1. 高效液相層析儀(High Performance Liquid Chromatography)定量法 高效液相層析儀簡稱 HPLC，此乃利用靜態相的管柱，再通以不同的溶液為 移動相，然後藉由檢品在移動相中對於靜態相管柱的結合時間不同，致使各成分 通過層析管柱的時間也不同，進而將其分離。實驗前先利用已知濃度的標準品溶 液，計算出峰線面積，再求得檢品峰線面積，最後計算出檢體的含量。本實驗中 所使用的 HPLC 為 Waters 490E Detector 及 Pump PM-60，其靜態相使用 Beckman Silica-based 反轉相碳-18 (Reverse phase C-18, 4.6×250 mm, Spherisorb)的分析管 柱。
檢品中 Acetyl-aminofluorene (AAF)的測定是利用 53% 20 mM Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4, pH4.5)和 47% Acetonitrile 的混合液來當移動相，
檢波儀波長定於 280 nm。檢測出 AAF 出現的時間為 7.84 分鐘，AF 出現的時間 為 10.86 分鐘；另外，Acetyl-para-aminobenzoic acid (Ac-PABA)測定的條件是利 用 50 mM 86% Acetic acid 和 14% Acetonitrile 的混合液來當移動相，檢波儀波 長定於 266 nm。檢測出 Ac-PABA 出現的時間為 6.40 分鐘，PABA 出現的時間為 4.67 分鐘。
2. 廣 東 山 葡 萄 抽 取 物 對 於 大 鼠 組 織 乙 醯 轉 移 酵 素 N-acetyltransferase (NAT)活性影響的測定
a. 廣東山葡萄抽取物對於大鼠肝臟組織乙醯轉移酵素 N-acetyltransferase (NAT) 活性影響的測定
SD 系雄、雌性大鼠 200~250 公克經乙醚麻醉後取出肝臟，剪碎，以 1:5 的 比例加入 Working Lysing Buffer 〔pH 7.5, 20 mM Tris-HCl, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Ethylenediaminetetraacetate (EDTA), 50 mM Phenylmethylsulfonyl
分鐘）取上清液，此上清液稱為肝臟之胞質液(cytosols)。
Recycling mixture 簡稱 RCM ，其組成為 15 mM Acetyl carnitine, 2 units/mL carnitine acetyl-transferase, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 50 mM Tris-HCl, pH 調整為 7.5。
反應於 4℃冰上進行。取胞質液(cytosols) 50 µL，加入每毫升 RCM 中含有 20 µL 之受質 2-AF 或 PABA (22.5 mM)，及 10 µL Carnitine acetyl-transferase，然 後再加入【不同濃度 Ac 粗抽物 0.05、0.5、5、50、500 mg/mL，及各不同分層 抽取物 3.125、6.25、12.5、25、50 mg/mL，各 20 µL (控制組只給予生理食鹽水) 】， 及 20 µL, 10 mM Acetyl CoA 混合均勻，置於恆溫水槽 37℃反應 15 分鐘後，加 入終止溶液（ Stop solution） 〔若受質為 2-AF 則以 50 µL Acetonitrile 終止反應；
若受質為 PABA 則以 50 µL 20% Trichloroacetic acid (TCA) 終止反應〕；再於 8000xg 離心 2 分鐘，取上清液 20 µL 注於 HPLC 中，求其 2-AF（或 PABA）及 2-AAF（或 Ac-PABA）產物的比例。同時利用已知濃度的 2-AF 或 PABA 來換算 實驗的量。而 N-acetyltransferase (NAT)酵素活性(acetylated 2-AF 或 PABA)的單位 是以 n mole/min/mg protein 示之。
b. 廣東山葡萄抽取物對於大鼠肝臟組織乙醯轉移酵素 N-acetyltransferase (NAT) 動力學常數影響的測定
Ac 粗抽物(50 mg/mL)於不同濃度的受質 2-AF (22.5、45.0、67.5、90.0、112.5、
135.0 mM)中，對於大鼠肝臟組織中的 NAT 乙醯化受質量的影響。結果也以 n mole/min/mg protein 示之。方法中，除了廣東山葡萄的濃度固定，2-AF 的濃度 改變外，其餘步驟如上述(2.a)之方法。
c. 廣東山葡萄抽取物對於大鼠血液中乙醯轉移酵素 N-acetyltransferase (NAT)活 性影響的測定
SD 系雄、雌性大鼠 200~250 公克以乙醚麻醉由心臟採血，以 1:4 的比例加
入 Working Lysing Buffer，混合均勻後此稱血液之胞質液(cytosols)。其餘步驟如 上述(2.a)之方法。
d. 廣東山葡萄抽取物對於實驗大鼠體內 2-Aminofluorene 乙醯化和代謝的影響 S.D.雄性大鼠 180~200 公克，24 隻隨意分成三組：
(a). 控制組：只給 2-AF (1 mL；1mL = 60 mM, 10.866 mg/mL)。
(b). 給藥組：動物事先給予 Ac 粗抽物(250 mg/kg)及各不同分層抽取物(100 mg/kg)，24 小時後再給予 1 mL 2-AF。
(c). 給藥組：動物同時給予 2-AF 及 Ac 粗抽物及各不同分層抽取物。
之後，動物個別置於代謝籠中，自由飲食及取水。收集尿液，24 小時後，
動物麻醉，由心臟採血，犧牲動物，並分別取出動物部分的內臟器官進行分析。
(i). 尿液的分析：
尿液收集 24 小時後立即以 ethylacetate:methanol (95:5)萃取兩次，取上清液 冷凍乾燥後，殘餘物以 methanol 溶解，再經由 HPLC 來分析。
(ii). 大鼠組織器官的分析：
取出動物的內臟器官（肝及腎臟），剪碎，以 1:5 的比例加入 Working Lysing Buffer 〔 pH 7.5, 20 mM Tris-HCl, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Ethylenediaminetetraacetate (EDTA), 50 mM Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 10µM Leupetin〕，以組織均質機均質化。加入萃取液 ethylacetate:methanol (95:5) 混合均勻。如此萃取兩次，取上清液，冷凍乾燥後，殘餘物以 methanol 溶解，
再經由 HPLC 來分析。
(iii) 血液的分析：
收集之血液，以 1:4 的比例加入 Working Lysing Buffer，混合均勻後此稱血 液之胞質液(cytosols)。加入萃取液 ethylacetate:methanol (95:5)混合均勻。如此萃
取兩次，取上清液冷凍乾燥後，殘餘物以 methanol 溶解，再經由 HPLC 來分析。
e. 實驗結果統計分析
NAT 活性的測定中，以 HPLC 得知 2-AF 及 2-AAF （或 PABA 及 Ac-PABA）
產率，再求取給藥組對 2-AF 或 PABA 代謝產物的抑制或促進的比例而換算，進 而利用 Unpaired Student’s t-test 來分析組間的差異。