已經有不少研究證實，白色脂肪細胞在 PPARγ ligand 刺激下，會使細胞出現 褐化現象，牽涉了不少和粒線體相關的基因，如UCP1 和 cytochrome oxidase (Cox) (Wilson-Fritch et al., 2003; Wilson-Fritch et al., 2004) ，而轉錄因子 PPARγ 本身在 UCP1 基因表現的調節上也扮演了很重要角色。給予小鼠合成的 PPARγ agonist，
也可刺激WAT 出現褐化現象，並抑制白色脂肪相關基因的表現 (Vernochet et al., 2009) 。
UCP1 主要表現在棕色脂肪組織，具產熱的功能。由於 UCP1 基因表現會受 PGC1α 調節，而 PGC1α 也會與 PRDM16 共同作用，增加棕色脂肪相關基因表現，
如Cidea (Seale et al., 2008) 等。在 cAMP 刺激下，過度表現的 C/EBPβ 會和 CRE 結合，增加白色及棕色脂肪細胞中PGC1α 及 UCP1 的基因表現 (Karamanlidis et al., 2007) 。先前研究指出，給予正常鼠及 ob/ob 鼠 non-TZD PPARγ agonist 後，對於 β-adrenergic 的刺激，都有相當大的生熱潛力 (thermogensis) (Sell et al., 2004)，顯 示這兩種機制彼此有關。而最近研究指出，forskolin 與 rosiglitazone 具協同作用，
共同刺激HIB-1B 棕色脂肪細胞株的 UCP1 mRNA 表現，作用機制可能是直接作 用於UCP1 的啟動子上，並牽涉 PKA 和 PPAR 的訊息傳遞系統 (H. Y. Chen et al., 2013) 。
本實驗結果，在低濃度 (0.2-5 μg/mL) 的山苦瓜乙酸乙酯萃物暨其區分物處理 下，能顯著增加3T3-L1 脂肪細胞棕色脂肪相關基因的表現，可能與文獻 (Chao &
Huang, 2003) 指出苦瓜中含有 PPAR 活性成分所導致相關。脂肪細胞在 EAE 及 NS
增加脂肪細胞中C/EBPβ 的基因表現。而另外給予 forskolin 刺激，C/EBPβ 的基因 表現也有顯著增加的現象，其中S 與 forskolin 共同刺激下，C/EBPβ 增加幅度 (3 倍) 也是高於另外兩組 (EAE + forskolin, NS + forskolin) ，和 UCP1 的結果類似。
推測山苦瓜乙酸乙酯暨其區分物也可能透過cAMP-PKA 訊息傳遞機制，與 forskolin 共同調節UCP1 表現，而其中又以 S 效果最顯著。而山苦瓜乙酸乙酯暨其區分物 處理脂肪細胞後再給予forskolin 刺激，並無顯著增加 CS 活性，顯示單獨給予山苦 瓜萃物即能有效調節粒線體的活性。
PGC1α、Tfam (mitochondrial transcription factor A) 與 NrF1 (nuclear respiratory factors) 均為粒線體生合成重要的轉錄調節因子 (Z. Wu et al., 1999) 。PGC1α 除了 能調節粒線體生合成，也透過活化許多轉錄因子 (如 PPARα、PPARγ) 來參與細胞 的氧化代謝途徑。根據本實驗結果，PGC1α 的基因表現在乙酸乙酯萃物暨其區分 物刺激下有增加的現象，但Tfam 和 NrF1 mRNA 表現在各種萃物處理下和對照組 相比並無顯著差異。值得注意的是，在低濃度EAE 處理下，脂肪細胞的粒線體 CS 活性有增加的現象，和PGC1α 的基因表現結果一致，推論 EAE 能刺激 PGC1α 的 基因表現，調節和粒線體呼吸相關的基因，而非調控Tfam 和 NrF1 的表現來增加 粒線體的生合成。
Cidea 會高度表現在小鼠的棕色脂肪組織當中，故被認為是 BAT 的指標之一。
Cidea 會直接或間接受到 PPARγ 的調控，當給予 PPARγ agonists 刺激，在小鼠初代 脂肪細胞或分化成熟的3T3-L1 脂肪細胞皆可觀察到 Cidea mRNA 表現增加 (Puri et al., 2008) 。本實驗也觀察到，Cidea mRNA 表現在 EAE 及 NS 處理下也有增加 的情形，顯示脂肪細胞可能受到苦瓜萃物中PPARγ 活性成分的影響，進而調控 Cidea 的表現，使白色脂肪細胞出現 BAT 的特性。
Prdm16 為轉錄調控因子，可調控棕色脂肪的分化。aP2-PRDM16 基因轉殖小 鼠，可以調控PGC1α、Cidea 及 UCP1 等基因表現增加，進而使 WAT 出現褐化的 現象 (Seale et al., 2011) 。而根據本實驗結果，Prdm16 基因表現並不受苦瓜萃物所
影響，推測PGC1α、Cidea 及 UCP1 基因表現的增加，並非由 PRDM16 所調控。
Cox (cytochrome c oxidase) 於粒線體氧化機轉中扮演很重要的角色，其中 Cox7a1 及 Cox8b 均與粒線體電子傳遞鏈有關。本實驗結果顯示，Cox7a1 基因表現 並不受苦瓜萃物的影響，而Cox8b 的基因表現量雖有增加卻無顯著差異，此結果 與粒線體CS 活性增加似乎不相平行。
