亞洲秋海棠生物地理學研究 - 亞洲產秋海棠屬植物分子親緣關係研究以及對其系統分類學與生物地理學的影響

前言

秋海棠的親緣地理學 (phylogeography) 的研究指出，非洲、美洲與亞洲大陸間秋海棠的親緣關係與其地理分布有明顯相關 (Forrest and Hollingsworth, 2003; Forrest et al., 2005; Goodall-Copestake et al., 2010)。針對南洋群島的秋海棠物種的研究顯示其具有由西向東的拓遷模式，並在拓遷過程中，可能因地理隔離而造成快速種化(Thomas et al., 2012)，此一結果分別與前述全球各大洲之間以及種內不同族群之間的研究相呼應。甚至單一物種內不同族群間，其親緣關係與其 地理分布也有明顯相關，如 Begonia sutherlandii J.D. Hooker (Hughes and

Hollingsworth, 2008)。

亞洲秋海棠的分布以熱帶及亞熱帶地區為主，從印度向東延伸，最東到所 羅門、斐濟和萬那杜等地，少數物種，如秋海棠 (B. grandis Dryand.) 此一落葉 性物種的分布可向北延展至中國河北省及北京等北緯約 45 度地區 (Shui et al., 2002; Tebbitt, 2005)。亞洲秋海棠分布中心有二：熱帶中心 (婆羅洲、菲律賓群島以及新幾內亞等地) 和大陸中心 (由喜瑪拉雅地區經橫斷山脈延伸至中南半島北部)。針對亞洲秋海棠屬植物起源的研究則顯示，亞洲秋海棠可能是從非洲通過印度次大陸抵達喜馬拉雅山區(Rajbhandary et al., 2011; Thomas et al., 2012)，並帶著具球莖以及落葉性的性狀拓遷至亞洲其他地區(Rajbhandary et al., 2011)。然而，同樣由於中國大陸物種的缺乏，導致結果不甚明確：喜瑪拉雅山脈的隆起對亞洲秋海棠多樣性有何影響？而亞洲大陸秋海棠的拓遷模式為何？是否也有明顯的方向性？其親緣距離與地理距離間是否也具明顯相關性？

本研究利用五個葉綠體 DNA 標記重建亞洲秋海棠屬植物親緣關係，並進行定年分析，同時以祖先地區重建分析嘗試回答上述問題。

材料與方法

取樣

本研究使用之材料主要來自中央研究院生物多樣性中心實驗溫室中栽培的秋海棠屬植物活體標本，亦有少部分為野外採集並以矽膠乾燥劑現場乾燥之材料。

共取樣 188 個分類群，其中亞洲分類群分別屬於下列 14 個不同的組(Section)：

扁果組(Platycentrum, 51 sp.), 秋海棠組(Diploclinium, 30 sp.), 等翅組

(Petermannia, 19 sp.), 側膜組(Coelocentrum, 18 sp.), 單座組(Reichenheimia, 13 sp.), 圓果組(Sphenanthera, 14 sp.), 尖籽秋海棠組(Baryandra, 10 sp.), 小花組 (Parvibegonia, 10 sp.), 棒果組(Leprosae, 2 sp.)、苞花秋海棠 Bracteibegonia (1 sp.), 二被秋海棠組 Haagea (1 sp.),單翅組 Monopteron (1 sp.), 二室單座組 Ridleyella (1 sp.)，合被秋海棠組 Symbegonia (1 sp.)以及五種未劃分組別的物種。分析中同時 包含 3 個美洲物種和 8 個非洲物種，並選取其中與亞洲秋海棠關係最遠的三個非洲物種充當外群。本次取樣的亞洲分類群地理區域涵蓋印度次大陸、喜馬拉雅地區(不丹及尼泊爾)，中國大陸(雲南、廣西、廣東、海南、四川、貴州及西藏等)，

