1. 人類血癌細胞株(HL-60)的培養
取人類血癌細胞株(HL-60)，密度 2~5×105cells/mL，置於 75 cm2培養皿，加 入 10 mL RPMI-1640 培養基〔內含 10%胎牛血清及 1% penicillin-streptomycin (10,000 U/ml penicillin 和 10 mg/mL streptomycin)〕，培養於 37℃, 5% CO2的培養 箱中，視細胞的密度，培養基必須一至兩天更換一次，如此才可維持 HL-60 細 染料使用藍色 trypan blue，如果細胞不容易吸收 trypan blue，則可使用藍伊紅 eosin bluish。
3. 廣東山葡萄抽取物對人類血癌細胞株(Human leukemia cell line; HL-60) 酸結合。PI 染色完成的細胞，經由流式細胞儀(flow cytometry) 488 mm 的雷射光 激發後，死亡的細胞會有較高的紅色螢光，而存活的細胞則紅色的螢光較弱，接 著再以 Cell Quest 軟體分析細胞的存活率。細胞的存活以下公式計算：（實驗組 存活細胞數 ÷ 對照組存活細胞數）× 100%。
取 1×105 HL-60 cells 置於 6 孔培養皿(6 well plate)，於 37℃, 5% CO2 培養箱 中培養 24 小時後，分別加入不同濃度 Ac 粗抽物(25、50、75、150、300 mg/mL，
每 mL 的培養基中加入 10 µL)及各不同分層抽取物(3.125、6.25、12.5、25、50 mg/mL，每 mL 的培養基中加入 10 µL)，對照組加入溶媒。24 小時後收集細胞，
4、廣東山葡萄抽取物對人類血癌細胞株(Human leukemia cell line; HL-60) DNA 上之影響 (DNA damage)
a. DNA 的萃取
取 1×105 HL-60 cells 放入 6 孔培養皿(6 well plate)，置於 37℃, 5% CO2 培
養箱中培養 24 小時後，分別加入不同濃度的 Ac 粗抽物(25、50、75、150 300 mg/mL，每 mL 的培養基中加入 10 µL)及各不同分層抽取物(3.125、6.25、12.5、
25、50 mg/mL，每 mL 的培養基中加入 10 µL)，對照組加入溶媒。24 小時後以 無菌吸管吸至無菌試管中(15 mL test tube)，離心(4℃、1000xg、4 分鐘)，棄上 清液，加入 1.85 mL Cell suspension solution，以手指輕輕拍試管管壁使其均勻混 合(不可使用振盪器)，加入 50 µL RNase Mixx，混合均勻，加入 100 µL Cell Lysis/Denaturing Solution，混合均勻後置於 water bath (55℃)中 15 分鐘，然後加 入 25 µL Protease Mixx 混合均勻後置於 water bath (55℃)中 60~90 分鐘，再加入 500 µL “Salt-Out” Mixture，此時以微量吸管吸至 2 mL 小離心試管內，置於冰箱 中 10 分鐘，離心（4℃、10000xg、10 分鐘），收集上清液，加 2 mL TE buffer (0.1mL,
Agarose 900 mg，加入 50 mL, 1×TAE buffer (Tris-acetate)，於微波爐中加熱 1 分鐘溶解，待稍冷卻後加入 4 µL Ethyl bromide 混合均勻，然後小心慢慢將膠 沿著電泳跑膠槽槽壁倒入電泳跑膠槽中(不可有氣泡產生)，放入 comb 蓋上槽 蓋，靜置約 30 分鐘待膠凝固(不可觸動)。膠凝固後拔去 comb (可見有一一之小 孔此處即為 sample 放置處)，此時即製成 1.8%凝膠片。
將膠片置於電泳槽內（Kodak BioMax QS710），以 1×TAE buffer 溶液覆蓋 過膠片。取 18 µL 萃取之 DNA sample 加入 2 µL loading buffer 置於 1.5 mL 之 vial 中混合均勻，接著依序將各不同濃度 sample 以微量吸管加入到凝膠片的 comb 內，蓋上電泳蓋，開啟電源供應器（E-C Apparatus Corporation, EC 3000-90)，
Voltage 調至 100，進行跑膠一小時。
實驗進行完成的膠片，置於電泳膠分析照相儀(Ever Gene Gel Analysis System)分析，以觀察藥物於 DNA 上的影響。
