當能量攝取量大於能量消耗量，多餘的熱量以三酸甘油酯的型式儲存於脂肪 組織中。脂肪可分成白色脂肪 (WAT) 和棕色脂肪組織 (BAT) ，WAT 主要功能為 儲存能量；棕色脂肪則以熱的形式消耗能量，維持體溫。文獻指出，低溫環境下 或交感神經的刺激會導致棕色脂肪組織中的β-adrenergic receptor (β-AR) 活化，而 這樣的調控是由Peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) coactivator-1α (PGC-1α) 所刺激，可調控粒線體生合成、能量代謝 (Spiegelman et al., 2000) 、 UCP1 的表現來增加產熱作用 (Bostrom et al., 2012) 。另一方面，早期研究發現，
在低溫或交感神經的刺激下，會導致白色脂肪組織出現較深色的類棕色脂肪 (Cousin et al., 1992; Guerra et al., 1998) 。此種細胞，和棕色脂肪細胞同樣含有大量
粒線體及高度表現UCP1，並具生熱作用的潛力。目前也有研究指出，給予小鼠合
成的PPARγ agonists，可刺激 WAT 中出現此種類棕色脂肪細胞，並抑制白色脂肪 過多時的相關基因表現 (Vernochet et al., 2009) 。同時投予 β-adrenergic receptor (β-AR) 致效劑，則可使小鼠代謝速率增加、脂肪組織變小 (Sell et al., 2004) 。 本實驗室先前的研究證實，苦瓜乙酸乙酯萃取物為 PPARα 與 PPARγ 的雙效活 化劑 (Chao & Huang, 2003) 。經由分離純化，鑑定出 9c,11t,13t-CLN 為可活化 PPARs 之化合物 (Chuang et al., 2006) 。而山苦瓜乙酸乙酯萃物之不皂化物亦具有 活化 PPAR 之能力 (徐瑨，2011) 。先前研究也觀察到 C57BL/6J 公鼠給予餵食山 苦瓜全果凍乾粉末，能增加粒線體合成基因及白色脂肪組織中UCP1 mRNA 的表 現 (Lu et al., 2013) 。此外，Chao 等人給予高油飲食誘發肥胖的小鼠補充苦瓜仔油 (BMSO) ，能增加 WAT 中 UCP1 的表現以及促進 PKA 的活化 (P. H. Chen et al., 2012) 。以苦瓜汁凍乾物餵食 Sprague-Dawley 大鼠，發現其血清中正腎上腺濃度 較高 (Chan et al., 2005) 。這些文獻暗示，苦瓜中有會影響 β-AR 之訊息傳遞的成 分，配合PPARγ 的活化，進而導致白色脂肪褐化。本實驗以 PPARγ agonists 刺激 分化中之3T3-L1 脂肪細胞株為正對照組，觀察山苦瓜萃物是否能誘發出白色脂肪
第二節 材料與方法
一、白色脂肪細胞褐化實驗模式建立與最佳化
二、山苦瓜萃物促進白色脂肪細胞褐化
三、細胞株
3T3-L1 細胞株 (ATCC CL-173) 組織來源：embryo, Mus musculus
購自食品工業發展研究所 (BCRC 60159)
四、培養基與藥品試劑 (一) 細胞培養與分化 1. 培養基
藥品
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Gibco 11995) Bovine serum (BS, Gibco 16170)
L-glutamine (Gibco 25030)
2. 分化培養基Ⅰ
藥品
Stock conc. Working conc.
Dexamethasone (DEX, Sigma 4902) 0.25 mM 0.25 μM 3-Isobytyl-methyl-xanthine (IMX, Sigma I5879) 0.5 M 0.5 mM Insulin (Sigma I9278) 10 mg/mL 10 μg/mL Biotin (Sigma B4501) 400 mg/mL 100 ng/mL 分化方法一：10 % BS/DMEM (4 mM Gln)
分化方法二：10 % FBS/DMEM (4 mM Gln) 於使用前配置。
3. 分化培養基Ⅱ
藥品
Stock conc. Working conc.
Insulin (Sigma I9278) 10 mg/mL 10 μg/mL Biotin (Sigma B4501) 400 mg/mL 100 ng/mL
4. 0.25 % Trypsin-EDTA (GIBCO 25200) 5. 0.4 % Trypan blue solution (Sigma T8154)
(二) 檸檬酸合成酶活性測定 (Citrate Synthase activity assay)
藥品
Stock conc. Working conc.