台灣，中南半島(緬甸、泰國及越南)，馬來半島及南洋群島(蘇門答臘、爪哇、婆羅洲、菲律賓群島、蘇拉威西及新幾內亞等)。形態特徵除了區分組別時所使用之「重要」特徵外，同時也考慮了是否具有球莖，此性狀與生育環境有密切關聯，

具球莖者為落葉性，通常生長在季節變化顯著或具明顯乾季的環境，不具球莖者則為被視為常綠性，通常生長於終年潮濕，季節變化不明顯的環境。另外，是否生長於石灰岩地區也是取樣時考慮的因素之一。

DNA 萃取

參考前人研究方法(Doyle and Doyle, 1987; Kopperud and Einset, 1995)，以 CTAB 方法從液態氮下磨成粉末的植物組織分離出 genomic DNA。由於多數秋海

棠植株呈酸性，常導致 DNA 萃取不易，Kopperud and Einset（1995）利用稀釋之緩衝液清洗磨碎的材料，使 pH 值上升後，再加入 CTAB 萃取 DNA，以提高實驗成功率及產量。

DNA 標記選取、擴增與定序

本研究選取了五個葉綠體 DNA 分子標記進行 PCR 及定序，分別為 rpL16 intron, trnC-ycf6 spacer, ycf6-psbM spacer, psbM-trnD spacer, trnL-F (trnL intron + trnL-trnF spacer )，針對各標記進行聚合酶連鎖反應(PCR)時所使用之引子序列如表一。

PCR 均以 200 µL 微量離心管進行，包含 Taq DNA 聚合酶 Master Mix RED (Ampligon, Denmark) 12.5 µ L，選定的引子正反兩端各 1 µL (10µM)，模板 DNA 1-2 µL，最後加入蒸餾水 8.5-9.5 µ L，調整反應物總體積至 25 µ L。PCR 擴增過程中，

先增溫至 95 ℃ 5 min 使反應 DNA 變性，再進行下列循環 30 次：1. 95 ℃ 30 sec 使反應 DNA 變性；2. 53-60 ℃ 30 sec 促使引子黏合 (黏合溫度見表一)；3. 72 ℃ 60-90 sec 促使引子延長(反應時間是產物長度而定)，最後延長反應 72℃ 5 min。

PCR 產物以 PCR -Advanced Clean Up Kit (Viogene, Taiwan) 純化後，送往中央研物暨微生物研究所核酸分析核心實驗室進行定序，DNA 定序儀機型為 ABI 3730 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA)。

DNA 序列整理排序及資料矩陣建立

同一 PCR 產物定序後所得之兩端 DNA 序列(通常 2-3 條)，先以 SeqMan^TM II (DNASTAR, USA) 比對合併，經合併後序列以 MEGA5 (Tamura et al., 2011)進行多重 DNA 序列排序（multiple DNA sequence alignment），先利用 MEGA5 內建之 MUSCLE (Edgar, 2004) 進行自動排序，完成後以目視予以修正及適當調整，

形成可供進一步分析之資料矩陣(data matrix)。矩陣中遇有多重複 A/T (poly A/T) 序列、微衛星體 (microsatellite) 片段或難以判斷同源性(homology)的混淆位點

(ambiguous site) 均不納入分析。

重建親緣關係與分子定年

利用定序得到的五個葉綠體DNA分子標記(trnL-F, trnC-ycf6, ycf6-psbM, psbM-trnD, rpL16 intron)資料，以BEAST v. 1.7.1 (Drummond et al., 2012) 執行親緣關係重建分席，並同時進行分子定年 (molecular dating)，分析亞洲秋海棠演化的時間尺度。軟體計算是以 BI的Markov chain Monte Carlo (MCMC)為架構運算。

在設定分子時鐘模式上選擇” Relaxed Clock: Uncorrelated Log-normal”,此模式可使親緣樹上不同的支序在計算過程中有其不同的演化速率。由於秋海棠並無可靠的化石證據，因此參考前人(Rajbhandary et al., 2011; Thomas et al., 2012)的定年點進行分子定年分析，以crown group 分化年代為 24Ma. stdev 4.255 (95%=17-31 Ma) 計算。