白色脂肪相關基因表現，Retn 是一種由脂肪細胞分泌的細胞激素，其合成與 分泌會受到PPARγ agonists 的抑制 (Patel et al., 2003) 。Chemerin 是新發現的脂肪 因子，也會受到PPARγ 的調控 (Muruganandan et al., 2011) 。本研究結果顯示，山 苦瓜萃物似乎不會影響白色脂肪細胞中此二種基因的表現。
C/EBPα 在脂肪細胞分化過程中也扮演重要的角色，與 PPARγ 共同調控脂質生 成。有研究指出，PPARγ agonists troglitazone 抑制白色脂肪相關基因表現需要 C/EBPα 的存在 (Vernochet et al., 2009) 。而本實驗結果顯示，山苦瓜萃物雖可增 加C/EBPα 基因表現，但效果並不顯著，這可能是白色脂肪相關基因表現受抑制情 形不明顯的原因之一。
本實驗室先前的研究證實，山苦瓜乙酸乙酯萃取物為 PPARα 與 PPARγ 的雙效 活化劑 (Chao & Huang, 2003) 。由於部份褐化相關基因，如 Cidea 及 PGC1α 等都 會受PPARγ 所調控，而這些基因的表現也有增加，進一步證實山苦瓜乙酸乙酯萃 物能活化PPARγ，並刺激褐化相關基因表現。在本實驗中，白色脂肪細胞中 PPARα 表現在山苦瓜乙酸乙酯萃物暨其區分物處理下皆有上升的情形，而PPARγ 的表現 並無顯著差異。根據文獻，給予PPARγ agonists 長時間處理 (2 天) 下，會使 3T3-L1 脂肪細胞PPARγ 的基因表現受抑制 (Vernochet et al., 2009) 。而苦瓜乙酸乙酯萃物 雖為PPARγ 活化劑，但可能含量/濃度不如正對照組高，所以結果不太相同。
進而探討其中可能的活性成分。先前實驗室經分離純化，鑑定出苦瓜中
9c,11t,13t-CLN 為可活化 PPARs 之化合物 (Chuang et al., 2006) 。本實驗結果顯示，
CLN 能刺激褐化相關基因表現，如 PGC1α、UCP1、Cidea 及 Cox8b 等，和山苦瓜 乙酸乙酯萃取物處理結果相似。值得注意的是，給予CLN 處理有增加 Prdm16 及 Cox7a1 基因表現的趨勢，推測山苦瓜萃物有其他物質也可能會調節這兩種基因表 現，使EAE、S 或 NS 無法顯著增加 Prdm16 及 Cox7a1 的基因表現。CLN 對於白 色脂肪相關及PPARγ 基因並無顯著影響，但會增加 PPARα、C/EBPα 與 C/EBPβ 等轉錄因子mRNA 的表現，顯示 CLN 可能除了直接活化 PPAR 來增加褐化相關基 因表現，也能透過增加這些轉錄因子的基因表現來加強脂肪細胞褐化。
另外，山苦瓜不皂化物中分離出葉黃素 (lutein)、植醇 (phytol) 、loliolide 等 化合物亦具有活化PPAR 之能力 (徐瑨，2010) 。Phytol 的代謝產物 phytanic acid 能刺激棕色脂肪細胞的分化，並增加棕色脂肪細胞中UCP1 及 CO II 的基因表現 (Schluter et al., 2002) 。本實驗結果顯示 phytol 處理下，並無顯著增加脂肪細胞 PPARα 的基因表現，但 UCP1 與 Cidea 基因表現確實有增加的現象，而 Cox7a1 和 Cox8b 皆屬 Cytochrome c oxidase，同樣也有增加。由於 phytanic acid 也是 RXR agonist，能透過 RXR/PPARγ heterodimers 來增加脂肪細胞的脂質生成作用 (Tontonoz et al., 1997) 。也有文獻指出 phytanic acid 能增加脂肪細胞 PPARγ 及 PGC1α mRNA 基因表現 (Garcia-Rojas et al., 2010) ，和本實驗結果相符，推測 phytol 是透過調節 PPARγ 轉錄因子來增加脂肪細胞褐化相關基因。
Lutein 能與 PPARγ 作用，能在不影響棕色脂肪細胞增生下，提高 UCP1 蛋白 質的表現 (Serra et al., 1999) ，也能增加白色脂肪細胞 PPARγ mRNA 基因表現 (Garcia-Rojas et al., 2010) 。在低濃度 (8.75 μM) 處理下，能增加白色脂肪細胞褐 化相關基因表現，如PGC1α、UCP1、Cidea 等，顯示 lutein 如同 phytanic acid，能 透過調節PPARα 或 PPARγ 轉錄因子來增加脂肪細胞褐化相關基因表現。
第五節 結論
本研究所建立的 3T3-L1 脂肪細胞培養條件可為快速篩選具刺激褐化的苦瓜萃 物/區分物的試驗平台。山苦瓜乙酸乙酯萃物暨其區分物能有效增加此脂肪細胞的 褐化基因表現，但無法抑制白色脂肪相關基因表現，其中乙酸乙酯萃物也能增加 粒線體檸檬酸合成酶的活性。而自苦瓜中分離出的單一活性成分：CLN、phytol 和lutein，都可能具有刺激脂肪細胞出現褐化現象的潛力。