5. 廣東山葡萄抽取物對人類血癌細胞株(Human leukemia cell line; HL-60)細胞 凋亡(apoptosis)的影響
a. 利用螢光顯微鏡觀察細胞凋亡情形
取 1×105 HL-60 cells 置於 24 孔培養皿中(24 well plate)，於 37℃, 5% CO2
培養箱中培養 24 小時，分別加入不同濃度 Ac 粗抽物(25、50、75、150、300 mg/mL，每 mL 的培養基中加入 10 µL)及各不同分層抽取物(3.125、6.25、12.5、
25、50 mg/mL，每 mL 的培養基中加入 10 µL)，對照組加入溶媒。24 小時後將 細胞吸至 2 mL 的小離心試管中，離心(4℃、1000xg、4 分鐘)，棄上清液。加入 已滅菌 200 µL, 1×PBS，以手指輕拍試管管壁，使細胞均勻分散。此時將細胞吸 入到 96 孔培養皿中(96 well plate)，離心(4℃、1000xg、4 分鐘)，棄上清液，直 接加入 200 µL, 3.7%的 formaldehyde 置於冰上 15 分鐘。然後加入已滅菌 100 µL, 1×PBS，離心(4℃、1000xg、4 分鐘)，棄上清液，【上之步驟重複一次】。加入 100 µL, 0.2% NP，避光靜置 15 分鐘。再加入 100 µL, 1×PBS，離心(4℃、1000xg、
4 分鐘)，棄上清液，【上之步驟重複一次】。加入新鮮配製成之 5% 50 µL 脫脂鮮 乳，避光置於冰上 1 小時後加入 100 µL, 1×PBS，離心(4℃、1000xg、4 分鐘)，
棄上清液，【上之步驟重複一次】。加入一次抗體 Poly（ADP-ribose）50 µL【抗 體原液以 5%鮮乳稀釋 100 倍（即取 10 µL 抗體 + 990 µL 5%之鮮乳）】，以錫箔 紙包好避光儲存於冰箱中隔夜。
第二天，取出 96 孔培養皿 (96 well plate)，直接加入 100 µL, 1×PBS，離心 (4℃、1000xg、4 分鐘)，棄上清液，【上之步驟重複一次】。加入二次抗體 50 µL
【抗體原液以 5%的鮮乳稀釋 100 倍（即取 10 µL 抗體 + 990 µL 5%之鮮乳）】
(Jackson 115-095-004 Goat Anti- mouse IgG FITC conjugates，此具螢光作用，因此
必須以錫箔紙包起避光儲存，以下步驟均需避光進行)。加入二次抗體後，於冰 上靜置 30 分鐘。然後直接加入 100 µL, 1×PBS，離心(4℃、1000xg、 4 分鐘)，
棄上清液，【上之步驟重複一次】。於螢光顯微鏡下觀察細胞凋亡之情形。
b. 利用流式細胞儀以 Cell Quest®的軟體來分析細胞凋亡的情形
取 1×105 HL-60 cells 置於 12 孔培養皿中(12 well plate)，於 37℃, 5% CO2培 養箱中培養 24 小時後，分別加入不同濃度的 Ac 粗抽物(25、50、75、150 300 mg/mL，每 mL 的培養基中加入 10 µL)及各不同分層抽取物(3.125、625、12.5、
25、50 mg/mL，每 mL 培養基中加入 10 µL)，對照組加入溶媒。24 小時後收集 細胞。
收集之細胞分別置於 15 mL 離心試管中離心(4℃、1000xg、5 分鐘)，棄上 清液，以手指輕拍試管管壁，使細胞均勻分散，加入 2 mL, 1×PBS 混合均勻後離 心(4℃、1000xg、5 分鐘)，棄上清液。以手指輕拍試管管壁，使細胞均勻分散。
然後將試管置於振盪器上(VORTEX-GENIE 2)，速度調至 3，一滴一滴慢慢的加 入冰冷(ice-cold, 4℃)的酒精(70%)以進行細胞固定。隨後將此試管置於-20℃冰箱 存放。隔天取出樣品，分別利用 (a). Cell Quest®軟體，進行細胞凋亡數據的分析；
以及(b). Modfit LT®軟體，進行細胞週期數據的分析。
a). 以 Cell Quest®軟體進行細胞凋亡數據分析
隔天取出樣品，離心(4℃、1000xg、5 分鐘)以去除酒精，加入 2 mL, 1×PBS 清洗細胞後，離心(4℃、1500 rpm、5 分鐘)，棄上清液，【上之步驟重複兩次】。
於每個試管中加入 500 µL Propidium iodine (PI)染色，避光反應 30 分鐘。取 1 mL 樣品，移至 FACS 專用試管，避光置於冰上，然後以流式細胞儀(Flow cytometry;