先以BEAUti v.15.1(Drummond et al.) 編輯input file，其中“Clock Models”

參數則輸入由MrModeltest (Nylander, 2004)所計算出各個基因的最佳模式；”

Trees Priors”則選擇使用手冊中建議的”Speciation: Yule process”計算出親緣關係樹上每個 branch各自的起始演化速率，較接近於實際的種化過程。2次各10⁸ 個generations,每 1000 個generations取樣一次，並除去前面25%做為burn-in。兩次分析結果以 Tracer v 1.6(Rambaut et al., 2014) 評估是否接近於正常的曲線分佈，確定Effective Sample Size (ESS值)大於200)。最後產生的具有時間軸的親緣關係圖，將做為下一步祖先地區重建分析之用。

祖先地區重建分析(Ancestral Area Reconstruction Analysis)

在RASP (Yu et al., 2015)中以sDIVA(statistical dispersal–vicariance analysis) (Yu et al., 2010)分析法隨機選取1000個BEAST分析所得到的分子親緣關係樹重建亞洲秋海棠屬內各支序群的祖先區域，分布區域地理分布資料依據採樣標本 (附錄1)、GBIF (http://data.gbif.org/)及文獻(Golding and Wasshausen, 2002; Gu et al.,

2007; Hughes and Pullan, 2007)中紀載之分布地，按照物種和地區編碼，以重建過去的地理分布。依據秋海棠的分布，編碼共分為7區(圖4-2)，包括A: 非洲(包含 Socotra)，B: 美洲，C: 印度次大陸(包括斯里蘭卡)，D: 喜馬拉雅(包括印度東北部錫金、阿薩姆、阿爾納查爾等地)+橫斷山脈及雲南(東北部除外)+中南半島(包括緬甸)，E: 中國 (包括海南島，橫斷山脈及雲南除外)，F: 台灣即附近離島，

G: 南洋群島(包括馬來半島)，分析中分布區域限制在四個以下，而分析中物種 以B. longifolia分布於四個不同區域為最廣。

結果

DNA dataset 資料統計與分子演化模型

共取樣 177 個亞洲分類群的葉綠體 DNA 序列，經排序後的統計結果如表 2-2，trnL-F 得 1009 個位點，rpL16 intron 得 1272 位點，trnC-ycf6 得 1190 位點，

ycf6-psbM 得 1367 位點，psbM-trnD 得 1134 位點，加總長度共為 5972 個位點，

因排序不明確(ambiguity)而排除不予分析的位點共 1886 個，佔總位點數的 31.58%，包含在分析中的位點有 4086 個；利用 MrModeltest (Nylander, 2004)選取的演化模型為：rpL16: GTR+G；trnC-D: GTR+I+G；trnL-F: GTR+G。

親緣關係樹重建

以 BEAST v. 1.7.1 (Drummond et al., 2012)進行 10⁸個世代的分析，各支序群的後驗機率(posterior probability, PP)均顯示於分支上。結果如圖 4-1，與第二章以 MrBayes 重建之親緣關係樹(圖 2-1)相比，大架構基本相同，同樣以分布於 Socotra 的 Clade A 及分布於印度的 Clade B 為基群，其餘物種再分成為 Clade C 和 Clade D 兩大支序群，Clade D 由 COE Clade, BAR Clade, REI Clade, PET I Clade 和 PET II Clade 五個支序群組成。兩種分析中，同樣由 BAR Clade, REI Clade, PET I Clade 和 PET II Clade，加上 B. kingiana 和 B. bataiensis 組成的一個小支序群，以及 B.