Tris [Tris-(hydroxymethyl)aminomethan] 1 M 0.1 M
Triton X-100 10 % 0.25 %
Oxalacetic acid (Sigma O4126) 10 mM 0.5 mM
DTNB 2 mM 0.1 mM
Acetyl CoA, lithium salt (Sigma A2181) 2 mM 0.31 mM Tris 以 HCl 調製 pH=8.0，為 Tris-HCl buffer。
Oxalacetic acid 及 DTNB 於使用前配置。
(三) quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) 法分析基因表現 1. TRIZOL® Reagent (Invitrogen)
2. Choloform (Merck) 3. Isopropanol (Merck) 4. DEPC-H2O
5. 反轉錄試劑套組 High-capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems , P/N：4368814 )
6. 基因表現分析套組 Probe/primer assay ID：
Ppargc1a (peroxisome proliferator activated receptor, gamma, coactivator 1
α) (Mm01208835_ml)Ucp1 (uncoupling protein 1) (Mm01244861_ml)
Cidea (cell death-inducing DNA fragmentation factor, alpha subunit-like effector
A) (Mm00432554_m1)Prdm16 (PR domain containing 16) (Mm00712556_m1) Nrf1 (nuclear respiratory factor 1) (Mm01135606_ml)
Tfam (transcription factor A, mitochondrial) (Mm447485_ml)
Cox7a1 (cytochrome c oxidase subunit VIIa 1) (Mm00438296_m1)
Cox8b (cytochrome c oxidase subunit VIIIb) (Mm00432648_m1)
Cebpα (CCAAT/enhancer binding protein, alpha) (Mm00514283_s1)
Cebpβ (CCAAT/enhancer binding protein, beta) (Mm00843434_s1) Retn (resistin) (Mm00445641_m1)
Rarras (retinoic acid receptor responder (tazarotene induced) 2)
(Mm00503579_m1)Ppara (peroxisome proliferator activated receptors α) (Mm00440939_ml) Pparr (peroxisome proliferator activated receptors γ) (Mm00440940_ml) Ppard (peroxisome proliferator activated receptors δ) (Mm00803184_ml)
Actb (actin, beta) (Mm00607939_s1)Gadph (glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase) (Mm99999915_gl)
7. 2× Taqman® Univeral PCR Master Mix (Applied Biosystems, K00861)(四) 處理藥品
藥品
Stock conc. Working conc.
Troglitazone (Enzo 3-H2315r) 5 mM 5 μM Dimethylsulfoxide (Sigma D2650)
Forskolin (Sigma F6886) 10 mM 10 μM 配置於10 % BS/DMEM (分化方法一) 或 10 % FBS/DMEM (分化方法二) 。
五、儀器設備
1. 二氧化碳培養箱 (REVCO RCO, Thermo Forma 3100) 2. 無菌操作台 (ESCO AC2-4S2)
3. 倒立式顯微鏡 (Nikon DIAPHOT) 4. 細胞計數器 (Hausser Science) 5. 微盤分析儀 (BioTek EL311) 6. 離心機 (KUBOTA 6500)
