二維電泳

甲、實驗試劑耗材與儀器：

IPG buffer (Amersham, Sweden)

Immobiline Drystrip Reswelling Tray (Amersham, Sweden) pH 3-10,pH 4-7 strip (Amersham, Sweden)

Immobiline DryStrip Cover Fluid (Amersham, Sweden) Ettan IPG phor Ⅱ(Amersham, Sweden)

PROTEANⅡXL 2-D cell ( Bio-Rad , USA)

PROTEANⅡMulti-Gel Casting Chamber (Bio-Rad ,USA) LE Agarose (Seakem, USA)

Dithiothreitol, DTT (Amersham, Sweden) Iodoacetamide, IAA (Amersham, UK) Silver staining kit (Amersham, UK)

Q-TOF Ultima MALDI instrument (Micromass, Manchester, UK) 乙、實驗方法：

(1) 水合作用 (rehydration)

突變小鼠和正常小鼠肝臟及肌肉的粒線體蛋白質各取 240 μg 加 入 rehydration buffer (7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 1% DTT , 0.005% BPB) 及 IPG buffer (2% v/v) 混合後共 340μL，置於室溫反 應一小時後，將樣品注入凹狀平盤 (Immobiline DryStrip Reswelling Tray)，用 pH 3-10 及 pH 4-7 的 strip，膠面朝下平整的使之完全接觸

樣本體並排除可見的氣泡，並且再用 Immobiline DryStrip Cover Fluid 覆蓋，避免樣本液揮發及高濃度尿素析出，以進行水合步驟 20 小時。

(2) 等電點聚焦 ( Isoelectric Focusing, IEF )

水合作用後，依等電點的不同於 Ettan IPG phor Ⅱ跑第一維電泳。

將水合作用完的 strip 用二次水將其上面的 Immobiline DryStrip Cover Fluid 沖洗掉，膠面朝上放置在乾淨的陶瓷板上，將沾些許二次水的墊 片放置於 strip 的兩端，蓋上電極板，在 strip 上面及兩端的陶瓷板加滿 Immobiline DryStrip Cover Fluid，即可於室溫 20 ℃下進行 IEF。其機器 設定程式如下：

0-300V 1 分鐘 300V 3 小時 300-1500V 4 小時 1500V 4 小時

1500-4000V 3 小時 4000V 2 小時 4000-8000V 2 小時

8000V 16 kV:Hr 最後共跑 54.75 kV:Hr

(3) 鑄膠

將玻璃片及 1 mm spacer 用拭鏡紙及酒精擦拭乾淨，組裝完成即可 配置鑄膠的溶液，溶液配方如試劑配方 (3)，配完後先將 16%的溶液倒 入離出口管遠的容器，將中間的閥打開，使溶液充滿中間的孔後關起，

之後再將 10% 的溶液倒入離出口管近的容器，倒入前需確定出口管是 關閉的，倒完 10% 的溶液之後打開出口管使溶液充滿管子，在裝 10%

溶液的容器中放入攪拌子，轉的速度不可太快，隨著液面和攪拌子越接 近，則將速度調慢。通常 10% 溶液會比 16% 溶液多，當兩邊液面高度 一樣時再把中間的閥打開。另外出口管溶液的流速也不可太快，否則膠 體梯度不易形成。當膠體溶液鑄到一定高度時，停 3-5 分鐘，再用 500 μL iso-propanol 將膠體壓平，之後用保鮮膜封起避免異物進入，靜置隔 夜使膠體完全凝膠備用。

(4) 平衡 (equilibration)

IEF 進行完後取出 strip，將 strip 放於螺紋管平衡。每條 strip 平衡 步驟如下：

先加 SDS equilibration buffer ( 50 mM Tris-HCl , pH 8.8 , 6 M Urea , 30%

v/v Glycerol , 2% w/v SDS , 0.002% w/v BPB) 10 mL 及 0.1 g DTT 平衡 20 分鐘後，將此溶液倒掉，並用二次水沖洗一下。之後再加 SDS

equilibration buffer 10 mL 及 0.25 g iodoacetamide 平衡 20 分鐘，即可進 行第二維電泳。

(5) 膠體電泳 ( SDS-PAGE )

◎ 將 strip 放到膠台上所需的器具：

a. 鑷子 b. 剪刀

c. 0.75 mm spacer

d. 1x SDS running buffer e. 1% LMP agarose

strip 平衡完後，依分子量大小進行第二維 SDS 梯度電泳，膠片濃度為 10-16%。平衡後的 strip 先用 1x SDS running buffer 浸濕，再用拭鏡紙將 strip 上的氣泡吸掉，將 strip 兩端的塑膠片剪掉，取 500μL 的 1% LMP agarose 注入膠片上緣，將 strip 放入使塑膠面貼住玻璃，再加入 50μL 的 1x SDS running buffer，用 0.75 mm spacer 將 strip 往下輕推，排除氣泡的 產生。將膠片裝至電泳槽倒入 400 mL 的 1x SDS running buffer，在 15 ℃ 下先以 12 mA 跑 30 分鐘後，再調至 24 mA 跑 5 小時。電泳完畢後以