FACS)進行樣品分析。一秒細胞不超過 300 個，每一數據收集 12000 個細胞，數 據以 Cell Quest®軟體進行數據分析。
b). 以 Modfit LT®軟體進行細胞週期上數據的分析
隔天取出樣品，離心(4℃、1000xg、5 分鐘)以去除酒精。加入 2 mL, 1×PBS 清洗細胞後，離心（4℃、1000xg、5 分鐘），棄上清液，【上之步驟重複兩次】。
於每個試管中加入 500 µL Propidium iodine (PI)染色，避光反應 30 分鐘。取 1 mL 樣品，移至 FACS 專用試管，避光置於冰上，然後以流式細胞儀(Flow cytometry;
FACS)進行樣品分析。一秒細胞不超過 300 個，每一數據收集 12000 個細胞，數 據以 Modfit LT®軟體進行數據分析。
6. 廣東山葡萄抽取物對人類血癌細胞株(Human leukemia cell line; HL-60)細胞 內週期素(cyclins)的影響
取 1×105 HL-60 cells 置於 12 孔培養皿中(12 well plate)，於 37℃, 5% CO2培 養箱中培養 24 小時，然後分別加入 Ac 粗抽物(100 mg/mL, 每 mL 培養基中加入 10µL)及各不同分層抽取物(25 mg/mL，每 mL 培養基中加入 10µL)，對照組加入 溶媒。培養 24 小時，收集細胞至無菌的試管中，離心(4℃、1000xg、5 分鐘)，
棄上清液。細胞以 1×PBS 清洗一次後離心(4℃、1000xg、5 分鐘)，棄上清液。
以手指輕拍試管管壁，使細胞均勻分散後， 加入冰冷(ice-cold, 4 ℃) 100µL, 1×PBS，使細胞混合均勻。再將細胞轉移至 96 孔培養皿中(96 well plate)，離心(4
℃、1000xg、5 分鐘 )，小心棄上清液。加入冰 冷(ice-cold, 4℃) 100µL, 1%
formaldehyde 於冰 上 靜置 5 分鐘，再加入冰冷(ice-cold, 4℃) 100µL, 100%
methanol 置於冰上 30 分鐘（避光），離心(4℃、1000xg、5 分鐘)，棄上清液（以 去除 formaldehyde 以及 methanol）。以含有 0.1% BSA 之 PBS 清洗細胞後離心(4
℃、1000xg、5 分鐘)，棄上清液，【上之步驟重複兩次】。加入 100µL 含 0.1% Triton X-100 及 0.1% Sodium citrate 的 PBS 置於冰上反應 45 分鐘，離心(4℃、1000xg、
5 分鐘)，棄上清液。再以含有 0.1 % BSA 之 PBS 清洗細胞後，離心(4℃、1000xg、
5 分鐘)，棄上清液，【上之步驟重複兩次】。加入 100µL anti-cyclins 及 anti-CDK 單株抗體，並於室溫下反應 2.5 小時，離心（4℃、1000xg、5 分鐘），棄上清液。
並以含有 0.1% BSA 之 PBS 清洗後離心(4℃、1000xg、5 分鐘)，棄上清液，【上 之步驟重複兩次】。加入 100µL 二次抗體(FITC-conjugated goat anti- mouse IgG antibody)，於冰上避光反應 30 分鐘，離心（4℃、1000xg、5 分鐘），棄上清液。
加入 100µL, 0.1% BSA 之 PBS 清洗細胞，離心(4℃、1000xg、5 分鐘)，棄上清 mg/mL，每 mL 的培養基中加入 10 µL)及水層分離物(3.125、6.25、12.5、25、50 mg/mL，每 mL 的培養基中加入 10 µL)，對照組加入溶媒。培養 24 小時，收集 細胞。
以無菌吸管將細胞吸至 15 mL 的無菌試管中，離心(4℃、1000xg、5 分鐘)，
以吸管小心的吸出上清液。再以 1×PBS 清洗細胞，離心(4℃、1000xg、5 分鐘)，
棄上清液，【上之步驟重複一次】。最後以吸管小心吸出上清液（盡量吸乾，但不
離心機轉速到 10000xg 後 15 秒鐘，隨即關機），棄下層液，加入 700 µL Buffer RW1，離心(10000xg、15 秒)，棄下層液。此時將 column 移至一個新的 2 mL 的 收集管中(collection tube)，直接加入 500 µL Buffer RPE，離心(10000xg、15 秒)，