7. 基因定量分析儀 (ABI PRISM 7000 Sequence Detection) 8. 冷凍乾燥機 (SFD-25)
六、山苦瓜萃物之製備
(一) 山苦瓜乙酸乙酯萃物暨其區分物
本試驗使用花蓮縣吉安鄉改良場所提供之花蓮四號山苦瓜，經清洗、去蒂切 片、冷凍乾燥後，經研磨後取得山苦瓜全果凍乾粉末置-20 ℃儲存。山苦瓜凍乾粉 末以20 倍乙酸乙酯攪拌進行萃取隔夜，以 Whatman No.2 濾紙進行抽氣過濾，收 得乙酸乙酯苦瓜萃取液。將萃取液經減壓濃縮後即製成山苦瓜全果凍乾粉末乙酸 乙酯萃物 (ethyl acetate extract ，EAE) ，萃率約 5 %。取山苦瓜乙酸乙酯萃物，
溶於五倍體積之四氫呋喃 (THF) 中，再加入同體積之 40 % 氫氧化鈉溶液，以 60
℃ 加熱攪拌 16-20 小時。反應液先經減壓濃縮去除有機溶劑 THF 後，改加等量 之正己烷，與水層進行3-5 次萃取。收集上層之正己烷，以水洗至中性後，經減壓 濃縮後收得不皂化物 (non-saponification，NS) ，萃率為約 5 %。而水層部份加入 鹽酸，使其酸化至pH=2 後，加入等量乙酸乙酯萃取兩次，取上層乙酸乙酯層，以 水洗至中性後，減壓濃縮即可得皂化物 (saponification，S) ，萃率為 67 %。樣品 stock 皆配置於絕對酒精，EAE 及 S 濃度為 50 mg/mL，NS 濃度為 25 mg/mL，分 裝後存放於 -20℃。
(二) 山苦瓜水萃物
將100 g 山苦瓜全果凍乾粉末添加 20 倍 (w/v) 去離子水，於 60℃ 攪拌萃取 隔夜，以5000 g 離心 5 分鐘後取上清液，以 Whatman No.2 濾紙過濾，所得濾液為 山苦瓜全果水萃物 (water-soluble extract；WE) 。
(三) 經 5 % 黑豆漿培養之納豆菌處理山苦瓜水萃物
納豆菌 (Bacillus subtulis natto) 在 3 ml LB 於 37 ℃，125 rpm 活菌 12 小時後，
取適量菌液培養於5 % 黑豆漿，37 ℃，125 rpm，12 小時，離心去除上清將納豆 菌移至山苦瓜果汁中培養24 小時。以 5000 g 離心 5 分鐘後取上清液，以 Whatman No.2 濾紙過濾，所得濾液為納豆菌作用之山苦瓜全果水萃物 (WEn) 。
七、實驗方法 (一) 細胞培養
3T3-L1 前脂肪細胞株以 10 % BS/DMEM 培養於 37 ℃、5 % CO2中。當細胞 長至八分滿，移除培養基，以 PBS 清洗細胞兩次，加入 0.25 % trypsin-EDTA 均
下。取少許懸浮細胞以trypan blue solution 染色，以細胞計數器於倒立式顯微鏡計 算細胞數，將2.5×105 細胞數種入新 75 cm2 培養瓶進行繼代培養，每 3 日繼代培 養一次。
(二) 細胞分化
當脂肪細胞於 75 cm2培養瓶生長至八分滿，以0.25 % trypsin-EDTA 將細胞脫 附後，以10 % BS/DMEM 將細胞洗下，經細胞計數後，以 6×104細胞數種入12 孔 平底培養盤，培養於37 ℃、5 % CO2中，3 日後可達全滿 (confluence) ，更換培 養基，繼續培養兩日 (post-confluence) 後，改以分化培養基Ⅰ (DMⅠ) 培養 3 日。
3 日後更換為分化培養基Ⅱ (DMⅡ) ，每 2 天更換一次 DMⅡ。分化法一：培養 8 天後換回不含胰島素之basal medium，繼續培養 4 天，即分化完成；分化法二：培 養4 天後換回不含胰島素之 basal medium，繼續培養 4 天，即分化完成 (如圖示)。
(三) 蛋白質測定 1. 原理
BCA 法蛋白質使 reagent 中銅離子由二價轉為一價，再以 BCA 與一價銅離子 結核並呈紫色，在波長540 nm 具吸光。本實驗法對於陰離子、非離子性及二價離 子的清潔劑 (anionic, non-ionic, zwitterionic) 、guanidine-HCl 和尿素較具容忍性，
且較不受干擾。
2. 實驗步驟
將溶於1 N NaOH 之細胞溶液，取 25 μL 於 96 孔盤中，並將 kit 中的 A 液與 B
(四) 樣品處理
脂肪細胞分化完成前二日或前四日，加入含 5 μM troglitazone 或苦瓜樣品的 10 % BS/DMEM (或 10 % FBS/DMEM) 培養 2 天或 4 天，並以加入相同量的 dimethylsulfoxide (DMSO) 處理者為空白組。進行基因表現分析或粒線體活性測試 前，以10 μM forskolin 刺激 8 小時。
