液 態氮，把組織磨碎，把磨碎組織倒入15 ml離心管，加入1 ml Trizol reagent，於室溫反應5分鐘，加入0.2 ml chloroform，均勻震盪15秒，放在室溫3分鐘，於4℃下離心11.5G 15分鐘，取上清液放入另一 eppendorf中，加入0.5 ml isopropyl alcohol，上下翻轉3次，於室溫下 反應10分鐘，再於4℃離心11.5G 10分鐘，去上清液，以0.5 ml 75%
alcohol 洗RNA沉澱物，倒掉上清液，加1 ml 75% alcohol，左右上下
輕搖數次，於4°C離心7500轉5分鐘，小心倒掉上清液，用真空抽乾，
加入約20 μl DEPC-H2O溶解後，測OD260/280定量，分裝5 μg RNA於 eppendorf中，儲存於-70℃冰箱中。
2.反轉錄作用：
取10 pg~5 μg的mRNA，加入1 μl oligo(dT) (50 μM) 及1 μl (50 μM)的random primer及1 μl 10 mM dNTP mix加入微離心管 內，加滅菌水到總體積為13 μl，原混合液在65℃加熱5分鐘，置於冰 上至少1分鐘後，把微離心管快速離心，然後加入4 μl 5X First-Strand Buffer、1 μl 0.1 M DTT、1 μl RNaseOUT Recombinant RNase Inhibitor 及1 μl SuperScript III RT反轉錄酶，藉由pipetting混合均勻。如果使用 random primer作反應，此時先把微離心管先放在25℃作用5分鐘。把 微離心管放在50°C作用30分鐘到1小時，進行反轉錄反應。再把溫度 提高到55℃ 10分鐘以避免模板產生特殊二級結構。最後利用70℃ 15 分鐘讓酵素去活化。經此反應完成之單股的cDNA可以當成PCR反應 的模板。3.聚合酶連鎖反應確認測試：
取10 倍稀釋的模板 cDNA 1 μl，加入10X buffer 1.5 μl、2.5mM dNTP 1.2 μl、forward primer 及 backward primer 各 0.5μl、Taq 0.1 μl 及 H2O 10.3 μl，進行 PCR 反應(利用 B-actinF’ 、 B-actinB’ ， PSA3’-F、PSA3’-B ， TPX-F、AI631510-B primer) 確認 cDNA 品質。
4.Real-time PCR：
利用 ABI 網站 (www.appliedbiosystems.com)的”Search for TaqMan® Gene Expression Assays” 的 找 尋 適 當 的 primer，選擇跨內子的 primer，所採用的 primer 分別是 Hs00426859_g1 (KLK3) 和 Hs00411370_m1 (OTEX) 。由陽明大學”微陣列及基因表 現分析核心設施”協助完成 Real-time PCR，上機前先做 QC，把 QC 通過的samples 拿去上機，samples 沒過的，仍有一次補 samples 的機 會，補samples 之後仍會做 QC，仍沒過的 samples 需要簽切結書才會 做，最後把做出來的samples data 以 EXCEL 檔寄回，反應流程如附 圖二。 CT值為樣品PCR 反應突破 threshold line 所需要的循環數， 需 選取在PCR 呈現對數期增加之區域，計算公式為 C△ T = CT ( KLK3 or OTEX )－CT (β-actin )，而 OTEX RNA 相對於 β-actin RNA 為 C△ T， OTEX RNA 相對於 β-actin RNA 的表現量＝2－△CT，而且△△CT = C△ T
（ＰＣａ）－△CT（ＢＰＨ），為比較 KLK3 或 OTEX 基因在不同程 度病人的表現情形。