棄下層液，再加入 500 µL Buffer RPE 離心(10000xg、2 分鐘)，丟掉下面的收集 管(collection tube)，將上之 column 再移至一個新的 1.5 mL 的收集管中(collection tube)，加入 30 µL RNase-free water（由上方正中央加入），離心(10000xg、1 分 鐘)，此時下層即為我們所要的 RNA。此時於 260nm 下測 OD 值（OD 值=1 時， OUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor (40 units/µL)混合均勻後於 42℃培育 2 分鐘。加入 1 µL (200 units) SUPERSCRIPTT MII RT，以微量吸管混合均勻，於 42
℃培育 50 分鐘，然後再於 70℃培育 15 分鐘。此時所培育出來之即為 cDNA，
置於冰箱(4℃)。
c. PCR reaction
首先將下列的 PCR 反應試劑加入已滅菌之 PCR 反應試管(PCR reaction tube) 中，使最後之總量為 50 µL.
(a). 5 µL 10×PCR buffer〔(200 mM Tris-HCl (pH8.4), 500 mM KCl〕.
(b). 1.5 µL mM MgCl2. (c). 1 µL 10 mM dNTP Mix.
(d). 1 µL amplification primer 1 (10 µM).
(e). 1 µL amplification primer 2 (10 µM).
(f). 0.4 µL Taq DNA polymerase (5 U/µl) (g). 2 µL cDNA (from first-stand reaction).
(h). 38.1 µL 滅菌的蒸餾水
混合均勻後於液面上加入 1~2 滴的 siliconce oil 蓋附於表面（避免加溫時產 生突沸的現象）。於 90℃加熱反應 2 分鐘，接著執行 PCR 15~40 cycles 的反應 (PERKIN ELMER Gene Amp PCR System 2400).
Sample 依上述電泳跑膠法，將膠片置於電泳膠分析照相儀(Ever Gene Gel Analysis System)觀察廣東山葡萄抽取物對於人類血癌細胞株(HL-60)相關細胞週 期素基因表現的影響；另以 Kodak Digital Science 120 來分析數據。
Primers 的序列如下: B-MDIEA-NAT1, 5’-CACCCGGATCCGGGATCAGGA- CATTGAAGC-3’, NT 435-454, gENbANK accession number X17059;
VPKHGD-X-NAT1, 5’GGTCCTCGAGTCAATCAATCACCATGTTT- GGGCA-3’, nt 1295-1278, GenBank accession number X17059; FP1-NAT2, 5’-GTAGTT- CCTGGTTGCTGGCC-3’, nt 79-98, GenBank accession number NM-000015;
RP1-NAT2, 5’TAACGTGAGGGTAGAGAGGA-3’, nt 1073-1054, GenBank accession number NM-000015; Act b1, 5’GCTCGTCGT- CGACAACGGCTC3’, nt 94-114, GenBank accession number NM-001101; Act b2, 5’
CAAACATGATCTGGGTCATCTTTCTC-3’, nt 446-442, GenBank accession number- 001101. Mmmmm.
8. 利 用 cDNA 基因晶片來鑑定廣東山葡萄抽取物對人類血癌細胞株
(Human leukemia cell line; HL-60)基因表現上的影響 a. 人類血癌細胞株(HL-60) RNA 的萃取(利用 RNeasy® Mini Kit)
取 1×105 HL-60 cells 放入 12 孔培養皿中(12 well plate)，於 37℃, 5% CO2
培養箱中培養 24 小時，然後加入 Ac 粗抽物(100 mg/mL, 10 µl/mL)，對照組加入 溶媒，培養 24 小時，收集細胞。RNA 抽取方法與上同〔7. 1)]。
b. 抽取出之 RNA 則交由生物科技公司進行基因晶片上的分析。