(五) 檸檬酸合成酶活性測定 (Citrate Synthase activity assay) 1. 樣品製備
每 1-2×106 cells/mL 細胞溶液取 110 μL 於液態氮結凍，供日後分析。
2. Reaction mixture
將 750 μL ddH2O、25 μL triton X-100 (0.25 %) 、50 μL DTNB (0.1 mM) 、50 μL oxalacetic acid (0.5 mM) 、25 μL acetyl CoA (0.31 mM) 混合均勻後，於 30℃ 水浴 5-10 分鐘後，加入解凍後之 100 μL 細胞液迅速混合均勻，取 1000 μL 於比色管中，
以未加入acetyl CoA 的溶液作為 blank，測定三分鐘內每 15 秒在波長 412 nm 的吸 光值，以蛋白質濃度校正後，測得檸檬酸合成酶活性。
(六) 基因表現 1. 總 RNA 抽取
樣品處理後之脂肪細胞吸除培養基，以PBS 潤洗細胞一次。加入 1 mL TRIZOL® reagent，吸放數次，移至 1.5 mL 微量離心管。12000 g，4℃ 離心 10 分 鐘，取上清液至新1.5 mL 微量離心管，靜置 5 分鐘。加入 0.2 mL choloform，震盪 15 秒後靜置 2-3 分鐘。12000 g，4℃ 離心 20 分鐘，取上清液至新的 1.5 mL 微量 離心管，加入0.5 mL isopropanol，上下倒置數次使之均勻，室溫 10 分鐘。12000 g，
4℃ 離心 10 分鐘，去除上清液，加入 75 % 酒精清洗一次 (7500 g，4℃ 離心 5 分鐘) 。室溫晾乾後以 10 μL DEPC-H2O 回溶，即得 RNA 溶液。以 Nano Drop 測 RNA 濃度，當 A260/A280比值接近2 時即為純化 RNA 樣品。
2. RNA 反轉錄成 cDNA
使用反轉錄試劑套組High-capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems , P/N：4368814 ) ，取 10 μL 0.5 μg/mL RNA 溶液加入 10 μL 2× Reverse Transcription Master Mix (2 μL 10× RT buffer, 0.8 μL 25× dNTP mix, 2 μL 10× RT
Random Primers, 1 μL 10× MulitiscibeTM RTase, 4.2 μL ddH2O) 進行反轉錄，轉錄條 件為25 ℃ 10 分鐘、37 ℃ 120 分鐘、85 ℃ 5 分鐘，最後冷卻至 4 ℃。轉錄完 成之cDNA 儲存於-20℃ 冰箱，待日後基因表現分析。
3. Real-Time PCR 分析脂肪細胞基因表現
採用市售2× Taqman® Univeral PCR Master Mix (Applied Biosystems, K00861) 分析細胞基因表現，以β-actin 作為 internal control (Mm00607939_s1) 。將 cDNA 稀釋成10 ng/μL，取 10 μL cDNA 加入 12.5 μL 2× TaqMan Master Mix, 1.25 μL 20×
probe/primers AssayMix 及 1.25 μL ddH2O，總體積為 25 μL。注入 ABI PRISMR Optical Strip 後蓋上蓋 (MicroAmp Optical Cap) ，離心去除氣泡後即可進基因定量 分析，條件為50℃ 10 分鐘、95℃ 10 分鐘、(95℃ 15 秒鐘、60℃ 1 分鐘) 共 40 個循環，所得之Ct 值進行換算以分析基因表現量。
算式：ΔCt = 目標基因 Ct 值－internal control (β-actin) Ct 值 ΔΔCt = 實驗組 ΔCt－空白組 ΔCt
Fold of change = 2 (-ΔΔCt)
(七) 數據整理及統計分析
重複三次以上獨立實驗，而每次獨立實驗皆有2-3 重複，數值以平均值 ± 標 準差 (mean ± S.D.) 表示。利用 excel 進行統計分析，以 Student's t test 檢定各組與 vehicle 組間差異之顯著性，當 p < 0.05 視為兩組在統計上具有顯著差異，以 * 做 標示。
第三節 實驗結果
一、白色脂肪細胞褐化實驗模式建立與最佳化
為建立最合適之細胞模式，本實驗比較兩種已建立之脂肪細胞培養方式，差 異在於分化培養基的使用，以及分化時間長短。