Coomassie Blue R-250 進行膠片染色 1 小時，再以退染液退染，之後將突 變小鼠和正常小鼠兩片膠體作比對，尋找差異的蛋白質點。

(6) 膠內酵素消化 ( In-gel digestion )

將比對差異的蛋白質點用 yellow tip 挖取下來放於 1.5 mL 微量離 心管中，加入 100μL 的 50 mM Dithioerythreitol ( DTE ) / 25 mM ammonium bicarbonate ( pH 8.5)，放於 37 ℃反應 1 小時，10,000 xg 離 心 1 分鐘，將 DTE 溶液完全移除。再加入 100μL 的 100 mM Iodoacetamide ( IAA) / 25 mM ammonium bicarbonate ( pH 8.5)，放於室溫 暗處反應一小時，10,000 xg 離心 1 分鐘，將 IAA 溶液完全移除。加入 100μL 的 50% acetonitrile / 25 mM ammonium bicarbonate ( pH 8.5) 反 應 15 分鐘，10,000 xg 離心 1 分鐘，將溶液完全移除。加入 100μL 的 100% acetonitrile 反應 5 分鐘，10,000 xg 離心 1 分鐘，將 acetonitrile 完 全移除。將膠片真空乾燥 5 分鐘，再用 0.1μg trypsin / 10μL 25 mM ammonium bicarbonate ( pH 8.5) 將膠片做再水合作用，用乾淨的 PP 微 離心管杵將膠片磨碎，放於 37 ℃反應至少 16 小時。加入 50μL 的 50%

acetonitrile / 5% TFA 至每個微量離心管，用超音波震盪 10 秒，停止 10 秒，重複 10 次。10,000 xg 離心 1 分鐘，將上清液移至另一個標示好的 650μL 微量離心管中，再一次加入 50μL 的 50% acetonitrile / 5% TFA

至含有膠片的微量離心管，用超音波震盪 10 秒，停止 10 秒，重複 10 次。10,000 xg 離心 1 分鐘，將上清液再次取至標示好的 650μL 微量離 心管中，再用真空乾燥至樣品剩 1-2μL 即可。

(7) 質譜儀分析

將膠內酵素消化處理完的樣品送至中研院生化所蛋白質體及結構 生物學研究及核心設施作分析，這些蛋白質點以 Q-TOF Ultima MALDI instrument 或是 4700 Proteomics Analyzer 進行蛋白質身份鑑定，分析出 來的 MALDI peptide mass fingerprinting (PMF) 及 CID MS/MS 結果再 用 Mascot、SwissProt 或 NCBI 資料庫比對分析，確認蛋白質的身份。

(8) 銀染

利用商業試劑作銀染。每片膠加入 fixing solution 250 mL，置於 shaker 搖 30 分鐘，將溶液倒掉，用 dd H2O 250 mL 洗 5 分鐘，重複 3 次。加入 sensitizing solution 250 mL，置於 shaker 搖 30 分鐘，將溶液倒 掉，用 dd H2O 250 mL 洗 5 分鐘，重複 3 次。加入 silver solution 250 mL，

置於 shaker 搖 20 分鐘，將溶液倒掉，用 dd H2O 250 mL 洗 5 分鐘，重 複 2 次。加入 developing solution 250 mL，置於 shaker 搖 5 分鐘，將溶 液倒掉，再加入 stopping solution 250 mL，置於 shaker 搖 10 分鐘，將

溶液倒掉，用 dd H₂O 250 mL 洗 5 分鐘，重複 3 次。再加入 preserving solution 置於 shaker 搖 20 分鐘即完成。

丙、試劑配方：

(1) Rehydration buffer (先將 7 M urea, 2 M thiourea, 4% W/V CHAPS, 1%

W/V DTT 混合，BPB 則配置 1% stock，每次使用時再加)

(2) SDS equilibration buffer

Tris-HCl 緩衝液 (1.5 M, pH 8.8) 16.7 mL

Urea (FW= 60.06) 180.2 g

Glycerol (87% v/v) 172.4 mL

10% APS 0.3 0.3 dd H₂O 58.5 37.1 Glycerol 86% 0 11.5

(4) 1% LMP agarose

Agarose 0.1 g

SDS running buffer 100 mL

BPB 200 μl

(5) 50 mM Dithioerythreitol (DTE) / 25 mM ammonium bicarbonate (pH 8.5)

Dithioerythreitol (DTE) 7.7 mg 25 mM ammonium bicarbonate ( pH 8.5) 1000μl

(6) 100 mM Iodoacetamide (IAA) / 25 mM ammonium bicarbonate (pH 8.5) Iodoacetamide (IAA) 18.2 mg

ddH2O 加水至 250 mL

(9) Silver solution

Silver nitrate solution (2.5% w/v) 25 mL Formaldehyde (37% w/v) 0.1 mL ddH2O 加水至 250 mL

(10) Developing solution

Sodium carbonate 6.25 g Formaldehyde (37% w/v) 0.05 mL ddH₂O 加水至 250 mL

(11) Stopping solution

EDTA-Na2.2H2O 3.65 g ddH₂O 加水至 250 mL

(12) Preserving solution

Ethanol 75 mL Glycerol (87% w/w) 11.5 mL ddH2O 加水至 250 mL