peltatifolia 共同組成一個具有中等支持度的單系群，只是在 MrBayes 分析中，該 支序群的支持度為中等(PP:0.86/LB:73)，在 BEAST 分析中則具較高支持度 (PP:0.99)。兩種親緣關係分析裡 Clade C 中由常綠物種組成的單系群 PLA-SPH Clade 同樣深陷於由具球莖的落葉性物種組成的 DIP Grade 中，同時 DIP Grade 中也包括由小花秋海棠組物種組成的 PAR Clade。雖然大分支結構相同，但兩種 分析的結果仍有所差異，在 BEAST 分析中分布於喜馬拉雅地區的 B. dioica 與印 度物種形成的 Clade B 互為姊妹群並形成一個支持度低的支序群(PP:0.49)，使得 B. grandis 成為 Clade C 的最基群，在 MrBayes 的分析中，B.dioica 與包括 B. grandis 在內的其他 Clade C 物種互為姊妹群(PP:0.67/LB:63)，但不同分析中 B. dioica 與 其他物種組成的支序群的支持度都很低。B. boisiana 在 BEAST 的分析結果中是 時間推估結果如表4-1。其中亞洲秋海棠(Asia Clade)的冠年齡(Crown age)為14.66 (5.71-23.87 mya)，Clade C為13.60 mya (5.31-22.74 mya)，PLA-SPH Clade為6.62 mya (2.47-11.07 mya)，PAR Clade為11.21 (3.73-19.02) mya，Clade D為9.97 mya (3.41-16.42 mya)，COE Clade為6.47 mya (5.31-22.74 mya)，PET I Clade為5.48 (1.90-9.48)，PET II Clade為7.65 (2.20-10.94)，BAR Clade為5.73 (2.00-9.74)，REI Clade為4.64 (1.54-8.02)，TAI-1 Clade為0.57 mya (0.05-1.26 mya)，TAI-2 Clade為 0.64 mya (0.10-1.22 mya)。

祖先區域重建分析

利用 BEAST 重建支親緣關係樹進行祖先區域重建分析的結果如圖 4-3，關鍵支序群的祖先區域如表 4-1。結果顯示地理分布區域與與親緣關係有明顯關聯。

亞洲大陸物種(Asia Clade)的祖先區域推估最有可能為 D(喜馬拉雅+橫斷山脈及雲南+中南半島)，Clade C 和 Clade D 都是在 D 區域內分化而來。而幾個主要的傳播事件都是以 D 區域為中心向為傳播：1. 由 D 區到 G 區(南洋群島)主要發生兩次，分別在 G1 Clade 和 G2 Clade；2. 由 D 區到 E 區(中國)主要同樣有兩次事件，分別發生在 E1 Clade 和 E2 Clade；3. 由 D 區到 F 區(台灣)兩次(TAI1 Clade, TAI2 Clade 以及)；4. 由 D 區到 DE 區(Clade COE)；5. 由 D 區到 DG 區(PAR Clade)。

討論

分子定年的結果中，PLA-SPH支序群起源自約在6.62 mya 左右，亦即 Miocene末期西藏板塊隆起時，而西藏板塊的隆起對於喜馬拉雅地區及中國東南部的氣候有著顯著影響，由印度洋帶來的水氣被隆起的喜馬拉雅山脈及橫斷山脈攔阻，造成該地區的雨量增加，以至於當地植被發育日益良好，並形成如今極高的生物多樣性，推測PLA-SPH支序群中的物種由落葉性具球莖的祖先演化成常綠根莖性的現象，以及其極高的物種多樣性皆與當地氣候改變有著密切關聯，同樣的現象也在蕨類植物中出現(Wang et al., 2012)。

分布於廣西與北越喀斯特石灰岩地區的COE Clade的起源時間與前者相約 (6.47 mya)，此時當地正從海底隆升，並且在過去六百萬年裡逐漸風化，形成獨特的石灰岩地貌。祖先地區重建分析的結果顯示中南半島遷移可能是大部分現生亞洲秋海棠的起源地，COE支序群可能也是由中南半島遷徙至當地。

由於亞洲大陸各區域間沒有明顯的分界，使鄰近區域之間單一物種的小規模傳播事件非常頻繁。但由主要的幾次傳播事件中可以看出，亞洲大陸秋海棠的祖

在文檔中亞洲產秋海棠屬植物分子親緣關係研究以及對其系統分類學與生物地理學的影響 (頁 48-61)