原理：MTT assay 是常用於測定細胞存活率的分析方法， MTT (3- ( 4,5dimethyl – thiazol - 2-yl) - 2,5-diphenyltetrazolium bromide )為一種 水溶性、呈現黃色的tetrazolium 鹽類。此鹽類若與細胞之粒線體中的 去氫酶作用，其鹽類結構中的tetrazolium ring 會被切斷，形成紫色非 水 溶 性 的 formazan (1- ﹝ 4,5-dimethyl-thi-azol-2-yl ﹞ -2,5- diphenyl-formazan) ， 以 DMSO 溶 解 之 ， 在 此 利 用 enzyme-link immunosorbent assay（ELISA）reader 分析，在波長 570 nm 下測其吸 光值，因為只有活的細胞具有活性粒線體去氫酶酵素(如附圖七)，若 吸光值愈大，則表示細胞存活率愈高，故所測得的吸光值與細胞存活 率成正比，因此我們可利用formazan 產量多寡評估細胞存活率。
方法：MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl
Tetrazolium , bromide) 製備 (最終濃度0.5 mg/ml)：100 mg MTT 溶於 18.18 ml PBS溶液中，在24wells中，每well加入50 μl MTT，置入37℃
培養箱，反應2小時。吸去上清液，每well加入500 μl DMSO，輕輕搖 晃，使結晶溶解，將紫色上清液取出加入到96 well盤之其中2 well內，
以570 nm測吸光值。
伍 、 結 果
(1)分析神經母細胞瘤株 SK-N-SH 及 IMR32 表現 OTEX 基因之情形，
結果我們發現這2 株細胞株並沒有表現 OTEX 基因，如圖十二。
(2)由於 GenBank database 之資訊日新月異，我們之前實驗室已由 Zoo blot 分析得知 OTEX 只存在 human genome 中，但我們仍持續搜尋 OTEX 基因在其他物種存在之情況，結果我們發現黑猩猩的 X 染色體
上有和人類 OTEX 非常相似之區域，由於目前並尚未有黑猩猩 OTEX 之EST clone，我們只由基因組序列比對，做一個人類的 OTEX 基因 序列和黑猩猩的比較不同相異處圖，圖中把相異處用三角形標示出來 並註明相異核苷酸，如圖十三所示。
(3)利用real-time PCR檢測我們由前列腺組織萃取出來的RNA經反轉 錄作用獲得cDNA，送至國立陽明大學”微陣列及基因表現分析核心設 施”協助，後續Real-time PCR ( TaqMan PCR )之工作 (如附圖二)，所 得到之CT值可反應出目標cDNA的最初量，且與最初量呈反比的比率。
我們可利用CT值的高低比較BPH，PCa病人的前列腺組織KLK3 ( PSA )
和OTEX 的表現量，以β-actin RNA的表現量來當作內生性的控制組，
在KLK3 (PSA) 中，BPH的平均 C△ T為-7.1720，PCa的平均△CT為 -6.6056，KLK3 (PSA) △CT的t-test結果P=0.66818，沒有達到統計上的 意義，而△△CT = △CT (PCa)-△CT (BPH) = -6.6056- (-7.1720) =
C (0.5664)
PCa/BPH=0.6753，在OTEX中， BPH的平均△CT為8.6126， PCa的 平均△CT為8.7996， OTEX △CT的t-test結果P=0.9195沒有達到統計上 的意義，而△△CT=△CT (PCa) - △CT (BPH) = 8.7996 - 8.6126 = 0.187，
Relative Quantity=2－△△CT=2－(0.187) =0.8784，所以the ratio of PCa / BPH
=0.8784，因此KLK3 (PSA) 基因表現量在PCa相對於KLK3 (PSA)基因 表現量在BPH為0.6753， OTEX基因表現量在PCa相對於OTEX基因表 現量在BPH為0.8784。
(4)OTEX 啟動子由 BAC clone “RP11 42G24” ( 由王憶卿老師實驗室 提供 ) 作 PCR 放大，把 PCR products 接入 pGEM-T Easy vector 中，
利 用 限 制 酶 構 築 出 四 種 啟 動 子 片 段 的 冷 光 載 體 ， 用 DLR (dual luciferase reporter assay) 藉由冷光的表現量來測試啟動子的活性，結
果顯示在圖四 A 圖中存在預期 ARE site、SRF site 和 T-Ag site，當 R1881 加入時，RLA(relative luciferase activity)比值降低，推測可能具 有ARE silencer，抑制啟動子活性，雖然具有 ARE site 但是啟動子恢 復活性抵不過被抑制，所以加 R1881 後，冷光值降低，在圖四 B 圖 中具有T-Ag site 缺少預期 ARE site、SRF site 和，當 R1881 加入時，
RLA(relative luciferase activity)比值也降低一些，推測啟動子可能具有 弱的ARE silencer binding site，抑制啟動子活性，但是在圖四 C 圖中
缺少預期 ARE site、SRF site 和 T-Ag site，當 R1881 加入時，
RLA(relative luciferase activity)比值稍微升高，推測可能缺少 ARE site，使得啟動子活性恢復，以及缺少強的及弱的 ARE silencer binding site，啟動子活性不被抑制，所以啟動子活性升高一些，在圖四 D 圖
中存在預期ARE site，缺少 SRF site 和 T-Ag site，當 R1881 加入時，
RLA(relative luciferase activity)比值明顯升高，推測可能缺少強的及弱
的 ARE silencer binding site，抑制啟動子活性，但是具有預期 ARE site，在加入 R1881 時，使得啟動子活性升高。
(5)利用 G418 篩選已經做 pERV3 基因轉殖的 PC3 前列腺癌細胞，篩
到的細胞分stable clone 和 clonal clone，把篩到的 clone 用 control 質 體”pEGSH-luc”做 transient transfection，做二重覆 (duplicate) 確認，
做transient transfection 隔 1 天後，把 PonA 配成 5 μM，10 μM F12K，
換入 24 wells 內，等 12 小時後，測 luciferase 活性，來確認 pERV3 是否有進入PC3 細胞內，把冷光測出的值高的，即表示 pERV3 有進 入細胞中，所以後來活性高的有stable 1、clonal 1、clonal 3，把這些 細胞株轉入pEGSH-OTEX cDNA inducible 質體，用 hygromycin 做篩 選， 使用 200 μg/ml hygromycin 篩選轉殖 pEGSH-OTEX DNA 的 pERV3-stable1、pERV3-clonal 1、pERV3-clonal3 PC3 細胞，篩選一個
星期後，降低濃度至 50 μg/ml 使得篩完的細胞維持增生到一定數 量，以進行後續實驗分析。