分化法一 (protocol 1)：分化培養基配置於 10 % BS/DMEM，分化時間約十五天 分化法二 (protocol 2)：分化培養基配置於 10 % FBS/DMEM，分化時間約十一天
(一) 分化成熟前 2 天，troglitazone 處理 2 天
↑/↓：5 μM troglitazone treatment；☆：harvest
(1) 分化法一：5 μM troglitazone 處理下，棕色脂肪相關基因 PGC1α、UCP1 與 Cidea 皆有顯著增加 (p<0.05 ~ p<0.005) ，其中 UCP1 顯著高於空白處理組，約 1.7 倍；粒線體生合成作用相關基因Tfam 有增加的趨勢，而 NrF1 和空白組並無顯著 差異 (p>0.05) ；白色脂肪相關基因表現上，Retn 顯著低於空白組 (0.6 倍) (p<0.005)，
而Chemerin 卻有增加 (1.3 倍) 的現象 (p<0.05) 。PPARγ 雖受抑制，但和空白組 並無顯著差異 (p>0.05) (圖 2-1 (A))。
(2) 分化法二：5 μM troglitazone 處理下，棕色脂肪 PGC1α、UCP1、Cidea 及粒 線體生合作用相關基因NrF1、Tfam mRNA 表現雖有增加的現象，但和空白處理組 並無顯著差異 (p>0.05) 。白色脂肪相關基因表現上，Retn 顯著低於空白組 (0.4 倍) (p<0.005) ，而 Chemerin 顯著增加 (1.2 倍) (p<0.005) ，PPARγ 則顯著受到抑 制 (0.6 倍) (p<0.005) (圖 2-1 (B)) 。
(二) 分化成熟前 2 天，troglitazone 處理 4 天
↑/↓：5 μM troglitazone treatment；☆：harvest
(1) 分化法一：5 μM troglitazone 處理下，棕色脂肪相關基因 UCP1 及 Cidea 皆顯 著增加 (分別為 3.3 及 4.4 倍) (p<0.05 ~ p<0.005) ，而 PGC1α 基因表現雖有增加的 趨勢，但和空白處理組並無顯著差異 (p=0.06) 。粒線體生合作用相關基因 Tfam 與NrF1 也顯著高於空白組 (分別為 1.4 及 1.2 倍) (p<0.05) 。白色脂肪相關基因 Chemerin 有顯著增加 (2.4 倍) (p<0.05) ，而 PPARγ 和空白組並無差異 (p>0.05) (圖 2-2 (A)) 。
(2) 分化法二：5 μM troglitazone 處理下，棕色脂肪相關基因 PGC1α (p<0.01) 及 cidea (p<0.05) 皆有顯著增加，粒線體生合作用 Tfam, NrF1 mRNA 表現也有顯著增 加 (分別為 1.4 及 1.2 倍) (p<0.05) 。白色脂肪相關基因 Retn 與 PPARγ 皆顯著低於 空白處理組，分別為0.4 及 0.5 倍 (p<0.005) (圖 2-2 (B)) 。
(三) 分化成熟前 4 天，troglitazone 處理 4 天
↑/↓：5 μM troglitazone treatment；☆：harvest
(p<0.01) 都有顯著增加。白色脂肪相關基因 Retn 顯著低於空白處理組 (0.6 倍) (p<0.005) ，而 Chemerin 卻顯著增加 (1.9 倍) (p<0.01) ，PPARγ 也顯著低於空白 組 (0.8 倍) (p<0.01) (圖 2-3 (A)) 。
(2) 分化法二：以 5 μM troglitazone 處理 4 天後，棕色脂肪 PGC1α、UCP1、Cidea 及粒線體生合作用等相關基因NrF1、Tfam 都有顯著增加 (1.4-1.9 倍) (p<0.05 ~
p<0.005) 。白色脂肪相關基因表現 Retn 與 PPARγ 皆都顯著受到抑制 (p<0.005)
(圖 2-3 (B)) ，而 Chemerin 則無顯著差異 (p>0.05)。根據上述結果，分化方法一培養之脂肪細胞在棕色脂肪相關基因表現上，和 空白處理組相比，增加幅度都較分化方法二高。白色脂肪基因和轉錄活化因子 PPARγ 的基因表現，分化方法一也都稍高於分化法二。批次實驗結果也顯示，分 化方法一的重複性較高 (圖 2-4 (A) (B) (C)) 。整體而言，在分化成熟前 4 日開始，
根據上述結果，分化方法一培養之脂肪細胞在棕色脂肪相關基因表現上，和 空白處理組相比，增加幅度都較分化方法二高。白色脂肪基因和轉錄活化因子 PPARγ 的基因表現，分化方法一也都稍高於分化法二。批次實驗結果也顯示，分 化方法一的重複性較高 (圖 2-4 (A) (B) (C)) 。整體而言，在分化成熟前 4 日開始，